一种氨基酸注射液中蛋氨酸亚砜的快速检测方法与流程

本发明属于药品检测方法技术领域，具体涉及一种氨基酸注射液中蛋氨酸亚砜的快速检测方法。

背景技术：

人体维持生命活动需要摄入多种氨基酸，一些需要补充营养的患者通常需要临床肠内外营养支持。蛋氨酸是构成人体的必需氨基酸之一，参与蛋白质合成，是氨基酸注射液中的主要成分之一。蛋氨酸分子式中含1个巯基，具有还原性，易氧化降解为蛋氨酸亚砜。中长链脂肪乳/氨基酸(16)/葡萄糖(16％)注射液的进口注册标准(贝朗医疗公司，标准号：JX20110281)中采用柱前衍生对样品中蛋氨酸亚砜进行检测。在光化学领域，有学者用L-8500氨基酸分析仪对照相明胶中蛋氨酸亚砜进行检测。

但柱前衍生对样品中蛋氨酸亚砜进行检测，峰型及分离度差，易受衍生试剂及阴性干扰，对色谱柱及液相系统损伤大。老型机L-8500氨基酸分析仪测定明胶中蛋氨酸亚砜存在一些不足，如重复性不理想、耗时长等。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是，现有技术中采用前衍生对样品中蛋氨酸亚砜进行检测，峰型及分离度差，易受衍生试剂及阴性干扰，对色谱柱及液相系统损伤大；而老型机L-8500氨基酸分析仪测定明胶中蛋氨酸亚砜存在如重复性不理想、耗时长等不足。

为解决上述问题，我们结合具体实际情况采用氨基酸自动分析仪进行检测，建立了一种稳定、迅速、准确地测定氨基酸注射液中蛋氨酸亚砜的检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种氨基酸注射液中蛋氨酸亚砜的快速检测方法，氨基酸注射液中蛋氨酸亚砜的快速检测方法，采用氨基酸自动分析仪进行检测；所用的流动相为B1、B6，其组成见下表：

所用的衍生反应试剂R1、R2、R3，其组成见下表：

梯度洗脱和衍生反应步骤如下表所示：

检测波长为440nm，记录色谱图。

作为优选的，采用氨基酸自动分析仪检测时，以日立专用离子交换树脂为填充剂。

作为优选的，实验过程为：精密量取本品1.00ml，置于10ml量瓶中，加0.02mol/L的 盐酸溶液制成供试品溶液，取20μl注入氨基酸分析仪，按上述方法进行检测。另取蛋氨酸亚砜对照品适量，精密称定，加0.02mol/L的盐酸溶液制成含蛋氨酸亚砜浓度为5μg/ml的溶液，采用如权利要求1所述方法测定，按外标法以峰面积计算。

理论板数按蛋氨酸亚砜峰计算应不低于1000，蛋氨酸亚砜峰与其他峰分离度大于1.0。

本发明的有益效果在于：

1.通过对比研究，原标准程序采用B1、B2、B3、B4、B6为流动相，试剂耗费大，流动相种类多。而改进后短程序仅采用B1、B6为流动相，试剂耗费少，且谱图较简洁。

2.原标准程序测试需要53.8分钟，本发明的检测方法仅需要29.5分钟，大大减少了检测时间，效率更高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是原标准程序(53.8min)样品谱图；

图2是放大后的原标准程序(53.8min)样品谱图；

图3是改进后短程序(29.5min)样品谱图；

图4是改进后短程序(29.5min)样品放大后谱图；

图5是蛋氨酸亚砜线性关系曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1:

一种氨基酸注射液中蛋氨酸亚砜的快速检测方法，包括以下步骤：

精密量取本品1.00ml，置于10ml量瓶中，加0.02mol/L的盐酸溶液制成供试品溶液，取20μl注入氨基酸分析仪，用氨基酸自动分析仪检测，记录色谱图；另取蛋氨酸亚砜对照品适量，精密称定，加0.02mol/L的盐酸溶液制成含蛋氨酸亚砜浓度为5μg/ml的溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。

采用氨基酸自动分析仪进行检测时所用的流动相为B1、B6，其组成见下表：

所用的衍生反应试剂R1、R2、R3，其组成见下表：

梯度洗脱和衍生反应步骤如下表所示：

以日立专用离子交换树脂为填充剂，检测波长为440nm，记录色谱图。理论板数按蛋氨酸亚砜峰计算应不低于1000，蛋氨酸亚砜峰与其他峰分离度大于1.0。

本实施例的检测方法验证：

(1)色谱条件与系统适用性试验

色谱条件：用日立专用离子交换树脂为填充剂；采用厂商提供的B1-B6六种流动相；R1-R3为反应试剂；检测波长为570nm(脯氨酸)、440nm(其它氨基酸)。

系统适用性：精密量取本品1.00ml，置于10ml量瓶中，加0.02mol/L的盐酸溶液制成样品溶液。取20μl注入氨基酸分析仪谱仪，使用蛋白质水解方法分析，连续6针进样，记录色谱图。该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0％，保留时间的相对标准差应不大于1.0％。

