一种LC‑MS/MS测定大鼠血浆中Ly‑7u浓度的方法与流程

本发明属于药物动力学分析技术领域。更具体地，涉及一种LC-MS/MS(液相色谱质谱联用技术)测定大鼠血浆中Ly-7u浓度的方法。

背景技术：

极光激酶(aurora kinases)是细胞有丝分裂过程中一类重要的蛋白激酶，在细胞的有丝分裂中起着重要的调控作用，近年来，相关研究发现极光激酶在肿瘤形成中具有重要功能，因此一系列激酶抑制剂被开发研究。

化合物Ly-7u为本发明人团队前期的研究成果，其结构式如下所示。体外研究显示，该化合物具有很好的抗肿瘤活性，且具有Aurora A/B激酶抑制活性和选择性，具有很好的应用前景，目前该化合物已处于临床前研究研究阶段。

药代动力学评估是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化的规律。随着药物化学的发展及人类健康水平的不断提高，对药物的药代动力学性质的要求越来越高：判断一个药物的应用前景特别是市场前景，不单纯是疗效强，毒副作用小；更要具备良好的药代动力学性质。而药物在血浆中浓度的检测技术是药代动力学分析评估的重要前提技术。因此，为满足Ly-7u药代动力学评估的需要，一种灵敏度高、稳定可靠的Ly-7u血浆浓度检测方法是研究其口服生物利用度的基础。

技术实现要素：

本发明的首要目的是提供一种检测大鼠血浆中Ly-7u浓度的方法，是一种快速、灵敏度高、准确度和精密度高的液相色谱质谱联用检测方法，满足Ly-7u临床前研究的需要，可为该化合物的新药临床前研究提供技术支持。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种LC-MS/MS测定大鼠血浆中Ly-7u浓度的方法，包括如下步骤：

S1.配制标准工作液：精密称取Ly-7u和内标Ly-7z粉末，分别用甲醇水溶液溶解，并稀释成标准工作液；

S2.建立标准曲线：精密量取大鼠空白血浆，加入一系列Ly-7u标准工作液，加入内标Ly-7z标准工作液，采用液液萃取提取方法前处理，后利用LC-MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，以待测物与内标峰面积比为横坐标，以待测物浓度为纵坐标建立标准曲线；

S3.待测样本血浆处理：精密量取给药Ly-7u后大鼠血浆，加入内标，采用液液萃取提取方法前处理；

S4.利用LC-MS/MS进行分析，得到各样品的色谱图，利用标准曲线计算出样本血浆的浓度。

其中，优选地，步骤S1所述甲醇水溶液的体积比组成为甲醇：水＝90：10。

优选地，步骤S1所述用甲醇水溶液溶解后还需经过超声5～15min进行溶解。

更优选地，是超声10min进行溶解。

优选地，步骤S2中加入Ly-7u标准工作液和加入内标Ly-7z标准工作液后，都需要轻涡混匀。

优选地，步骤S2所述液液萃取选用乙酸乙酯。

更优选地，步骤S2或S3所述液液萃取提取方法前处理为：加入1mL乙酸乙酯，涡旋2min，静置10min，15000rpm离心10min，吸取上清液，室温下真空挥干，加入复溶液溶解，涡旋1.5min，15000rpm离心5min；所述复溶液的体积比组成为：甲醇：0.1％甲酸水＝9：1，其中还含有5mM醋酸铵。

优选地，步骤S2或S4所述LC-MS/MS的色谱条件设定如下：流动相为甲醇(A)/水(含0.1％甲酸和5mM的乙酸铵)(B)；梯度洗脱(0–1min,5％–90％A；1–4min,90％–90％A；4–4.1min,90％–5％A；4.1–5min,90％–90％A)；

流速0.3mL·min^-1；进样量2μL；柱温25℃；MRM模式：Ly-7u：m/z 410→m/z353；Ly-7z：m/z 457→m/z 368。

优选地，步骤S2或S4所述LC-MS/MS中Ly-7u的定量子离子为353m/z，内标定量子离子为368m/z。

优选地，所有用到的水均为超纯水，所有有机试剂均为HPLC级。

优选地，所述LC-MS/MS为UHPLC-MS/MS。

另外，优选地，步骤S2中大鼠空白血浆：Ly-7u标准工作液：内标Ly-7z标准工作液的体积比＝9：1：4。

更优选地，是取45μl大鼠空白血浆，加入5μL Ly-7u标准工作液和20μL内标溶液，所述液液萃取提取时乙酸乙酯用量为1mL。

具体优选地，步骤S2所述液液萃取方法前处理为：

加入1mL乙酸乙酯，涡旋2min，静置10min，15000rpm离心10min，吸取800μL上清液至另一干净1.5mL离心管中，室温下真空挥干，加入200μL复溶液[甲醇/0.1％甲酸水(含5mM醋酸铵)＝9:1，v/v]溶解，涡旋1.5min，15000rpm离心5min。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供了一种LC-MS/MS测定大鼠血浆中Ly-7u浓度的方法，对血浆样本前处理方法进行探究并优化，使得所采用的方法操作简便，高效稳定，处理时间短，使用萃取溶剂安全无毒。

同时，本发明由于对色谱条件进行合理设置，使得采用本发明的方法所得的待测物和内标色谱图稳定可靠，检测技术灵敏度高，分析时间短，且准确度和精密度高，可很好的满足Ly-7u药代动力学评估的需要。

