一种测定大鼠姜黄素血浆浓度的UHPLC‑MS/MS分析方法与流程

本发明属于药物动力学分析技术领域。更具体地，涉及一种测定大鼠姜黄素血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析方法。

背景技术：

姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种酚类色素，其中，姜黄约含3%～6%，是植物界很稀少的具有二酮的色素，为二酮类化合物。姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦，不溶于水。姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用，是一种具有良好应用前景的抗癌新药。

药代动力学评估是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化的规律。随着药物化学的发展及人类健康水平的不断提高，对药物的药代动力学性质的要求越来越高：判断一个药物的应用前景特别是市场前景，不单纯是疗效强，毒副作用小；更要具备良好的药代动力学性质。而药物在血浆中浓度的检测技术是药代动力学分析评估的重要前提技术。

目前，姜黄素血浆浓度的常用测定方法为：精密称取姜黄素标准品适量，加入1%羧甲基纤维素钠溶液制得混悬液。取大鼠血浆置于肝素化的离心管中，5000r／min离心10min，吸取上清液置于另一离心管中，贮存于-20℃冰箱，备用。分别精密吸取0.2ml血浆样品，加入0.5ml乙酸乙酯／氯仿（1:1），涡旋混匀即行萃取，12000r／min离心5min，离心后取上清液转移至另一离心管中；再次加入0.5ml乙酸乙酯／氯仿（1:1），重新萃取1次，合并上清液，真空干燥，残渣加200μL甲醇溶解，过滤，取20μL进样。高效液相色谱（HPLC）色谱条件：流动相，乙腈-水（含1%乙酸）=45:55；姜黄素：乙腈-水（含1%乙酸）=70:30；姜黄素检测波长：420nm；流速1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积：20μL；在上述色谱条件下进行测定。该现有技术存在如下缺点：利用HPLC进行大鼠姜黄素血浆浓度测定操作繁琐，进样时间长，定量下限不能满足检测要求等。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种利用超高效液相色谱-质谱联用技术进行的姜黄素血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析方法，对姜黄素及其相关制剂在大鼠血浆内的浓度进行准确测定，得到相应的姜黄素色谱图和离子质谱图，根据分析方法得到数据进行姜黄素的药动学、生物等效性等一系列研究，能达到准确有效地测定大鼠姜黄素血浆浓度的目的。

本发明的目的是提供一种测定大鼠姜黄素血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种测定大鼠姜黄素血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析方法，包括如下步骤：

（1）配制姜黄素标准溶液、内标替硝唑标准溶液，建立标准曲线；

（2）待测血浆中加入内标后，进行前处理，进行LC-MS/MS分析，利用标准曲线计算出待测血浆中姜黄素的浓度。

具体优选地，所述测定大鼠姜黄素血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析方法，包括如下步骤：

S1.建立标准曲线

S11.配制标准溶液：

精密称取姜黄素对照品，溶解于乙腈溶液中震荡摇匀，得1mg/mL的标准储备液，再用甲醇/水=1/1稀释液溶液梯度稀释，得一系列浓度的姜黄素标准溶液；

精密称取替硝唑（Tinidazole）标准品，溶解于90%甲醇水溶液中震荡摇匀，得1mg/mL的母液，再用90%甲醇水溶液稀释成0.2 µg/mL标准溶液；

S12.建立标准曲线

分别取一系列浓度的姜黄素标准溶液，分别加入空白血浆，震荡后，加入内标替硝唑标准溶液，进行样品前处理后，进行UHPLC-MS/MS分析，以不同浓度的姜黄素的峰面积与内标替硝唑的峰面积之比Y 为纵坐标，以姜黄素的血药浓度C为横坐标进行直线回归，建立标准曲线；

S2.样品检测：待测样品前处理后，进行UHPLC-MS/MS分析。

优选地，上文所述前处理的方法为（包括上述步骤（1）、步骤S12和S2中所述前处理）：样品加入内标后，旋涡混匀，加入3～5倍体积的乙酸乙酯，旋涡振荡，静置2～5min后，离心取有机层，室温真空挥干，加入乙腈-醋酸铵溶液溶解，离心取上清，即为供试品溶液，用于UHPLC-MS/MS进样分析。

