本发明属于药物研发评估技术领域，具体地，涉及一种药代动力学早期成药性评估方法。
背景技术：
创新药物研发是一个周期长、耗资大、风险高、淘汰率高的领域。近年有统计显示，在新药研发过程中，因药代动力学性质不理想引起新化学实体(NCEs)的成药性失败率高达40％。药代动力学涉及药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄等过程，新化学实体药代动力学特性的早期成药性评估具有关键作用。
药物吸收转运特性研究的技术主要包括体外法、在体法和体内法，其中体外法由于不需要大批的实验动物，耗资少，试验周期短，操作简单等优点而广泛用于新化合物早期筛选。体外法中的Caco-2细胞系和MDR1-MDCKII细胞系，在特定培养条件下可自发形成具有细胞极性和紧密连接性的细胞单层，并分泌表达各种载体，是目前应用较为广泛的药物体外口服吸收筛选模型。
目前有许多药物吸收体外筛选模型，但没有一个体外模型能够完全模拟生物体内的复杂环境，因此，体内法仍然具有不可替代的地位，对于新化合物进一步的研究和开发，进行体内生物利用度研究具有重要的作用。
新药的血浆蛋白结合特性研究对其进一步研发及合理应用具有重要的意义。该部分最常用的研究方法为超滤法和平衡透析法，相对于平衡透析法，超滤法具有设备简单、耗时短、血浆样品用量少等优点。细胞色素P450混合功能氧化酶系统(cytochrome P450CYPs)是肝脏中最重要的代谢酶，当一种药物引起CYPs的诱导或抑制时，就可能影响同服药物在生物体内的的处置情况，因而研究药物对药物代谢酶活性的影响具有重要的现实意义。在创新性药物的研究开发中，应研究药物对代谢酶特别是细胞色素P450(CYP450)酶的诱导或抑制效应。相关体外研究技术主要包括：肝微粒体、肝S9、原代肝细胞及P450重组酶等。生物转化研究是创新药物的研发不可或缺的重要内容，可进行药理毒理筛选，创新药物的进一步研究提供重要信息。
目前，还没见有简单快速且全方位对新化学实体进行药代动力学早期成药性评估的方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中新药药代动力学早期成药性评估技术的缺陷和不足，提供一种药代动力学早期成药性评估方法，有利于新化学实体药代动力学特性的快速筛选，初步考察创新药物的转运特性、绝对生物利用度、蛋白结合率、对体外CYP450药物代谢酶活性的影响、代谢产物等，从而实现为早期筛选提供重要决策信息的目标，为其下一步研发提供关键依据，可有力提高创新药物研发的效率和质量。
本发明的目的是提供一种药代动力学早期成药性评估方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的。
一种药物的药代动力学早期成药性评估方法，包括如下步骤：
S1.先建立药物的UHPLC-MS/MS分析方法，再建立MDR1-MDCKII细胞筛选模型，考察P-gp抑制剂对药物的转运影响；
S2.建立并验证UHPLC-MS/MS测定大鼠血浆中药物浓度的分析方法，并测定药物在大鼠体内的绝对生物利用度，计算动代动力学参数；
S3.采用超滤法分离药物，结合UHPLC-MS/MS测定药物的体内外血浆蛋白结合率；
S4.通过“cocktail”法测定药物对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶亚型活性的影响；
S5.采用肝微粒法以及UHPLC-MS/MS分析药物的生物转化情况。
优选地，上述药物的药代动力学早期成药性评估方法，包括如下步骤：
S1.先建立待评估药物及阳性药的UHPLC-MS/MS分析方法，再建立并通过阳性药来验证MDR1-MDCKII细胞筛选模型，考察P-gp抑制剂对待评估药物的转运影响；
