延胡索配方颗粒的特征图谱的检测方法及质量控制方法与流程

本发明涉及延胡索配方颗粒检测领域，具体而言，涉及一种延胡索配方颗粒的特征图谱的检测方法及质量控制方法。

背景技术：

延胡索为罂粟科(Papaveraceae)紫堇属植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥块茎，生于低海拔的旷野草丛或缓坡林缘，分布于河南南部、陕西南部、江苏、安徽、浙江、湖北等地。历代本草均有记载。延胡索据古医药书籍记载有活血散瘀、理气止痛的功效，现代科学实验表明延胡索具有很好的镇痛、镇静和催眠的药理作用。

为了更深入的研究延胡索，一般采用气相色谱分析或气相色谱质谱联用方法对延胡索的化学成分进行研究，建立特征图谱，但所获得的特征图谱出峰密集，色谱峰的分离度较小，色谱峰之间容易重叠，从而不能准确地确定延胡索化学成分。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种延胡索配方颗粒的特征图谱的检测方法，其建立了延胡索配方颗粒的液相特征图谱，能够系统地反应延胡索配方颗粒化学成分的全貌，并且共有峰相对保留时间稳定，可用于延胡索配方颗粒的质量控制。

本发明的另一目的在于提供一种延胡索配方颗粒的质量控制方法，其能够准确检测延胡索配方颗粒的化学成分，有效表征其相对含量，从而能够全面评价延胡索配方颗粒质量。

本发明的实施例是这样实现的：

一种延胡索配方颗粒的特征图谱的检测方法，其包括以下步骤：

取延胡索乙素和延胡索配方颗粒分别配制对照品溶液和供试品溶液；以及

对对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱分析，色谱条件包括：以甲醇和磷酸溶液作为流动相分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱，并且在梯度洗脱过程中控制甲醇的体积，使得甲醇的体积占流动相总量的百分比由8％增大至90％。

一种延胡索配方颗粒的质量控制方法，其包括前面所述的延胡索配方颗粒的特征图谱的检测方法。

本发明实施例的有益效果是：

本发明实施例的延胡索配方颗粒的特征图谱的检测方法，利用高效液相色谱法分析延胡索的化学成分，建立了延胡索配方颗粒的特征图谱，系统的反映了延胡索配方颗粒化学成分的全貌，并且按照本发明实施例的检测方法获得共有峰相对保留时间较为稳定，可为评价或控制延胡索配方颗粒的质量提供依据。并且，本发明实施例的特征图谱色谱峰的分离度好，色谱峰之间明显分离，能够准确地得到延胡索中主要化学成分的色谱峰，检测方法具有良好的稳定性和重复性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的延胡索配方颗粒的特征图谱；

图2为本发明实施例2的延胡索配方颗粒的特征图谱；

图3为本发明实施例3的延胡索配方颗粒的特征图谱；

图4为本发明实施例4的延胡索配方颗粒的特征图谱；

图5为本发明实施例5的延胡索配方颗粒的特征图谱；

图6为本发明实施例6的延胡索配方颗粒的特征图谱；

图7为本发明实施例的延胡索配方颗粒的特征图谱与空白溶液和对照品溶液的对照图谱；

图8为本发明实施例所建立的延胡索配方颗粒的特征图谱对照图谱；

图9为3批延胡索配方颗粒的特征图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

关于本发明实施例的材料、试剂以及仪器说明：

1.延胡索乙素：中国食品药品检定研究院，批号110726－201515。

2.延胡索配方颗粒：黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，批号S20151201、S20151202、S20151203。

