基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器及其应用的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及基于双信号放大的新型荧光偏振适配体传感器及其应用。

背景技术：

适配体是功能化的单链DNA或RNA，一般为10～100碱基。适配体可以特异性结合一系列的目标物，如小分子、病毒、蛋白、多肽和病毒等。利用指数富集配基系统进化技术(SELEX)可以从大量随机文库中获得与靶标分子高亲和力结合的适配体。与传统的抗体或者分子印迹聚合物相比，适配体在实际应用中具有易合成、修饰方便、稳定性好以及价格低廉等优点。在靶标分子存在情况下，适配体折叠成发卡环、臂环结构、G4连体等结构特异性识别目标。目前为止，上百种目标物的适配体已经被报道。为了减小适配体产生的位阻效应，人们设计出截断适配体来提高检测效果。在过去的十几年里，截断适配体与一些新型的材料连用发展成为新型的适配体荧光传感器和电化学传感器。总体上，荧光传感器可以分为signal-on传感器、signal-off传感器、比色法传感器、电化学发光传感器等。总体来说，这些适配体传感器均基于夹心法原理，两条截断适配体同时用于产生信号和捕捉适配体。然而该类夹心法在识别位点数目上有别于传统的夹心法。因为报道过的截断适配体均自组装成整个适配体来结合蛋白，因此报道过的截断适配体只有一个结合位点。

对于大分子量蛋白来说，荧光偏振法不失为一种十分有效的检测手段。荧光偏振法主要基于加入目标分子后引起的复合物转动速率变化原理，复合物分子转动越慢荧光偏振信号越强。在均相溶液中，荧光偏振法以准确性、简便性、快速、自动化以及高通量检测著称。直接荧光偏振检测法会产生一定的背景和有限的信号强度，因此其检测效果远不如其他方法好。信号扩增方法包括结构转变、重量扩增以及目标引起的替换方法被广泛采用。但是现有的方法并不能完全满足现代检测的要求，我们需要发展更多的荧光偏振信号放大方法来提高信号、降低背景。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供基于双信号放大的新型荧光偏振适配体传感器，以解决现有技术中荧光偏振检测法会产生背景信号、干扰检测的问题。

本发明还要解决的技术问题是提供上述基于双信号放大的新型荧光偏振适配体传感器在检测乳铁蛋白含量中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器，包括信号产生探针和捕获探针：

所述的信号产生探针的核苷酸序列为如下序列中的任意一种或几种：

DNA-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，

DNA-3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

DNA-5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，

DNA-7，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，

DNA-9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，

DNA-11，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，

DNA-13，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，

DNA-15，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

所述的捕获探针的核苷酸序列为如下序列中的任意一种或几种：

DNA-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，

DNA-4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，

DNA-6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，

DNA-8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，

DNA-10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，

DNA-12，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，

DNA-14，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

其中，信号产生探针的核苷酸序列优选DNA-11；捕获探针的核苷酸序列优选DNA-12。

基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器，包括信号产生探针和捕获探针，所述信号产生探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

其中，所述信号产生探针的5’端修饰FITC，所述捕获探针的3’端修饰纳米银探针。

本发明通过对乳铁蛋白适配体进行截断，在不改变适配体高亲和力和特异性的前提下优化了适配体的结构。同时，捕获探针、信号产生探针可以分别结合到乳铁蛋白的两个位点。在该方法中，两段截断适配体分别修饰异硫氰酸荧光素(FITC)和银纳米粒子(Ag₁₀NPs)，加入乳铁蛋白后三者组装成截断适配体-乳铁蛋白的复合物，缩短了Ag₁₀NPs和FITC的空间距离。因此，Ag₁₀NPs可以产生重量扩增效应和荧光表面增强效应，最终引起荧光偏振信号急剧增加。

作为优选，所述的纳米银粒子为Ag₁₀NPs。

基于双信号放大的乳铁蛋白荧光偏振适配体传感器在检测阴性蛋白中的应用在本发明的保护范围之中。

其中，所述的阴性蛋白包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、BSA、酪蛋白、乳铁蛋白，优选乳铁蛋白。

其中，检测时，激发波长为480nm，发射波长为528nm。

有益效果：

本发明以FITC标记的截断适配体为信号产生探针，以Ag₁₀NPs修饰的截断适配体为捕获探针，通过乳铁蛋白与捕获探针、信号产生探针的特异性结合使荧光偏振信号发生改变，且乳铁蛋白浓度对数值与荧光偏振信号呈线性变化，从而实现对乳铁蛋白的定量检测。该种荧光偏振法灵敏度极高，抗干扰性非常强，可以快速高通量检测，并实现了复杂样品中乳铁蛋白的测量，该方法检测的线性范围为0.2ng/mL～25μg/mL，该传感器相对于传统的均相溶液检测限可以降低三个数量级，达到1.25pM。