S2.建立并验证测定大鼠血浆中待评估药物浓度的UHPLC-MS/MS分析方法，通过灌胃或/和静脉给药测定待评估药物在大鼠体内的绝对生物利用度，用非房室模型法计算动代动力学参数；
S3.采用超滤法分离药物，结合UHPLC-MS/MS测定待评估药物的体内外血浆蛋白结合率；
S4.建立并验证体外肝微粒体探针药物的UHPLC-MS/MS分析方法，结合阳性药考察待评估药物对六种大鼠肝微粒体细胞色素P450酶亚型活性的影响；
S5.将待评估药物的体外肝微粒体孵育样本和大鼠静脉注射给药后的生物样本经固相萃取后进行UHPLC-MS/MS分析，测定待评估药物的结构及其代谢产物，研究分析待评估药物的生物转化。
其中优选地，当待评估药物为靶向抗肿瘤Aurora激酶抑制剂Ly-7u或8-羟基喹啉衍生物83b1时，步骤S1所述阳性药为地高辛。
优选地，当待评估药物为靶向抗肿瘤Aurora激酶抑制剂Ly-7u或8-羟基喹啉衍生物83b1时，步骤S1所述P-gp抑制剂为维拉帕米。
优选地，当待评估药物为靶向抗肿瘤Aurora激酶抑制剂Ly-7u时：步骤S1或S2所述UHPLC-MS/MS分析方法中，：内标均为Ly-7z，质谱条件为：离子源ESI，选择反应监测模式，监测离子为ESI+：m/z 410→353(Ly-7u)，m/z 457→368(Ly-7z)；
优选地，当待评估药物为靶向抗肿瘤Aurora激酶抑制剂Ly-7u时：步骤S1所述UHPLC-MS/MS分析方法中，液相条件为：分离柱XTerra MS C18色谱柱；流动相为：体积比1：9的0.1％甲酸水-甲醇，流速为300μL/min，柱温为室温，分析时间为3.0min；
优选地，当待评估药物为靶向抗肿瘤Aurora激酶抑制剂Ly-7u时：步骤S2所述UHPLC-MS/MS分析方法中，液相条件为：分析柱hypersil gold C18色谱柱；流动相为甲醇(A)-水(B)，水(B)中含0.1％甲酸和5mM的乙酸铵，A相、B相百分比之和为100％；流动相梯度洗脱条件为：以A相的百分比计，0～1min，5％～90％A；1～4min，90％～90％A；4～4.1min，90％～5％A；4.1～5min，90％～90％A；流速为300μL/min；柱温为室温，分析时间为5.0min。
优选地，当待评估药物为8-羟基喹啉衍生物83b1时，步骤S1或S2所述UHPLC-MS/MS分析方法为：以氯雷他定为内标，质谱条件为：离子源ESI，选择反应监测模式，监测离子为ESI+：m/z 321.96→m/z 162.84(83b1)；m/z 383.02→m/z 259.12(氯雷他定)；液相条件为：色谱柱C18XTerra MS；流动相：体积比为9：1的乙腈-1％甲酸水；流速0.3mL·min-1；进样量5μL；柱温40℃，分析时间为2.0min。
优选地，当待评估药物为8-羟基喹啉衍生物83b1时，步骤S1所述阳性药为地高辛，其UHPLC-MS/MS分析方法的条件如下：
以洋地黄毒苷(digitoxin)为内标；质谱条件为：离子源ESI，选择反应监测模式(SRM)，监测离子为ESI-：m/z 825→779(DG)，m/z 809→763(digitoxin)；液相条件：C18Hypersil gold MS分析柱(5μm，2.1×100mm.Thermo,USA)；流动相为甲醇-水(含0.002％甲酸)(60/30，v/v)；300μL/min，柱温为室温。分析时间为3.0min。