理论板数按蛋氨酸亚砜峰计算为742，与周围其他峰能完全分离，峰面积的RSD为1.1％，保留时间的RSD为0.1％。

(2)专属性

精密称取蛋氨酸亚砜对照品51.46mg置于100ml量瓶中，用0.02mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取1.00ml，置10ml量瓶中，用0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为蛋氨酸亚砜对照品储备液(50μg/ml)。

分别取0.02mol/L盐酸溶液，蛋氨酸亚砜溶液为5.095μg/ml(精密量取蛋氨酸亚砜对照储备液1.00ml，置10ml量瓶中，用0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀)，蛋氨酸溶液为0.225mg/ml(精密量取蛋氨酸储备液1.00ml，置10ml量瓶中，用0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀)，阴性溶液(精密量取阴性溶液储备液1.00ml，置10ml量瓶中，用0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀)和稀释的样品溶液(精密量取中试样品1.00ml，置10ml量瓶中，用0.02mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀)，按含量测定法，各进样20μl，记录色谱图。

结果表明：该含量测定方法中溶剂、阴性溶液对蛋氨酸亚砜的测定无干扰，专属性强。

(3)检测限与定量限

将蛋氨酸亚砜对照品储备液不断用0.02mol/L盐酸溶液稀释至不同浓度，按含量测定法，各进样20μl，记录色谱图。以信噪比10：1时的浓度确定其最低定量限，以信噪比3：1时的浓度确定其最低检测限。

最低定量限验证：配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0％，峰面积的相对标准差应不大于5.0％。

结果表明：蛋氨酸亚砜的最低检测限为0.510μg/ml，最低定量限为1.019μg/ml，6份最低定量限浓度的溶液，杂质峰保留时间的RSD为0.3％，峰面积的RSD为1.0％。

(4)线性和范围

配制蛋氨酸亚砜浓度分别为标示量(50μg/ml)的20％(定量限浓度)、50％、75％、100％、125％、150％，各进样20μl，记录色谱图，测定峰面积，结果下表和图5。

以蛋氨酸亚砜峰面积为纵坐标、浓度(μg/ml)为横坐标作线性回归，得回归方程：y＝20523x-36688，R＝0.999，回归曲线见图5。结果表明：蛋氨酸亚砜浓度在1.019～7.642μg/ml范围内线性关系良好。

(5)准确度试验

分别精密称取蛋氨酸亚砜对照品约12.5mg、12.5mg、12.5mg；25mg、25mg、25mg；37.5mg、37.5mg、37.5mg；置9个50ml量瓶，加阴性溶液(按照处方配制不含蛋氨酸)溶解，定容、摇匀。再分别精密量取5.00ml置于9个50ml量瓶中，加阴性溶液(按照处方配制不含蛋氨酸)溶解，定容、摇匀，作为准确度待测溶液。照有关物质项下的检测方法，依法测定，记录色谱图，计算回收率和回收率的相对标准偏差，各浓度下的平均回收率均应在80％-120％之间。结果见下表：

结果表明，蛋氨酸亚砜含量测定方法在标示量的50％～150％范围内准确度良好。

(6)精密度试验—重复性试验

精密量取Z1310001批复方氨基酸注射液(18AA)1.00ml，分别置于6个10ml容量瓶中，用水定容后摇匀，分别取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。蛋氨酸亚砜重复性试验结果记录如下表：

由上表可知：重复性试验中蛋氨酸亚砜测定的RSD为1.1％，表明本含量测定方法的重复性良好。

(7)耐用性-溶液稳定性试验

取Z1310001批复方氨基酸注射液(18AA)，照含量测定法配制样品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12小时各测定一次，计算其峰面积的相对标准偏差，结果见下表。

结果表明：复方氨基酸注射液(18AA)中蛋氨酸亚砜含量样品溶液在12h内测定，峰面积的RSD为1.5％，稳定性结果良好。

(8)蛋氨酸亚砜含量测定方法学验证

对于采用本发明检测方法和原标准程序方法两种分析程序测定结果比较如下：

选用了复合氨基酸注射液(17AA)、复方氨基酸注射液(18AA-Ⅱ)、复方氨基酸(15) 双肽(2)注射液、复方氨基酸注射液(18AA)，按照上述测定方法上机测定,以53.8min标准程序分析结果为对照，分析29.5min短程序测定结果。结果如下表：

从上表可以看出，用29.5min短程序测定的蛋氨酸亚砜含量与53.8min标准程序的测定值间相对误差不大于4％。在标准规定的允许误差范围内。

两种分析程序测定结果比较，可看出其测定值的相对误差均不大于4％，在允许误差范围内，该短程序的测定值是可靠的，可用于正常的分析，且省时、省试剂。

在L-8900氨基酸自动分析仪上应用改良后的29.5min短程序测定γ-氨基丁酸稳定、快速、准确,可满足科研实验的需要。