本发明涉及苯丙氨酸和17-羟孕酮检测的技术领域，特别涉及一种高通量液相色谱串联质谱法同时检测新生儿滤纸干血片中苯丙氨酸和17-羟孕酮的成品试剂盒。
背景技术：
苯丙酮尿症(Phenylketonuria，PKU)是一种由于人体正常染色体缺陷造成新生儿体内苯丙氨酸代谢紊乱性疾病。其发病机理是新生儿体内缺乏苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)，此酶可以将蛋白质中的苯丙氨酸水解为酪氨酸，便于人体吸收和利用。由于酪氨酸的形成途径被阻断，血液中的苯丙氨酸不能被水解，因此，苯丙氨酸在血、脑脊液、各种组织和尿液中的浓度极度增高，同时产生了大量苯丙酮酸、苯乙酸、苯乳酸和对羟基苯乙酸等旁路代谢产物并自尿中排出，这些代谢产物经汗及尿排出，使汗、尿带鼠尿或马粪气味。
先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia，CAH)是一组常染色体隐性遗传、内分泌代谢失调病，分别由21-羟化酶、11b羟化酶、3b类固醇脱氢酶、17a羟化酶等缺陷所造成的，其中21-羟化酶缺乏症是CAH中最为多见的一种(90％～95％)，其共同特点是皮质醇合成障碍，引起促肾上腺皮质激素(ACTH)分泌增加导致肾上腺增生，出现脱水、失盐、外生殖器性别不清、生长加速、皮肤黏膜色素沉着、不同程度的男性化等各种不同临床表现。但可通过检测新生儿17-OHP浓度水平筛查出大部分CAH患儿，并经过及时及早的治疗，病情可以得到有效的控制。17-羟孕酮(17-hydoxy progesterone，17-OHP)是一种内源性孕激素，由肾上腺皮质及性腺产生，是最常用的筛查CAH的敏感指标。苯丙酮尿症、CAH和呆小症已经成为新生儿必筛项目。
苯丙氨酸和17-羟孕酮均属于小分子代谢物，目前检测新生儿采血滤纸片上的苯丙氨酸市售试剂盒主要以荧光分析法为主，该法利用苯丙氨酸与茚三酮和二肽反应生成荧光物质进行定量检测，主要存在灵敏度低、特异性差、荧光物质半衰期短、容易被污染、假阳性高等问题；检测新生儿采血滤纸片上的17-羟孕酮市售试剂盒主要以时间分辨免疫荧光法为主，该法利用抗原抗体“竞争法”检测17-羟孕酮的含量，存在免疫“竞争法”不可避免的问题：特异性低，不同抗原或者抗体的对检测结果影响很大，不同厂家的试剂测值差异大，准确性低等。而且，目前所有市售试剂盒一次实验只能检测单一指标，不能实现一次实验同时检测苯丙氨酸和17-羟孕酮两个标志物，不仅工作效率低，也加大了采血量的要求。
因此，本技术领域迫切需要解决这样一个问题：如何能够提供一种简单方便的、高通量的、准确性高的、重复性好的，用于同时检测新生儿采血滤纸片上的苯丙氨酸和17-羟孕酮的试剂盒。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种适用于同时检测新生儿采血滤纸片上的苯丙氨酸和17-羟孕酮的高通量、高准确性、高重复性试剂盒，操作简单，能够大大提高工作效率，降低对采血量的要求。
为了解决上述问题，本发明公开了一种高通量液相色谱串联质谱法同时检测新生儿采血滤纸片上的苯丙氨酸和17-羟孕酮的成品试剂盒，包括：
一、试剂盒组成成分及配制
1、校准品：在抗凝的正常人全血中同时加入适量的苯丙氨酸和17-羟孕酮原料，配制成包括6个浓度剂量点的校准品，滴制成滤纸干血片。优选的6个浓度剂量点校准品按照(苯丙氨酸：0.5mg/dL、1.0mg/dL、2.0mg/dL、4.0mg/dL、8.0mg/dL、16.0mg/dL，17-羟孕酮：0nmol/L、15nmol/L、30nmol/L、60nmol/L、120nmol/L、240nmol/L)设置，并且可溯源至4th ISNS-RPNS。
2、质控品：在抗凝的正常人全血中同时加入适量的苯丙氨酸和17-羟孕酮原料，配制成包括高、低2个浓度的质控品，滴制成滤纸干血片。优选的2个浓度的质控品按照(苯丙氨酸：1.5mg/dL、6.0mg/dL，17-羟孕酮：20nmol/L、90nmol/L)设置。
3、内标准品：使用50％～90％甲醇作为稀释液，优选80％甲醇，同时将13C6苯丙氨酸和D817-羟孕酮稀释至终浓度为300ng/mL～400ng/mL，优选350ng/mL。
4、萃取液：由80％甲醇与草酸配制而成，草酸的含量为1nM％～4nM，优选3nM。
5、流动相A：由甲酸与纯化水配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％，优选0.1％。
6、流动相B：由甲酸与纯甲醇配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％，优选0.1％。
7、96孔微孔板：使用耐腐蚀的聚丙乙烯材料的96孔微孔板；优选U型底，无包被的96孔微孔板作为萃取反应板，V型底，无包被的96孔微孔板作为进样板。
8、封片：用于实验过程尽量减少有机溶剂的挥发。
9、操作说明书。
10、分隔并集中包装上述1～9的包装盒。
二、试剂盒应用方法
本发明试剂盒的使用方法包括如下步骤：
1、内标工作液的配制：使用萃取液按照适合的比例稀释内标准品，配制成内标工作液，优选的稀释比例为内标准品∶萃取液＝1∶99。