3.作为流动相用的甲醇：色谱级，默克公司(HPLC，Merck)。

4.磷酸：色谱级，默克公司(HPLC，Merck)。

5.三乙胺：色谱级，默克公司(HPLC，Merck)。

6.氨水：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

7.作为溶剂用的甲醇：色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司。

8.实验仪器：Waters e2695＿2998液相系统，Agilent Zorbax eclipse XDB－C18(4.6×250mm，5μm)液相色谱柱。

本发明实施例的延胡索配方颗粒的特征图谱的检测方法，其包括以下步骤：

步骤1：配制对照品溶液和供试品溶液

取延胡索乙素和延胡索配方颗粒分别配制对照品溶液和供试品溶液。具体地：

步骤1.1：配制对照品溶液

用甲醇配制浓度为0.1mg/mL－0.3mg/mL的延胡索乙素溶液，即得对照品溶液。

优选地，对照品溶液的浓度为0.2mg/mL，以提高检测的准确性。

延胡索乙素为延胡索的主要成分之一，其相较于其他成分(例如延胡索甲素、丙素、丁素等)具有更强的镇痛效果，因此本实施例选取延胡索乙素作为对照品，对延胡索配方颗粒特征图谱中的延胡索乙素的色谱峰进行指认，根据特征图谱能够直观地获取延胡索配方颗粒中延胡索乙素的含量，为控制或评价延胡索配方颗粒的质量提供依据。

毫无疑义地，在本发明的其他实施例中，还可以用延胡索的其他有效成分作为对照品，例如延胡索甲素、延胡索丙素、延胡索丁素、延胡索戊素、延胡索辛素、延胡索壬素、延胡索癸素、延胡索子素、延胡索丑素、延胡索寅素、β－高白屈菜碱、黄连碱和延胡索胺碱等。在本发明实施例的技术构思下，本领域技术人员可以将前述有效成分中的任一种作为延胡索乙素的替换。

步骤1.2：配制供试品溶液

在本发明的一个优选实施例中，配制供试品溶液包括以下步骤：

用氨水和甲醇的混合溶液配制浓度为15mg/mL－25mg/mL的延胡索配方颗粒溶液，其中氨水和甲醇的体积比为1：20。称定重量，加热回流0.8h－1.2h后放冷，再称定重量，用氨水和甲醇的混合溶液补足减少的重量。经摇匀后过滤，所得滤液即为供试品溶液。

根据一个优选实施方式，加氨水和甲醇的混合溶液调节溶液浓度为20mg/mL。

根据一个优选实施方式，加热回流溶液1h。

进一步，在本发明的另一个优选实施例中，配制供试品溶液还包括以下步骤：过滤后取滤液蒸干，并用甲醇定容，再摇匀、过滤，所得滤液即为供试品溶液。

在本发明的有一个优选实施例中，配制供试品溶液包括以下步骤：

用氨水和甲醇的混合溶液配制浓度为15mg/mL－25mg/mL的延胡索配方颗粒溶液，其中氨水和甲醇的体积比为1：20。称定重量，用超声波处理溶液50min－70min，放冷，用氨水和甲醇的混合溶液补足减少的重量。经摇匀后过滤，所得滤液即为供试品溶液。

根据一个优选实施方式，加氨水和甲醇的混合溶液调节溶液浓度为20mg/mL。

根据一个优选实施方式，用超声波处理溶液60min。

步骤2：高效液相色谱分析对照品溶液和供试品溶液

对对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱分析，色谱条件包括：

用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。以甲醇和磷酸溶液作为流动相分别对对照品溶液和供试品溶液进行梯度洗脱，并且在梯度洗脱过程中控制甲醇的体积，使得甲醇的体积占流动相总量的百分比由8％增大至90％。流动相的流速为0.8mL/min－1.2mL/min。检测波长为280nm，色谱柱的温度为20℃－35℃。

根据一个优选实施方式，磷酸溶液中磷酸的体积比0.1％，并且用三乙胺将磷酸溶液的pH值调节至6。

根据一个优选实施方式，流动相甲醇和磷酸溶液的流速为0.8mL/min－1.2mL/min。

根据一个优选实施方式，色谱柱温度为30℃。

在本发明较佳的实施例中，在进行梯度洗脱时：

初始时刻，即t＝0min时，甲醇占流动相总量的百分比为8％－12％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为88％－92％；

t＝15min时，甲醇占流动相总量的百分比为18％－22％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为78％－82％；

t＝35min时，甲醇占流动相总量的百分比为32％－38％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为62％－68％；

t＝50min时，甲醇占流动相总量的百分比为48％－52％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为48％－52％；

t＝80min时，甲醇占流动相总量的百分比为82％－90％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为10％－18％。