附图说明

图1基于截断适配体和Ag₁₀NPs双信号放大荧光偏振适配体传感器原理图；

图2不同碱基数截断适配体荧光偏振信号图；

图3截断适配体结构优化荧光偏振信号图；

图4双结合位点验证荧光偏振信号图；

图5 Ag₁₀NPs表面修饰探针数优化图(a)和Ag₁₀NPs信号放大验证图(b)；

图6截断适配体传感器对乳铁蛋白检测特异性检测图(a)和线性图(c)，A4适配体对乳铁蛋白线性检测图(b)；

图7截断适配体传感器对奶粉样品实际检测图美赞臣(a)、贝因美(b)、康克莱加标法线性检测图(c)，三种奶粉样品实际检测表(d)；

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：最佳适配体截断位点分析

将之前筛选出的适配体A4SEQ ID NO.16：AGGCAGGACACCGTAACCGGTGCATCTATGGCTACTAGCTCTTCCTGCCT分别在15、25、35碱基处截断得到三组截断适配体：DNA-1(15碱基)和DNA-2(35碱基)、DNA-3(25碱基)和DNA-4(25碱基)、DNA-5(35碱基)和DNA-6(15碱基)。DNA-1、DNA-3和DNA-5均修饰FITC。将10μL、250μM三组截断适配体分别与1μg/mL乳铁蛋白标准样品混合，37℃下反应30min，用酶标仪检测，激发波长为480nm，发射波长为528nm，最终得到最佳截断适配体；

图2为不同碱基数截断适配体荧光偏振信号图。由该图可知DNA-3和DNA-4信号最高，且明显高于完整适配体Lac-A4，背景也有一定的降低，因此选取截断适配体DNA-3和DNA-4做进一步研究。

实施例2：截断适配体优化

将得到的截断适配体结构不断优化。分别去掉截断适配体3、5、7对杂交碱基对得到三对截断适配体：DNA-7和DNA-8、DNA-9和DNA-10、DNA-11和DNA-12。四组10μL、250μM截断适配体分别与90μL、1μg/mL乳铁蛋白标准样品混合，37℃下反应30min，用酶标仪检测。

图3为截断适配体结构优化荧光偏振信号图。从该图可以看出，随着两个截断适配体互补碱基对之间减小，其荧光偏振信号逐渐升高，当完全去掉互补碱基对时候信号最高，且背景也随着互补碱基对减少而降低，说明在该截断适配体结构中，其中的互补链是无用的，最终得到最优化的截断适配体DNA-11和DNA-12。

实施例3：双结合位点验证

分别破坏最佳截断适配体DNA-11和DNA-12的臂环结构得到DNA-13和DNA-14。10μL、250μM DNA-13、DNA-14与90μL、1μg/mL乳铁蛋白标准样品混合，37℃下反应30min，用酶标仪检测。比较前后信号的变化。之后将两个截断适配体均标记FITC，即DNA-11和DNA-15，比较其各自产生的信号以及混合后产生的信号，得出结论。

图4双结合位点验证荧光偏振信号图。首先分别去掉DNA-11和DNA-12的臂环结构时，其信号均有明显的降低，说明DNA-11和DNA-12的臂环结构在结合乳铁蛋白时是很重要的，是其臂环结构起到特异性识别蛋白的作用。其次，DNA-11和DNA-15其单独作用时的信号明显低于混合时候信号，因为DNA-11和DNA-15相对于乳铁蛋白是远远过量的，在混合溶液中信号的明显升高只能是DNA-11和DNA-15结合在了不同的位点，二者共同作用使信号值升高。

实施例4：信号扩增策略

优化的截断适配体DNA-11的5’端修饰FITC，DNA-12的3’端修饰Ag₁₀NPs，在10μL、250μM截断适配体混合溶液中加入90μL、1μg/mL乳铁蛋白标准样品，混匀，37℃下反应30min，用酶标仪检测，激发波长为480nm，发射波长为528nm。在Ag₁₀NPs表面分别修饰25、50、100、200条DNA-12核酸链，和DNA-11混合后加入90μL、1μg/mL乳铁蛋白标准样品比较其信号高低。

图1为基于截断适配体和银纳米粒子双信号放大荧光偏振适配体传感器原理图；

图5Ag₁₀NPs表面修饰探针数优化图(a)和Ag₁₀NPs信号放大验证图(b)；

实施例5：荧光偏振法对乳铁蛋白特异性检测

(1)在五份10μL,250nM FITC标记的DNA-11、10μL,250nM Ag₁₀NPs修饰的DNA-12混合溶液中分别加入90μL 5μg/mL的乳铁蛋白、90μL 200μg/mL α-乳白蛋白、90μL 200μg/mLβ-乳球蛋白、90μL 200μg/mL BSA和90μL PBS溶液，充分混匀。