优选地，当待评估药物为靶向抗肿瘤Aurora激酶抑制剂Ly-7u或8-羟基喹啉衍生物83b1时，步骤S4所述UHPLC-MS/MS分析方法的条件为：质谱条件：离子源ESI，选择反应监测模式(SRM)，监测离子为ESI+：m/z 152→110(扑热息痛)，m/z 287→171(4-羟基甲苯磺丁脲)，m/z 362→214(5-羟基奥美拉唑)；m/z 258→157(氧去甲基右美沙芬)，m/z 345→284(氧化硝苯地平)，m/z 383→262(氯雷他定)；ESI-：m/z 184→120(6-羟基氯唑沙宗)；液相条件：分离柱C18XTerra MS分析柱(5μm,100×2.1mm.Waters,USA)；流动相为：甲醇：水(含0.1％甲酸)(70：30，v/v)，流速为300μL/min，柱温为室温，分析时间为3.5min。
优选地，当待评估药物为靶向抗肿瘤Aurora激酶抑制剂Ly-7u或8-羟基喹啉衍生物83b1时，步骤S4所述阳性药为VX-680。
优选地，当待评估药物为靶向抗肿瘤Aurora激酶抑制剂Ly-7u或8-羟基喹啉衍生物83b1时，步骤S4所述六种大鼠肝微粒体细胞色素P450酶亚型分别为CYP2E1、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19、CYP2D1和CYP3A4。
另外，作为一种优选的可实施方案，步骤S1所述MDR1-MDCKII细胞筛选模型的构建方法为：将MDR1-MDCKII细胞接种于Transwell板上进行单层培养5天，以地高辛为阳性药，通过考察跨膜电阻、荧光黄的表观通透率、地高辛的双向转运特征进行单层细胞模型构建和验证。
作为一种优选的可实施方案，步骤S2的具体方法是：SD大鼠12只随机分组；灌胃给药组：灌胃给予Ly-7u，剂量为25mg/kg；于给药前(0h)、给药后0.25、0.5、1、2、3、4、5、8、12、24、48、72h从右颈静脉取血约250μL；静脉给药组：单次静脉注射Ly-7u，剂量为2.5mg/kg；于给药前(0h)、给药后0.05、0.25、0.5、1、2、3、4、5、8、12、24、48h从右颈静脉取血约250μL；利用UHPLC-MS/MS法检测血浆中待评估药物的浓度，用非房室模型法计算主要的动代动力学参数。
作为一种优选的可实施方案，步骤S3的具体方法如下：
(1)采用UHPLC-MS/MS方法测定化合物Ly-7u的浓度；选择低中高3个浓度(0.5、5.0、50.0mg/L，n＝3)，分别对Ly-7u与大鼠和人的体外血浆蛋白结合率进行考察；
(2)12只SD大鼠(雌雄各半)随机分成低、中、高三个剂量组(5mg/kg、50mg/kg、250mg/kg)，尾静脉注射给予上述剂量的Ly-7u注射液。给药后一定时间采集5mL静脉血，对Ly-7u在大鼠体内血浆蛋白结合率进行考察。
作为一种优选的可实施方案，步骤S4的具体方法如下：
(1)“cocktail”法的建立：
取出大鼠肝后匀浆提肝微粒体，加入待评估药物、扑热息痛、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、氧去甲基右美沙芬、氧化硝苯地平、内标和6-羟基氯唑沙宗进行体外孵育实验。孵育后UHPLC-MS/MS检测扑热息痛、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、氧去甲基右美沙芬、氧化硝苯地平、内标和6-羟基氯唑沙宗这几种药物的含量。检测的药物是代谢酶的底物，加入待评估药物后，如果它对代谢酶有抑制或诱导，那么以此经此酶代谢的药物含量就会变化，从而判断83b1对酶的影响作用。
大鼠肝微粒体样品用1mL乙酸乙酯萃取，氯雷他定为内标，利用UHPLC-MS/MS方法进行分析；UHPLC-MS/MS的条件如下：
质谱条件为：离子源ESI，选择反应监测模式(SRM)，监测离子为ESI+：m/z 152→110(扑热息痛)，m/z 287→171(4-羟基甲苯磺丁脲)，m/z 362→214(5-羟基奥美拉唑)；m/z 258→157(氧去甲基右美沙芬)，m/z 345→284(氧化硝苯地平)，m/z 383→262(内标氯雷他定)；ESI-：m/z 184→120(6-羟基氯唑沙宗)；
