一种制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法与流程

本发明属于植物细胞遗传学技术领域，具体涉及一种制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法。

背景技术：

染色体是细胞核中最重要的组成部分，染色体数目和结构的变异为植物育种提供了丰富的遗传资源。根尖细胞有丝分裂中期制片是一项基本的细胞遗传学研究技术和手段，该技术以及以此技术为基础的核型分析和荧光原位杂交等技术在物种鉴定和鉴别、物种间亲缘关系确定、物种倍性鉴定和杂交育种等研究中有广泛的应用。

石刁柏俗名芦笋，隶属于百合科天门冬属，其嫩茎富含氨基酸、蛋白质和维生素等多种营养成分，是世界著名蔬菜之一，在国际上享有“蔬菜之王”的美誉。石刁柏是典型的雌雄异株植物，其遗传组成为2n=2x=20。石刁柏的性别是由性染色体决定的，具有xx性染色体的表现为雌性，而具有xy性染色体的表现为雄性，但是，其x和y染色体为同型的。近年来，对石刁柏的研究主要集中在营养成分、分子生物学研究等方面，对其细胞学的研究相对滞后，这主要是由于石刁柏的细胞质浓厚，细胞壁较坚硬，染色体容易拖尾且染色体较小，很难获得形态清晰、分散良好的分裂相。并且，尽管石刁柏根尖的分生组织区分裂活动比较旺盛，但分裂中期的细胞仅占据很少一部分，大部分细胞仍处于间期，这为获得理想的染色体制片造成了很大障碍，往往需要进行大量的染色体制片才能挑选出少量理想的可用于分析及后期实验的玻片，浪费大量的人力、物力和时间。诱导植物细胞周期同步化可以使处于分裂中期的细胞比例大大增加，使染色体制片的成功率和稳定性大大提高。但是对于石刁柏，甚至天门冬属还没有相关的报道。目前最常用的方法是采用羟基脲（hu）和甲基氨草磷（apm）双阻断法诱导植物细胞有丝分裂同步化，可获得高频率有丝分裂中期指数。但是，hu和apm都有毒性，并且经apm处理后，石刁柏根尖细胞染色体容易拖尾，形态不好，不利于进行后期更深入的研究和分析。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供了一种制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法，其特征在于：采用羟基脲和n2o双阻断法诱导石刁柏细胞进行同步化有丝分裂以获得大量中期分裂相细胞，再经低渗、固定和制片步骤大量获得形态清晰、分散良好且适用于后续细胞学研究的染色体玻片标本。

本发明所述的制备石刁柏根尖细胞染色体中期分裂相标本的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）根尖培养：将石刁柏种子在30℃的水中浸泡24h，再将种子放在铺2-3层用水浸湿的滤纸的培养皿中，然后于25℃培养4天至根长为0.8-1.5cm；

（2）羟基脲处理：在25℃条件下用摩尔浓度为2.5mmol/l的羟基脲处理根长为0.8-1.5cm的石刁柏种子18h；

（3）恢复培养：将羟基脲去除，用清水清洗种子三遍，然后在25℃的清水中培养根尖4-6h；

（4）n2o预处理：切取根尖放入n2o气室中处理1-3h；

（5）低渗：用摩尔浓度为0.075mol/l的kcl溶液处理30-90min；

（6）固定：用体积分数为90%的乙酸冰上固定根尖10min；

（7）滴片：固定后用去离子水冰上水洗10min，然后切取根尖分生组织区，置于质量分数为1%的果胶酶和质量分数为2%的纤维素酶的混合液中，37℃酶解2h，酶解完成后加入te缓冲液反复吹打以去除根冠和根尖外层组织，然后用体积分数为70%的乙醇洗根尖两次，在40μl乙醇中用解剖针捣碎根尖，涡旋悬浮细胞，离心保留沉淀并加入30μl无水乙酸，混匀后吸5-8μl滴片，室温放置5min后即可镜检。

进一步优选，步骤（1）中石刁柏根长优选为1cm。

进一步优选，步骤（3）中清水培养根尖的时间优选为5h。

进一步优选，步骤（4）中n2o的处理压强为1.01mpa，n2o的处理时间优选为2h。

进一步优选，步骤（5）中kcl溶液的处理时间优选为60min。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、使用hu可使细胞阻断在分裂间期，去除hu后进行恢复培养，可诱导细胞进行同步化，经过5h的恢复培养，使大量细胞位于细胞分裂的中期，经预处理、固定及压片后，有丝分裂中期细胞的比例大大增加；