优选地，在本发明的较佳实施例中：

t＝0min时，甲醇占流动相总量的百分比为10％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为90％；

t＝15min时，甲醇占流动相总量的百分比为20％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为80％；

t＝35min时，甲醇占流动相总量的百分比为35％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为65％；

t＝50min时，甲醇占流动相总量的百分比为50％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为50％；

t＝80min时，甲醇占流动相总量的百分比为85％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为15％。

优选地，在本发明的较佳实施例中：

t＝0min时，甲醇占流动相总量的百分比为8％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为92％；

t＝15min时，甲醇占流动相总量的百分比为18％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为82％；

t＝35min时，甲醇占流动相总量的百分比为32％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为68％；

t＝50min时，甲醇占流动相总量的百分比为48％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为52％；

t＝80min时，甲醇占流动相总量的百分比为82％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为18％。

优选地，在本发明的较佳实施例中：

t＝0min时，甲醇占流动相总量的百分比为12％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为88％；

t＝15min时，甲醇占流动相总量的百分比为22％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为78％；

t＝35min时，甲醇占流动相总量的百分比为38％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为62％；

t＝50min时，甲醇占流动相总量的百分比为52％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为48％；

t＝80min时，甲醇占流动相总量的百分比为90％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为10％。

优选地，在本发明的较佳实施例中：

t＝0min时，甲醇占流动相总量的百分比为11％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为89％；

t＝15min时，甲醇占流动相总量的百分比为21％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为79％；

t＝35min时，甲醇占流动相总量的百分比为36％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为64％；

t＝50min时，甲醇占流动相总量的百分比为51％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为49％；

t＝80min时，甲醇占流动相总量的百分比为89％，磷酸溶液占流动相总量的百分比为11％。

本发明实施例的延胡索配方颗粒的质量控制方法，其包括本发明实施例的延胡索配方颗粒的特征图谱的检测方法。具体地：

步骤1：按照本发明实施的检测方法建立延胡索配方颗粒标准特征图谱。

步骤2：建立待检测颗粒样品的特征图谱，具体地：将待检测的颗粒样品按照本发明实施例的检测方法进行检测，获得液相特征图谱。

步骤3：将颗粒样品的特征图谱与标准图谱进行对比，通过图谱中的色谱峰出峰时间、峰数量、峰值等参数来评价或控制颗粒样品的质量。

实施例1

本实施例的特征图谱是按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定的。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18；4.6×250mm，5μm)。以流动相A：甲醇(色谱级，默克公司(HPLC，Merck))，流动相B：0.1％磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.0)，按下表1进行梯度洗脱，流速为1mL/min。检测波长为280nm，柱温30℃。

表1

供试品溶液：取延胡索配方颗粒样品(批号S20151201)1g，研细，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入氨水－甲醇(1：20)混合溶液50mL，调节溶液浓度为20mg/mL，精密称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用氨水－甲醇(1：20)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

取上述供试品溶液10μL注入液相色谱仪中，记录色谱峰，所得特征图谱如图1所示。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于供试品溶液的提取方式不同。

供试品溶液：取延胡索配方颗粒样品(批号S20151201)1g，研细，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入氨水－甲醇(1：20)混合溶液50mL，调节溶液浓度为20mg/mL，精密称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用氨水－甲醇(1：20)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25mL，蒸干，用甲醇定容至5mL容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

取上述供试品溶液10μL注入液相色谱仪中，记录色谱峰，所得特征图谱如图2所示。

实施例3

本实施例与实施例1的区别也在于供试品溶液的提取方式不同。

供试品溶液：取延胡索配方颗粒样品(批号S20151201)1g，研细，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入氨水－甲醇(1：20)混合溶液50mL，调节溶液浓度为20mg/mL，精密称定重量，超声60min，放冷，再称定重量，用氨水－甲醇(1：20)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取上述供试品溶液10μL注入液相色谱仪中，记录色谱峰，所得特征图谱如图3所示。