液相条件：分离柱C18XTerra MS分析柱(5μm,100×2.1mm.Waters,USA)；流动相为：体积比为7：3的甲醇：水溶液，水溶液中含0.1％甲酸，流速为300μL/min，柱温为室温，分析时间为3.5min；
检测的药物是代谢酶的底物，加入83b1后，如果它对代谢酶有抑制或诱导，那么以此经此酶代谢的药物含量就会变化；
(2)采用“二步法”筛选策略，考察待评估药物及阳性药对六种CYP450酶亚型CYP2E1、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19、CYP2D1、CYP3A4的体外抑制作用及相应的的IC50值。
优选地，步骤S5所述待评估药物的结构及其代谢产物的测定采用一级全扫描质谱、选择反应监测和二级质谱扫描方式同时进行检测。
另外，上述方法在新化学实体药代动力学特性的快速筛选中的应用亦在本发明保护范围内。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明建立的MDR1-MDCKII细胞模型可对新化学实体的转运特性进行快速评价；
(2)本发明采用的体内法进行新药早期生物利用度研究，操作简单、高效。
(3)本发明所述超滤法进行体内外血浆蛋白结合率研究，可行性强，稳定性高；
(4)本发明所述多探针底物法，即“cocktail”法来考察药物对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶的体外抑制作用，高效快速；
(5)本发明采用高分辨UHPLC-QE-MS/MS，分辨率高，更适用于代谢产物鉴定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1新型靶向抗肿瘤Aurora激酶抑制剂Ly-7u的早期药代动力学成药性评估
化合物Ly-7u为本发明人团队前期的研究成果，其结构式如下所示：
体外研究显示，该化合物具有很好的抗肿瘤活性，且具有Aurora A/B激酶抑制活性和选择性，具有很好的应用前景。以下针对该化合物进行早期药代动力学成药性评估。
1、构建MDR1-MDCKII细胞模型对Ly-7u的转运特性进行研究
(1)待测化合物Ly-7u的UHPLC-MS/MS分析方法的建立：
以Ly-7z为内标，其结构式如下所示：
质谱条件为：离子源ESI，选择反应监测模式(SRM)，监测离子为ESI+：m/z 410→353(Ly-7u)，m/z 457→368(Ly-7z)。
液相条件：分离柱XTerra MS C18色谱柱(5μm,2.1×100mm.Waters,USA)；流动相为：0.1％甲酸水-甲醇(1/9，v/v)，流速为300μL/min，柱温为室温。分析时间为3.0min。
(2)阳性对照药地高辛(DG)UHPLC-MS/MS分析方法的建立：
以洋地黄毒苷(digitoxin)为内标。
质谱条件为：离子源ESI，选择反应监测模式(SRM)，监测离子为ESI-：m/z 825→779(DG)，m/z 809→763(digitoxin)。
液相条件：C18Hypersil gold MS分析柱(5μm，2.1×100mm.Thermo,USA)；流动相为甲醇-水(含0.002％甲酸)(60/30，v/v)；300μL/min，柱温为室温。分析时间为3.0min。
(3)MDR1-MDCKII细胞筛选模型的建立：
MDR1-MDCKII细胞接种于Transwell板上进行单层培养5天，以地高辛为阳性药，通过考察跨膜电阻、荧光黄的表观通透率、地高辛的双向转运特征进行单层细胞模型构建和验证，成功构建MDR1-MDCKII细胞模型。
(4)MDR1-MDCKII细胞模型的应用：
用MDR1-MDCKII细胞筛选模型研究Ly-7u的双向转运，考察P-gp抑制剂维拉帕米对其双向转运的影响。