2、孵育：轧下小血片(每片直径3mm左右)移入96孔微孔板(U型底，无包被)孔中，然后各孔适量的内标工作液，优选100μL/孔。盖上封片，在合适的条件下孵育，优选37℃振动孵育45分钟。
3、移液：从每个板孔中将适量萃取后的溶液转移到96孔微孔板(V型底，无包被)孔内，优选75μL/孔。
4、色谱条件准备(设置)：优选的，Poroshell 120EC-C18(4.6*50mm)色谱柱，0.6mL/min(0.0～1.5min：A流动相：45％；1.5～2.5min：A流动相：45％→10％；2.5～4.0min：A流动相：10％；4.0～4.01min：A流动相：10％→45％；4.01～5.0min：A流动相：45％)，35℃柱温。
5、质谱条件准备(设置)：优选的，ESI正离子MRM扫描模式，Q1/Q3离子通道分别选择为苯丙氨酸：166.1→120.1amu，苯丙氨酸内标：172.2→126.1amu；17-羟孕酮：331.2→109.2amu；17-羟孕酮内标：339.1→117.2amu。
6、上机检测：将适量萃取后液体进入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测分析，优选20μL，并记录色谱图与检测样品中苯丙氨酸和17-羟孕酮的峰面积与内标峰面积。
7、结果分析：以6个校准品的标示浓度为横坐标(x)，实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线和计算曲线回归方程，将样本中的实际检测峰面积与内标峰面积的比值代入标准曲线回归方程，即可计算出样品中苯丙氨酸和17-羟孕酮的浓度。
本发明具有以下特点：
1.本试剂盒是利用液相色谱串联质谱技术，可在干血片上同时检测新生儿苯丙酮尿症和先天性肾上腺皮质增生症，不仅可以降低采血需求，还可以快速有效地提高新生儿遗传代谢病的筛查通量。
2.本试剂盒所检测的样本为干血片，干血片不仅具有实验操作简便，还具备运输、保存方便的特点，可以大大减少疾病检测的管理成本，从而提升临床检测工作效率；
3.本试剂盒使用的检测方法为液相质谱串联质谱法，根据分析物固有的理化性质质荷比(m/z)进行直接检测样本中的苯丙氨酸和17-羟孕酮，不仅能够消除荧光法或免疫分析法等传统间接检测方法造成的灵敏度低、特异性差、准确性低，而且该方法能使其检测结果具有不同平台间的可比性。
附图说明
图1.实验操作步骤。
具体实施方式
本发明为一种滤纸干血片中同时检测苯丙酮尿症(PKU)和先天性肾上腺皮质增生症(CAH)的串联质谱试剂盒，提供了一种简单方便的、高通量的、准确性高的、重复性好的，用于同时检测新生儿采血滤纸片上的苯丙氨酸和17-羟孕酮的临床检测盒。为了使本发明实施的上述目的、特征和有点能够更加清晰易懂，具体包括试剂盒组成成分和操作方法。
实施例1：试剂盒组成及其成分
实施例2：试剂盒的操作方法(示意图如图1)
1、内标工作液的配制：按内标准品∶萃取液＝1∶99把内标准品稀释100倍，配制成内标工作液(1.0mL内标准品+99mL萃取液)；
2、孵育：用打孔器在滤纸干血片(校准品、质控品和待测样品)上轧下小血片(每片直径3mm左右)，按顺序把扎下的血片移入96孔微孔板(U型底，无包被)孔中，然后各孔加入100μL内标工作液，盖上封片，37℃振动孵育45分钟。
3、移液：从每个板孔中将75μL萃取后的溶液转移到96孔微孔板(V型底，无包被)孔内。
4、上机检测：选取萃取后液体各20μL进入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测分析，并记录色谱图与检测样品中苯丙氨酸和17-羟孕酮的峰面积与内标峰面积。
(1)色谱条件：
a)色谱柱：Poroshell 120EC-C18(4.6*50mm)或相当者；
b)流动相：A流动相，B流动相；
c)流速：0.6mL/min；
d)梯度洗脱条件：
e)柱温：35℃；
f)进样量：20μL。
(2)质谱条件：
a)离子源
b)扫描模式
5、检测结果的计算：
(1)标准曲线的绘制方法：以6个校准品的标示浓度(苯丙氨酸：0.5mg/dL、1.0mg/dL、2.0mg/dL、4.0mg/dL、8.0mg/dL、16.0mg/dL；17-羟孕酮：0nmol/L、15nmol/L、30nmol/L、60nmol/L、120nmol/L、240nmol/L)为横坐标(x)，以6个校准品的实际检测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。
(2)标准曲线方程的拟合：以6个校准品的峰面积比值(y)对标示浓度(x)进行线性回归。可获得回归方程：y＝a+bx，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为截距，b为斜率，并计算相关系数(r)，要求r不小于0.9900。
(3)血清样品结果的计算：将血清样品中叶酸的实际检测峰面积与内标峰面积的比值代入标准曲线方程，计算样品中苯丙氨酸和17-羟孕酮的浓度。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的人和附图标记视为限制所涉及的权利要求。