前处理方法中，优选地，所述样品和内标的体积比为8～12：1（优选10：1）。

优选地，所述旋涡混匀的时间为5～20s（优选60s）。

优选地，所述旋涡振荡的时间为30～90s（优选60s）。

优选地，所述乙腈-醋酸铵溶液为乙腈和10 mM醋酸铵的混合溶液，两者的体积比为8：2。

优选地，所述静置时间为2～5min（优选3min）。

优选地，所述离心的条件均为15000 rpm离心5 min。

更具体优选地，样品前处理方法如下：

血浆样品100 µL，加入相应内标替硝唑溶液10µL，涡旋10s混匀，加入0.5 mL乙酸乙酯，涡旋震荡60 s，静置3 min，15000 rpm离心5 min，吸取400 µL有机层，室温下真空挥干，加入100µL乙腈-10mM醋酸铵（8:2，v/v）溶解，15000 rpm离心5 min，取上清80 µL移入进样瓶中，10 µL进样进行UHPLC-MS/MS分析。

另外，优选地，本发明的UHPLC-MS/MS分析方法中，步骤S12和步骤S2所述UHPLC-MS/MS分析的液质条件如下：

色谱条件：正离子监测：流动相为乙腈：水的体积比=80：20，流速为300µL/min，柱温为室温；分析时间为2.0 min；

质谱条件：离子源为电喷雾电离源（ESI⁺或ESI^-）；电喷雾电压正离子模式为4500 V；加热毛细管温度为350℃；鞘气（N₂）压力为30 psi，辅气（N₂）压力为25 psi，碰撞气（Ar）压力为1.5 mTorr；扫描峰宽为0.5 Th；扫描时间为0.3 s；扫描方式为选择反应监测（SRM），定量监测的母离子、子离子。

优选地，所述流动相中含有10mM醋酸铵。

优选地，步骤S12所述震荡的时间为10～30s（优选20s）。

本发明建立了测定大鼠姜黄素血浆浓度的UHPLC-MS/MS分析分析方法，利用超高效液相色谱-质谱联用技术，对姜黄素原料药及制剂的药代动力学成药性特征进行准确分析。本分析方法能达到灵敏、准确、重复性好的要求，为姜黄素及其类似物、制剂在药代动力学研究中样品的检测提供了可靠的方法。

本发明具有以下有益效果：

本发明对色谱条件、内标物质的选择进行了合理设置，提高了灵敏度，缩短分析时间，并简化样品前处理过程，同时本发明的方法具有高的准确度和精密度，满足了非临床药代动力学研究的检测要求。

附图说明

图1为实施例1建立的检测姜黄素血药浓度的标准曲线。

图2为实施例1建立的姜黄素子离子质谱图。

图3为实施例1建立的姜黄素及内标色谱图。

图4为实施例2建立的姜黄素及内标色谱图。

图5为实施例3建立的测定大鼠单次口服姜黄素制剂后药时曲线图。

图6为实施例3建立的测定大鼠单次静注姜黄素制剂后药时曲线图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明所述的UHPLC-MS/MS为超高效液相色谱-质谱联用技术的简称。

实施例1建立测定血浆中姜黄素浓度的标准曲线

1、标准工作液配制：

（1）姜黄素标准工作液配制：精密称取姜黄素对照品3.47 mg，溶解于1.735 mL乙腈溶液中震荡摇匀，即得1 mg/mL（1000 ng/µL）的标准储备液，再用甲醇/水=1/1稀释液溶液梯度稀释，制备浓度分别为100、10、7.5、5、2.5、0.5、0.25、0.05、0.02、0.01 ng/µL的姜黄素标准溶液。

（2）内标替硝唑（Tinidazole）标准溶液的配制：精密称取替硝唑标准品10.03 mg，溶解于10mL 90%甲醇水溶液中震荡摇匀，即得1mg/mL（1000 ng/µL）的母液，再用90%甲醇水溶液稀释成0.2 µg/mL标准储备液。

2、建立标准曲线

取标准溶液10 µL加入90 µL空白大鼠血浆，震荡20 s，加入替硝唑溶液10 µL，涡旋10 s混匀，加入0.5 mL乙酸乙酯，涡旋60 s，静置3 min，15000 rpm离心5 min，吸取400µL有机层至另一干净1.5 mL离心管中，室温下真空挥干，加入100 µL乙腈-10 mM 醋酸铵（8:2，v/v）溶解，15000 rpm离心5 min，取上清80 µL移入进样瓶中，10 µL进样进行UHPLC-MS/MS分析。