Ly-7u的转运实验结果显示，在未加P-gp抑制剂维拉帕米时，Ly-7u的外排率ER大于3，加入抑制剂维拉帕米后外排率ER均显著下降，提示Ly-7u是外排蛋白P-gp的底物；加入维拉帕米后，Ly-7u外排率ER小于1，说明Ly-7u的转运方式主要是主动转运。
2、Ly-7u在大鼠体内的口服绝对生物利用度研究
(1)化合物Ly-7u的UHPLC-MS/MS分析方法的建立：
以Ly-7z为内标。
质谱条件为：离子源ESI，选择反应监测模式(SRM)，监测离子为ESI+：m/z 410→353(Ly-7u)，m/z 457→368(Ly-7z)。
液相条件：分析柱hypersil gold C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.9μm；Thremo,USA)；
流动相为：甲醇(A)-水(B)，水(B)中含0.1％甲酸和5mM的乙酸铵，A相、B相百分比之和为100％；
流动相梯度洗脱条件：0～1min，5％～90％A(以A相的百分比计)；1～4min，90％～90％A；4～4.1min，90％～5％A；4.1～5min，90％～90％A；
流速为300μL/min；柱温为室温。分析时间为5.0min。
(2)Ly-7u在大鼠体内的绝对生物利用度研究：
SD大鼠12只随机分组。
灌胃给药组：灌胃给予Ly-7u，剂量为25mg/kg；于给药前(0h)、给药后0.25、0.5、1、2、3、4、5、8、12、24、48、72h从右颈静脉取血约250μL。
静脉给药组：单次静脉注射Ly-7u，剂量为2.5mg/kg；于给药前(0h)、给药后0.05、0.25、0.5、1、2、3、4、5、8、12、24、48h从右颈静脉取血约250μL。
UHPLC-MS/MS法检测血浆中Ly-7u浓度，用非房室模型法计算主要的动代动力学参数。
(3)根据大鼠单次口服及静脉注射的结果估算，SD大鼠单次灌胃给药后(25mg/kg)Ly-7u的绝对生物利用度约为28.7％±9.7％。
3、应用超滤法进行Ly-7u体内外血浆蛋白结合率的研究
(1)采用超滤法分离药物；采用UHPLC-MS/MS方法测定化合物Ly-7u的浓度；选择低中高3个浓度(0.5、5.0、50.0mg/L，n＝3)，分别对Ly-7u与大鼠和人的体外血浆蛋白结合率进行考察。
(2)12只SD大鼠(雌雄各半)随机分成低、中、高三个剂量组(5mg/kg、50mg/kg、250mg/kg)，尾静脉注射给予上述剂量的Ly-7u注射液。给药后一定时间采集5mL静脉血，对Ly-7u在大鼠体内血浆蛋白结合率进行考察。
(3)结果显示，低、中剂量组SD大鼠Ly-7u的体内血浆蛋白结合率没有明显的剂量相关性，而高剂量组明显要比低、中剂量组低。SD大鼠分别尾静脉注射给予低、中、高剂量(分别为5mg/kg、50mg/kg、250mg/kg剂量组)后，Ly-7u在体内的血浆蛋白结合率分别为50.7％±1.9％、49.7％±3.1％、46.4％±3.9％。
4、“cocktail”法研究Ly-7u对体外CYP450药物代谢酶活性的影响
(1)“cocktail”法的建立：
取出大鼠肝后匀浆提肝微粒体，加入Ly-7u、扑热息痛、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、氧去甲基右美沙芬、氧化硝苯地平、内标和6-羟基氯唑沙宗进行体外孵育实验。孵育后UHPLC-MS/MS检测扑热息痛、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、氧去甲基右美沙芬、氧化硝苯地平、内标和6-羟基氯唑沙宗这几种药物的含量。检测的药物是代谢酶的底物，加入83b1后，如果它对代谢酶有抑制或诱导，那么以此经此酶代谢的药物含量就会变化，从而判断83b1对酶的影响作用。