实施例1－实施例3相互之间的区别在于供试品溶液(即延胡索配方颗粒溶液)的提取方式不同。如图1－图3所示的实施例1－实施例3的特征图谱，三者的特征图谱峰数及分布情况基本一致。其中，图2所示出的实施例2的特征图谱的色谱峰高较高。这是由于在施例2在实施例1的基础之上，在过滤步骤之后，对滤液进行了蒸干、甲醇定容以及再过滤等步骤，提高了溶液的纯度，增大了检测的准确性。

实施例4

本实施例和实施例1的区别在于，色谱柱的温度不同。本实施例的色谱柱温度为25℃。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18；4.6×250mm，5μm)。以流动相A：甲醇(色谱级，默克公司(HPLC，Merck))，流动相B：0.1％磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.0)，按照表1进行梯度洗脱，流速为1mL/min。检测波长为280nm，柱温25℃。

对照品溶液：称取延胡索乙素适量，用甲醇(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)配制成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液：取延胡索配方颗粒样品(批号S20151201)1g，研细，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入氨水－甲醇(1：20)混合溶液50mL，调节溶液浓度为20mg/mL，精密称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用氨水－甲醇(1：20)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

取上述供试品溶液10μL注入液相色谱仪中，记录色谱峰，所得特征图谱如图4所示。

实施例5

本实施例和实施例1的区别也在于，色谱柱的温度不同。本实施例的色谱柱温度为35℃。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18；4.6×250mm，5μm)。以流动相A：甲醇(色谱级，默克公司(HPLC，Merck))，流动相B：0.1％磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.0)，按照表1进行梯度洗脱，流速为1mL/min。检测波长为280nm，柱温35℃。

对照品溶液：称取延胡索乙素适量，用甲醇(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)配制成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液：取延胡索配方颗粒样品(批号S20151201)1g，研细，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入氨水－甲醇(1：20)混合溶液50mL，调节溶液浓度为20mg/mL，精密称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用氨水－甲醇(1：20)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

取上述供试品溶液10μL注入液相色谱仪中，记录色谱峰，所得特征图谱如图5所示。

实施例1、实施例4和实施例5相互之间的区别在于供试品溶液(即延胡索配方颗粒溶液)的色谱柱温度不同。如图1、图4和图5所示的实施例1、实施例4和实施例5的特征图谱，三者的色谱峰区别较小，均呈正态分布，并且分离度良好，其中以图1所示的实施例1的正态分布最好，分离度最好。

实施例6

本实施例和实施例1的区别在于，流动相的流速不同。本实施例中，流动相：甲醇和磷酸溶液的流速为0.8mL/min。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18；4.6×250mm，5μm)。以流动相A：甲醇(色谱级，默克公司(HPLC，Merck))，流动相B：0.1％磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.0)，按照表1进行梯度洗脱，流速为0.8mL/min。检测波长为280nm，柱温30℃。

对照品溶液：称取延胡索乙素适量，用甲醇(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)配制成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液：取延胡索配方颗粒样品(批号S20151201)1g，研细，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入氨水－甲醇(1：20)混合溶液50mL，调节溶液浓度为20mg/mL，精密称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用氨水－甲醇(1：20)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

取上述供试品溶液10μL注入液相色谱仪中，记录色谱峰，所得特征图谱如图6所示。

试验例1

本试验例在于对特征图谱中的延胡索乙素进行指认。

取空白溶液(氨水－甲醇溶液，其中氨水：甲醇＝1：20)和由延胡索乙素配制而成的对照品溶液按照与实施例1相同的方法进行色谱分析。其中，对照品溶液：称取延胡索乙素适量，用甲醇(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)配制成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。色谱图见图7。如7所示，上层色谱为对照品延胡索乙素的特征图谱，中层色谱为空白溶液的特征图谱，没有出现峰值，下层色谱为实施例1的延胡索配方颗粒的特征图谱。图7中，68min对应的色峰即为延胡索乙素。