2、本发明采用n2o预处理根尖，可有助于去除细胞质背景，使染色体形态良好，且方法简单，另外，在制片过程中，可显著减少对环境和人体的污染和毒害风险；

3、本发明在n2o处理后增加了低渗步骤，可使染色体分散良好；

4、本发明在根尖酶解后加入te缓冲液反复吹打，可以去除根冠和根尖表面组织，使染色体标本背景清晰，干净无杂质；

5、采用本发明可获得大量的石刁柏中期分裂相，使石刁柏染色体标本制备的成功率大大提高，节省大量的人力、物力和时间；

6、采用本发明的方法可以为石刁柏染色体标本的制备提供便利，对于石刁柏染色体物理图谱构建、遗传育种、性染色体进化研究以及石刁柏属植物的进化研究等具有重要的理论和实践价值。

附图说明

图1为石刁柏根尖同步化后常规压片所观察到的细胞图；

图2为石刁柏根尖未同步化后常规压片所观察到的细胞图；

图3为石刁柏根尖同步化后滴片法所获得的染色体图；

图4为45srdna在石刁柏染色体上的定位图（a为dapi复染的染色体，b为alexafluor-488荧光素标记的45srdna的信号位点，c为合成图）。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

一种诱导石刁柏根尖细胞有丝分裂同步化的方法，包括以下步骤：

1、根尖培养：将石刁柏种子在30℃的水中浸泡24h，再将种子放在铺2-3层用水浸湿的滤纸的培养皿中，然后于25℃培养4天至根长为1cm；

2、羟基脲处理：在25℃条件下用摩尔浓度为2.5mmol/l的羟基脲处理根长为1cm的石刁柏种子18h；

3、恢复培养：将羟基脲去除，用清水清洗种子三遍，然后在25℃的清水中培养种子5h；

4、n2o预处理：切取根尖放入n2o气室中处理2h，该n2o气室内的压强为10atm（1.01mpa）；

5、低渗：用摩尔浓度为0.075mol/l的kcl溶液处理60min；

6、固定：用体积分数为90%的乙酸冰上固定根尖10min；

7、压片：将固定好的根尖水洗后放入离析液（体积比为1:1的浓盐酸和无水乙醇混合液）中离析1.5min，水洗去除离析液后切下2mm长的根尖生长点部分放在载玻片上，充分切碎后滴加改良品红染液染色15min，加上盖玻片进行常规压片；

8、镜检：将玻片置于显微镜下观察，拍照并计算有丝分裂中期分裂相比例。

采用该方法后，如图1所示，石刁柏中期分裂相比例可以达到50%以上，而未经同步化，常规处理所得的石刁柏中期分裂相比例约为1%（图2）。

实施例2

滴片法制备石刁柏中期染色体标本

将同步化处理后的石刁柏根尖切取根尖分生组织区，置于20µl含质量体积分数为1%的果胶酶和质量体积分数为2%纤维素酶的混合液中，于37℃酶解2h。酶解完成后加入te缓冲液反复吹打以去除根冠和根尖外层组织，然后用体积分数为70%的乙醇洗根尖两次，在40μl乙醇中用解剖针捣碎根尖，涡旋悬浮细胞，离心保留沉淀并加入30μl无水乙酸，混匀后吸5-8μl滴片，室温放置5min后即可镜检。镜检良好的片子放紫外交联仪中经过120-125mj/cm²处理2min固定染色体备用。镜检结果如图3所示，石刁柏染色体分散良好，形态清晰，细胞质背景较低。

实施例3

石刁柏中期染色体荧光原位杂交

45s探针标记：将下列组分在冰上加入离心管中：玉米45srdna2µg，10×nicktranslationbuffer2µl，labeled-dntp（texasred-dctp或alexafluor-488-dutp）0.5µl，non-labeled-dntps2µl，dnapolymerasei5µl，dnasei0.5µl，用去离子水补至20µl。混匀后pcr仪中于15℃处理2h，加5×tae+140ng/µl鲑精dna175µl，加入体积分数90%乙醇-体积分数10%乙酸钠500µl，混匀沉淀探针2h以上，然后置于离心机中于13000rpm的离心速率离心30min，无水乙醇洗两遍，避光室温保存30min，加2×ssc1×te20µl溶解沉淀。

荧光原位杂交：配制探针溶液：0.5µl标记好的探针加入5.5µl的2×ssc1×te，将探针溶液滴加在玻片上有细胞的地方，轻轻放上塑料盖玻片。将片子置于铺有湿润纸巾的金属容器中，沸水浴5min，然后将片子放入杂交盒中，55℃杂交3h以上。杂交结束后将片子取出，放入2×ssc中5min，除去盖片。

信号检测：在染色体玻片标本上加20µl含抗淬灭剂的dapi荧光染液，避光染色10min，盖上长盖片（22cm×40cm）后即可在荧光显微镜下进行镜检。镜检采用olympusbx63荧光显微镜，ccd拍照后用metamorph软件进行染色体分析，photoshop进行图像处理。结果如图4所示，通过荧光显微镜可以观察到明亮的杂交信号。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。