以不同浓度的姜黄素的峰面积与内标替硝唑的峰面积之比Y 为纵坐标，以姜黄素的血药浓度C为横坐标进行直线回归，得回归方程及R²。以信噪比S /N = 3 计，得该方法的最低检测浓度。标准曲线结果如图1所示。

3、设置大鼠血浆样品UHPLC-MS/MS分析方法的液质条件：

色谱条件：正离子监测：流动相为乙腈：水（含10mM醋酸铵）（80：20，v/v），流速为300µL/min，柱温为室温。分析时间为2.0 min。。

质谱条件：离子源为电喷雾电离源（ESI⁺或ESI^-）；电喷雾电压正离子模式为4500 V；加热毛细管温度为350℃；鞘气（N₂）压力为30 psi，辅气（N₂）压力为25 psi，碰撞气（Ar）压力为1.5 mTorr；扫描峰宽为0.5 Th；扫描时间为0.3 s。扫描方式为选择反应监测（SRM），定量监测的母离子、子离子。

结果如图2所示。

4、建立的LC-MS/MS方法的大鼠样本色谱图

（1）选取受试动物Sprague-Dawley大鼠。

给药前禁食12 h，自由饮水。分组后根据姜黄素检测条件和预实验设计的给药方案进行给药。给药后依照实验设计采样时间方案，从眼眶静脉丛采血约300µL。血样品置于肝素化EP管中，全血经4000 rpm离心5 min吸取上层血浆，按100 µL分装后于-80℃贮存至测定。

（2）大鼠血浆样品的预处理：大鼠血浆样品100µL，置于1.5 mL EP管中，加入相应内标替硝唑溶液10µL，涡旋10s混匀，加入0.5 mL乙酸乙酯，涡旋60 s，静置3 min，15000 rpm离心5 min，吸取400 µL有机层至另一干净1.5 mL离心管中，室温下真空挥干，加入100 µL乙腈-10 mM 醋酸铵（8:2，v/v）溶解，15000 rpm离心5 min，取上清80µL移入进样瓶中，10µL进样进行UHPLC-MS/MS分析。

结果如图3所示。

实施例2 加标样品检测

1、加标血浆样本前处理

（1）从空白大鼠眼眶静脉丛采血约300µL。血样品置于肝素化EP管中，全血经4000 rpm离心5 min吸取上层血浆，即空白大鼠血浆，按100 µL分装后于-80℃贮存。

将姜黄素外加入空白大鼠血浆，得到姜黄素浓度为1、2、100、8000 ng/mL的加标血浆样品。

（2）取加标血浆样品100µL，按照实施例1的样本前处理进行处理后，取上清80µL移入进样瓶中。

2、加标血浆样本检测

进样10 µL进行UPLC-MS/MS分析，条件同实施例1。根据标准曲线计算血浆样本浓度为1.0±0.1、2.1±0.2、97±5.6、7931±126.0 ng/mL，其中100ng/mL样本色谱图如图4所示。

表明本测定方法可以很准确的测定分析血浆中姜黄素的浓度，且色谱图中待测物和内标峰形平滑对称，无干扰峰，色谱图稳定可靠，方法高效、稳定，可很好的满足姜黄素药代动力学评估的需要。

实施例3 样本检测

1、SD大鼠单次灌胃口服姜黄素制剂的绝对生物利用度研究血浆样本前处理

（1）SD大鼠单次灌胃、静脉注射给药后，依照实验设计采样时间方案，从眼眶静脉丛采血约300µL。血样品置于肝素化EP管中，全血经4000 rpm离心5 min吸取上层血浆，按100 µL分装后于-80℃贮存至测定。

（2）大鼠血浆样品100µL，同实施例1所述的样本前处理方法进行前处理，取上清80µL移入进样瓶中。

2、SD大鼠单次灌胃口服姜黄素制剂的绝对生物利用度研究血浆样本检测

进样10 µL进行UPLC-MS/MS分析，条件同实施例1，根据标准曲线计算血浆样本浓度。

结果显示，口服、静注组SD大鼠血浆中各时间点姜黄素的浓度如图5、6所示。