同时，如图8所示，对延胡索乙素配方颗粒的其他特征峰进行标记，按照本发明实施例的检测方法获得特征图谱具有八个特征峰，其中8号色谱峰为延胡索乙素，其余色谱峰与8号峰的相对保留时间分别为0.60(峰1)、0.64(峰2)、0.65(峰3)、0.66(峰4)0.69(峰5)、0.92(峰6)和0.94(峰7)，相对偏差不得过±5％。

试验例2

本试验例的目的在于对本发明实施例的检测方法的精密度进行测试，具体地：

取批号为S20151201的延胡索配方颗粒供试品溶液，按照实施例1的检测方法连续进样6次，每次10μL，并对每次进样的特征峰保留时间和相对峰面积进行统计，见表2和表3。

表2延胡索配方颗粒的特征峰保留时间

表3延胡索配方颗粒的特征峰相对峰面积

如表2和表3所示，特征峰的保留时间的RSD均小于0.3％，特征峰的相对峰面积RSD均小于2.0％，表明本发明实施例精密度良好，保证了检测的准确性。

试验例3

本试验例的目的在于检测本发明实施例的检测方法的重复性，具体地：

取批号为S20151201的延胡索配方颗粒，精密称取6份，按实施例1的检测方法进行检测，取所得供试品溶液，分别进样，进样体积为10μL。并对每次进样的特征峰保留时间进行统计，见表4。

表4重复性考察－特征峰保留时间

如表4所示，所得特征峰的保留时间的RSD均小于0.3％，表明本发明实施例的检测方法重复性良好。

试验例4

本试验例的目的在于检测本发明实施例的供试品溶液的稳定性，具体地：

取实施例1的供试品溶液，每隔100分钟进样10μL，检测80min内的色谱图，对特征峰进行分析，并对每次进样的特征峰保留时间和相对峰面积比值进行统计，见表5和表6。

表5延胡索配方颗粒的特征峰保留时间

表6延胡索配方颗粒的特征峰相对峰面积

如表5和表6所示，色谱峰相对保留时间均小于0.3％，特征峰的相对峰面积的RSD均小于2.0％，表明供试品溶液在10h内稳定。

试验例5

本试验例的目的在于建立三批延胡索配方颗粒(S20151201、S20151202和S20151203)的特征图谱，具体地：

取3批延胡索配方颗粒的供试品溶液，进样10μL，记录80min的色谱图，如图9所示。同时，3批配方颗粒的特征峰的相对保留时间见表7。

表7延胡索配方颗粒的特征峰相对保留时间

3批配方颗粒有8个共有峰，分别在41.1，44.0，44.5，45.3，46.9，62.8，63.8，68.3min左右出峰，其中68.3分钟为延胡索乙素峰。共有峰保留时间具有较好的重复性。8个共有峰的平均相对保留时间依次为：0.602、0.644、0.652、0.663、0.686、0.919、0.935、1，RSD均低于0.3％。这8个共有峰出峰时间较为稳定，可作为延胡索配方颗粒的特征峰。

综上所述，通过试验例1－5的检验结果可以看出，本发明实施例的检测方法不仅系统、全面地反映了延胡索配方颗粒的化学成分，为评价或控制延胡索配方颗粒质量提供科学的评价方法，并且本发明实施例的检测方法简便、稳定、精密度高，具有良好的重现性(重复性)，同时本发明实施例所建立的特征图谱，色谱峰分离效果过，基线平稳，可以作为延胡索配方颗粒特征图谱的对照图谱，用于评价延胡索或醋延胡索配方颗粒的质量。

值得说明的是，本发明实施例的延胡索配方颗粒的特征图谱的检测方法同样适用于醋延胡索配方颗粒。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。