(2)将步骤(1)的混合液置于96微孔板中37℃条件下反应15min，用BioTeK酶标仪直接扫描，激发波长为480nm，发射波长为528nm。

图6(a)为该种荧光偏振法对乳铁蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、BSA的特异性检测图。

实施例6：不同浓度乳铁蛋白与荧光偏振信号关系

(1)在10μL,250nM FITC标记的Lac-A4溶液中分别加入90μL浓度为25ng/mL、49ng/mL、98ng/mL、195ng/mL、390ng/mL、780ng/mL、1.56μg/mL、3.12μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL的乳铁蛋白标准样品，充分混匀。

(2)将步骤(1)的混合液置于96微孔板中37℃条件下反应15min，用BioTeK酶标仪直接扫描，激发波长为480nm，发射波长为528nm。

(3)通过分析，发现分析荧光偏振信号随乳铁蛋白浓度的对数值呈线性变化，得到标准曲线。

图6(b)适配体Lac-A4对乳铁蛋白检测线性图。随着乳铁蛋白含量的增加，荧光偏振信号也逐渐增加，且荧光偏振信号差值与乳铁蛋白浓度对数之间呈现出很好的线性关系，其线性范围为780ng/mL-25μg/mL，检测线为390ng/mL。

实施例7：不同浓度乳铁蛋白与荧光偏振信号关系

(1)在10μL,250nM FITC标记的DNA-11、10μL,250nM Ag₁₀NPs修饰的DNA-12混合溶液中分别加入90μL浓度为0.2ng/mL、0.39ng/mL、0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.12ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、49ng/mL、98ng/mL、195ng/mL、390ng/mL、780ng/mL、1.56μg/mL、3.12μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL的乳铁蛋白标准样品，充分混匀。

(2)将步骤(1)的混合液置于96微孔板中37℃条件下反应15min，用BioTeK酶标仪直接扫描，激发波长为480nm，发射波长为528nm。

(3)通过分析，发现分析荧光偏振信号随乳铁蛋白浓度的对数值呈线性变化，得到标准曲线。

图6(c)截断适配体传感器对乳铁蛋白检测线性图。随着乳铁蛋白含量的增加，荧光偏振信号也逐渐增加，且荧光偏振信号差值与乳铁蛋白浓度对数之间呈现出很好的线性关系，相关性为0.998。其线性范围为0.2ng/mL-25μg/mL，检测线为0.1ng/mL。且与实例6相比，其检测线降低了三个数量级。

实施例8：检测实际样品中乳铁蛋白含量的方法

(1)将不含有乳铁蛋白的美赞臣、贝因美、康克莱的奶粉样品稀释100倍，分别加入乳铁蛋白标准样品配制成0.2ng/mL、0.39ng/mL、0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.12ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、49ng/mL、98ng/mL、195ng/mL、390ng/mL、780ng/mL、1.56μg/mL、3.12μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL样品，分别加入10μL,250nM FITC标记的DNA-11、10μL,250nM Ag₁₀NPs修饰的DNA-12混合溶液，充分混匀；

(2)将步骤(1)的混合液置于96微孔板中37℃条件下反应15min，用BioTeK酶标仪直接扫描，激发波长为480nm，发射波长为528nm；

(3)根据信号和浓度值绘制标准曲线；

(4)将含有乳铁蛋白的美赞臣、贝因美、康克莱的奶粉样品稀释100倍，分别带入到(1)体系中，根据所得信号值对比标准曲线得到牛奶样品中乳铁蛋白的检测浓度。

图7截断适配体传感器对奶粉样品实际检测图美赞臣(a)、贝因美(b)、康克莱加标法线性检测图(c)，三种奶粉样品实际检测表(d)；

本发明将截断适配体应用于荧光偏振分析方法中，发明了一种基于双信号放大的新型荧光偏振适配体传感器。当乳铁蛋白的浓度在0.2ng/mL～25μg/mL之间时，荧光偏振信号强度与乳铁蛋白浓度的对数之间具有很好的相关性，相关系数为0.998。同时，本发明发现了具有双结合位点的适配体，可以在不改变适配体高亲和力和特异性的前提下作为截断适配体使用，特别在夹心法方面具有很好的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京大学

<120> 基于双信号放大的荧光偏振适配体传感器及其应用

<130> SG20170205001

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> 适配体A4

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