本发明建立的大鼠血浆中Ly-7u的LC-MS/MS检测方法，可应用于研究Ly-7u大鼠口服生物利用度，达到该方法满足Ly-7u临床前研究的目的。

附图说明

图1为本发明实施例1建立的Ly-7u离子质谱图；

图2为本发明实施例1建立的测定大鼠血浆中Ly-7u浓度的标准曲线；

图3为本发明实施例1建立的LC-MS/MS方法的样本色谱图。

图4为本发明实施例2建立的LC-MS/MS方法的样本色谱图。

图5为本发明实施例3建立的测定大鼠单次口服及静注Ly-7u制剂后药时曲线图；其中，纵坐标为Ly-7u浓度(C)的对数值。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1

1、建立测定大鼠血浆中Ly-7u浓度的标准曲线：

(1)标准工作液配制：

精密称取Ly-7u标准品3.00mg于10ml容量瓶中，甲醇/水(9:1)定容，超声10min溶解，即得300μg/mL的标准储备液，置于-20℃保存。制备浓度分别为50,000、40,000、20,000、10,000、5000、2000、500、100、20、5、2.5ng/mL的Ly-7u标准工作液。

精密称取内标Ly-7z标准品5.00mg于5ml容量瓶中，甲醇/水(9:1)定容，超声10min溶解，即得1mg/mL的标准储备液，置于-20℃保存。使用前用(甲醇/水＝50/50，v/v)稀释成500ng/ml标准工作液。

内标Ly-7z的结构式如下所示：

(2)标准曲线建立：

1)取标准工作液5μl加入45μl空白大鼠血浆，轻涡混匀，加入内标溶液20μL，轻涡混匀，加入1mL乙酸乙酯，涡旋2min，静置10min，15000rpm离心10min，吸取800μL上清液至另一干净1.5mL离心管中，室温下真空挥干，加入200μL复溶液[甲醇/0.1％甲酸水(含5mM醋酸铵)＝9:1，v/v]溶解，涡旋1.5min，15000rpm离心5min。上清120μl移入进样瓶，进样2μL，进行UHPLC-MS/MS分析。

2)精密吸取供试品溶液120μL进样，采用以下色谱条件进行洗脱：

色谱柱hypersil gold C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.9μm；Thremo,USA)；

流动相为甲醇(A)/水(含0.1％甲酸和5mM的乙酸铵)(B)，梯度洗脱(0–1min,5％–90％A；1–4min,90％–90％A；4–4.1min,90％–5％A；4.1–5min,90％–90％A)；

流速0.3mL·min^-1；进样量2μL；柱温25℃；MRM模式：Ly-7u：m/z 410→m/z353；Ly-7z：m/z 457→m/z 368。结果如图1所示。

3)进行LC-MS/MS分析，以不同浓度的Ly-7u的峰面积与内标Ly-7z的峰面积之比Y为纵坐标，以Ly-7u的血药浓度C为横坐标进行直线回归，得回归方程及R²。以信噪比S/N＝3计，得该方法的最低检测浓度。标准曲线结果如图2所示。

2、建立的LC-MS/MS方法的样本色谱图

大鼠血浆样品50μL，置于1.5mL EP管中，加入相应内标溶液20μL，加入1mL乙酸乙酯，涡旋2min，静置10min，15000rpm离心10min，吸取800μL上清液至另一干净1.5mL离心管中，室温下真空挥干，加入200μL复溶液[甲醇/0.1％/甲酸水(含5mM醋酸铵)＝9:1，v/v]溶解，涡旋1.5min，15000rpm离心5min，上清120μl移入进样瓶，进样2μL，进行UHPLC-MS/MS分析。

以Ly-7u的峰面积与内标的峰面积之比Y代入标准曲线计算Ly-7u的血药浓度C。

2、样本色谱图结果如图3所示。结果显示，色谱图中待测物和内标峰形平滑对称，无干扰峰，色谱图稳定可靠，出峰时间分别为2.94min和2.99min，分析时间短。表明本测定方法高效、稳定，可很好的满足Ly-7u药代动力学评估的需要。

实施例2加标样本检测

1、加标血浆样本前处理

(1)从空白大鼠眼眶静脉丛采血约300μL。血样品置于肝素化EP管中，全血经4000rpm离心5min吸取上层血浆，即空白大鼠血浆，按100μL分装后于-80℃贮存。

将Ly-7u外加入空白大鼠血浆，得到Ly-7u浓度为0.5、50、500、4000ng/mL的加标血浆样品。

(2)取加标血浆样品100μL，按照实施例1的样本前处理进行处理后，取上清80μL移入进样瓶中。

2、加标血浆样本检测

进样10μL进行UPLC-MS/MS分析，条件同实施例1。根据标准曲线计算血浆样本浓度0.4±0.05、49.1±1.4、505.0±11.2、3923.3±158.7ng/mL，其中Ly-7u浓度为50ng/mL的样本色谱图如图4所示。

表明本测定方法可以很准确的测定分析血浆中Ly-7u的浓度，且色谱图中待测物和内标峰形平滑对称，无干扰峰，色谱图稳定可靠，方法高效、稳定，可很好的满足Ly-7u药代动力学评估的需要。

实施例3样本检测

1、SD大鼠单次灌胃口服Ly-7u制剂的绝对生物利用度研究血浆样本前处理

(1)SD大鼠单次灌胃、静脉注射给药后，依照实验设计采样时间方案，从眼眶静脉丛采血约300μL。血样品置于肝素化EP管中，全血经4000rpm离心5min吸取上层血浆，按100μL分装后于-80℃贮存至测定。

(2)大鼠血浆样品100μL，同实施例1所述的样本前处理方法进行前处理，取上清80μL移入进样瓶中。

2、SD大鼠单次灌胃口服Ly-7u制剂的绝对生物利用度研究血浆样本检测

进样10μL进行UPLC-MS/MS分析，条件同实施例1，根据标准曲线计算血浆样本浓度。

结果显示，口服、静注组SD大鼠血浆中各时间点Ly-7u的浓度如图5所示。