大鼠肝微粒体样品用乙酸乙酯(1mL)萃取，氯雷他定为内标，利用UHPLC-MS/MS方法进行分析；UHPLC-MS/MS的条件如下：
质谱条件为：离子源ESI，选择反应监测模式(SRM)，监测离子为ESI+：m/z 152→110(扑热息痛)，m/z 287→171(4-羟基甲苯磺丁脲)，m/z 362→214(5-羟基奥美拉唑)。m/z 258→157(氧去甲基右美沙芬)，m/z 345→284(氧化硝苯地平)，m/z 383→262(内标)；ESI-：m/z 184→120(6-羟基氯唑沙宗)。
液相条件：分离柱C18XTerra MS分析柱(5μm,100×2.1mm.Waters,USA)；流动相为：甲醇：水(含0.1％甲酸)(70：30，v/v)，流速为300μL/min，柱温为室温。分析时间为3.5min。
(2)采用“二步法”筛选策略，考察化合物Ly-7u及阳性药VX-680对六种CYP450酶亚型CYP2E1、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19、CYP2D1、CYP3A4的体外抑制作用及相应的的IC50值。
(3)结果显示：Ly-7u对六种酶亚型均无抑制作用；阳性药物VX-680为CYP1A2(IC50＝25.6μM)、2C9(IC50＝30.3μM)、2D6(IC50＝36.5μM)、2E1(IC50＝34.1μM)酶亚型的弱抑制剂。
5、在体和体外肝微粒体法研究Ly-7u的生物转化
(1)化合物Ly-7u体外肝微粒体孵育样本和大鼠静脉注射给药后的生物样本，经固相萃取后进行UHPLC-MS/MS分析。
对Ly-7u结构的分析，采用一级全扫描质谱、选择反应监测和二级质谱扫描方式同时进行检测。
(2)结果显示：寻找到四种Ly-7u可能代谢产物。
实施例2 8-羟基喹啉衍生物(83b1)的早期药代动力学成药性评估
83b1是一种8-羟基喹啉衍生物，是发明人团队前期研究出的一种潜在新药，化合物的结构式如下所示：
以下针对该化合物进行早期药代动力学成药性评估。
1、MDR1-MDCKII细胞模型对83b1的转运特性进行研究
(1)化合物83b1UHPLC-MS/MS分析方法的建立：
以氯雷他定为内标。
质谱条件为：离子源ESI，选择反应监测模式(SRM)，监测离子为ESI+：m/z 321.96→m/z 162.84(83b1)；m/z 383.02→m/z 259.12(氯雷他定)。
液相条件：色谱柱C18XTerra MS(5μm,150×2.1mm.Waters,USA)；流动相：乙腈-1％甲酸水(9:1，v/v)；流速0.3mL·min-1；进样量5μL；柱温40℃，分析时间为2.0min。
(2)地高辛(DG)UHPLC-MS/MS分析方法的建立与实施例1相同。
(3)MDR1-MDCKII细胞筛选模型的建立：同实施例1相同。
(4)MDR1-MDCKII细胞筛选模型的应用：
用MDR1-MDCKII细胞筛选模型研究83b1的双向转运，考察P-gp抑制剂维拉帕米对其双向转运的影响。
83b1的转运实验结果显示，在未加P-gp抑制剂维拉帕米时，83b1的外排率ER大于4，加入抑制剂维拉帕米后外排率ER均显著下降，提示83b1是外排蛋白P-gp的底物。
2、83b1在大鼠体内的口服绝对生物利用度研究
(1)化合物83b1的UHPLC-MS/MS分析方法的建立与步骤1相同。
(2)83b1在大鼠体内的绝对生物利用度研究：
SD大鼠12只随机分组。
灌胃给药组：灌胃给予83b1，剂量为10mg/kg；于给药前(0h)、给药后0.25、0.5、1、2、3、4、5、8、12、24、48、72h从右颈静脉取血约300μL。
静脉给药组：单次静脉注射83b1，剂量为10mg/kg；于给药前(0h)、给药后0.05、0.25、0.5、1、2、3、4、5、8、12、24、48h从右颈静脉取血约300μL。
UHPLC-MS/MS法检测血浆中83b1浓度，用非房室模型法计算主要的动代动力学参数。
(3)根据大鼠单次口服及静脉注射的结果估算，SD大鼠单次灌胃给药后(25mg/kg)83b1的绝对生物利用度约为20.9％±8.8％。
3、应用超滤法进行83b1体内外血浆蛋白结合率的研究
(1)采用超滤法分离药物；采用UHPLC-MS/MS方法测定化合物83b1的浓度；选择低中高3个浓度(0.1、10.0、100.0mg/L，n＝3)，分别对83b1与大鼠和人的体外血浆蛋白结合率进行考察。
(2)12只SD大鼠(雌雄各半)随机分成低、中、高三个剂量组(1mg/kg、10mg/kg、100mg/kg)，尾静脉注射给予上述剂量的83b1注射液。给药后一定时间采集5mL静脉血，对83b1在大鼠体内血浆蛋白结合率进行考察。
(3)结果显示，SD大鼠分别尾静脉注射给予低、中、高剂量(分别为1mg/kg、10mg/kg、100mg/kg剂量组)后，83b1在体内的血浆蛋白结合率分别为32.7％±2.2％、31.7％±3.2％、26.7％±4.3％。
4、“cocktail”法研究83b1对体外CYP450药物代谢酶活性的影响
(1)“cocktail”法的建立：
取出大鼠肝后匀浆提肝微粒体，加入83b1、扑热息痛、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、氧去甲基右美沙芬、氧化硝苯地平、内标和6-羟基氯唑沙宗进行体外孵育实验。孵育后UHPLC-MS/MS检测扑热息痛、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、氧去甲基右美沙芬、氧化硝苯地平、内标和6-羟基氯唑沙宗这几种药物的含量。检测的药物是代谢酶的底物，加入83b1后，如果它对代谢酶有抑制或诱导，那么以此经此酶代谢的药物含量就会变化，从而判断83b1对酶的影响作用。
大鼠肝微粒体样品用乙酸乙酯(1mL)萃取，氯雷他定为内标，利用UHPLC-MS/MS方法进行分析；UHPLC-MS/MS的条件如下：
质谱条件为：离子源ESI，选择反应监测模式(SRM)，监测离子为ESI+：m/z 152→110(扑热息痛)，m/z 287→171(4-羟基甲苯磺丁脲)，m/z 362→214(5-羟基奥美拉唑)。m/z 258→157(氧去甲基右美沙芬)，m/z 345→284(氧化硝苯地平)，m/z 383→262(内标)；ESI-：m/z 184→120(6-羟基氯唑沙宗)。液相条件：分离柱C18XTerra MS分析柱(5μm,100×2.1mm.Waters,USA)；流动相为：甲醇：水(含0.1％甲酸)(70：30，v/v)，流速为300μL/min，柱温为室温。分析时间为3.5min。
(2)采用“二步法”筛选策略，考察化合物83b1及阳性药VX-680对六种CYP450酶亚型CYP2E1、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19、CYP2D1、CYP3A4的体外抑制作用及相应的的IC50值。
(3)结果显示：83b1对除CYP2C9(IC50＝37.8μM)外的五种酶亚型均无抑制作用；83b1为CYP2C9(IC50＝37.8μM)酶亚型的弱抑制剂。
5、在体和体外肝微粒体法研究83b1的生物转化
(1)化合物83b1体外肝微粒体孵育样本和大鼠静脉注射给药后的生物样本，经固相萃取后进行UHPLC-MS/MS分析。
对83b1结构的分析，采用一级全扫描质谱、选择反应监测和二级质谱扫描方式同时进行检测。
(2)结果显示：寻找到七种83b1可能代谢产物。
本发明的保护不限于上面实施例。