本发明涉及糖基化蛋白的样品预处理，具体地说是一种基于均相反应系统的糖基化蛋白样品预处理方法。
背景技术：
蛋白质的翻译后修饰(ptms)是近年来蛋白质组学研究的热点。蛋白质糖基化修饰是最常见，也是最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一。它在很多重要的生命活动过程中起着关键的调节作用。此外，许多疾病的诊断标记物及治疗的靶标都来自于糖基化蛋白。因此，研究蛋白质的糖基化修饰对于疾病的诊断以及治疗具有十分重要的意义。
目前，蛋白的糖基化以及糖基化位点的研究主要依赖于质谱分析技术(ms)。然而糖基化蛋白较低的丰度导致酶解后糖基化多肽的质谱信号就会受到非糖基化多肽的干扰抑制。所以，在质谱鉴定之前，将糖基化多肽从生物样品中选择性地高效地富集出来是非常重要的样品预处理过程。
当前，糖基化多肽的富集方法主要有凝集素法、肼化学反应法、硼酸亲和色谱法和亲水相互作用色谱法。其中，一种凝集素只能选择性地富集某一种糖型的糖基化多肽；肼化学法操作繁琐，破坏了糖结构；硼酸亲和色谱法则由于亲和作用比较弱，限制了其在微量生物样品中的应用。亲水相互作用色谱法利用材料和糖结构的亲水相互作用实验对糖基化肽段的富集。并且该方法操作简单，不会破坏糖结构。但是，目前所用富集方法都是基于非均相作用体系。由于非均相体系固有的传质速率慢的特性，目前存在的富集方法的富集效率有待提高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于均相反应系统的糖基化蛋白样品预处理方法。
为实现上述目的，申请人在了解了传统亲水相互作用色谱法预处理糖基化蛋白质样品原理的基础上，合成了具有易分离、水溶性的金纳米簇材料，并结合均相作用体系实现了糖基化蛋白样品的预处理。
一种基于均相反应系统的糖基化蛋白样品预处理方法，该方法为：将水溶性的金纳米簇材料溶解到去离子水中形成均相反应系统，利用该均相反应系统对酶解后的糖基化多肽进行富集，最后加入一定浓度的三氟乙酸的乙腈溶液将水溶性的金纳米簇材料与糖基化多肽进行“共沉淀”以及分离处理；
所述的水溶性的金纳米簇材料是一种以半胱氨酸为保护基团合成的金纳米簇材料，或用其他的水溶性的金属团簇材料，
所述其他的水溶性的金属团簇材料为谷胱甘肽以及聚乙二醇(peg)作为保护基团的金纳米簇材料。
该方法的具体过程如下：
1)在离心管中配置0.3-0.6mg/ml的金纳米簇材料的水溶液；
2)将上述混合体系常温下超声1-2min使其完全形成均匀的溶液体系；
3)向上述的体系中加入0.8-1.2mg/ml糖基化蛋白酶解液，使金纳米簇材料的水溶液与糖基化蛋白酶解液的体积比为10-30:1,震荡90-120s实现糖肽的富集；
4)向上述体系中以滴加的方式加入沉淀液，使沉淀液与金纳米簇材料水溶液的体积比为6-10:1，将材料从体系中分离出来；
5)将步骤4)中得到的材料溶解到水中，使金纳米簇材料的浓度为0.3-0.6mg/ml，震荡；
6)重复步骤4)和步骤5)，次数为1-3次；
7)将步骤6)中得到的材料分散到洗脱液，使金纳米簇材料的浓度为0.6-1.2mg/ml，从而将保留在水溶性的金纳米簇材料上的糖基化肽洗脱下来以便于后续的质谱检测。
所述沉淀液为体积比乙腈：三氟乙酸为99:1的溶液。
所述洗脱液为体积比h2o：乙腈：三氟乙酸为69.9：30：0.1的溶液。
本发明的优点或者有益效果为：基于均相反应系统的糖基化蛋白样品预处理方法大大缩短了糖基化蛋白样品处理的时间，提高了糖基化蛋白样品预处理速度，实现了高选择性和高特异性的糖基化肽段的富集及处理。在处理复杂的蛋白样品方面，该均相反应系统可以实现对非糖基化肽段的干扰的排除以及糖基化肽段的优良富集及处理。
附图说明
图1为基于均相作用系统的糖基化蛋白样品预处理方法示意图。
图2为基于均相作用系统的糖基化蛋白样品预处理方法用于分析标准糖蛋白(实施例1)的maldi-tofms图。糖基化多肽的峰已标出。(a)糖蛋白样品酶解液的质谱图；(b)洗脱液1的质谱图；(c)洗脱液2的质谱图。
图3为基于均相作用系统的糖基化蛋白样品预处理方法用于分析标准糖蛋白(实施例2)的maldi-tofms图。糖基化多肽的峰已标出。(a)糖蛋白样品酶解液的质谱图；(b)洗脱液1的质谱图；(c)洗脱液2的质谱图。
图4为基于均相作用系统的糖基化蛋白样品预处理方法用于分析标准糖蛋白(实施例3)的maldi-tofms图。糖基化多肽的峰已标出。(a)糖蛋白样品酶解液的质谱图；(b)hrp洗脱液1的质谱图；
具体实施方式
本发明方法的最大特征在于：引入了均相作用体系，利用金纳米簇材料的水溶性，提高了材料与糖基化多肽的相互作用速度，短时间内实现糖基化肽段的富集。下面通过两个实例介绍具体实施方式。
实施例1
基于均相作用体系的糖基化蛋白预处理方法分析标准糖蛋白样品
糖蛋白样品酶解液的制备:将1mg人血清免疫球蛋白(igg)加入到1ml0.1m的碳酸氢胺/8m尿素溶液(ph8.2)、20μl1m二硫苏糖醇(dtt)，混匀后在37℃中反应2h。在上述溶液中加入7.2mg碘代乙酰胺(iaa)，在室温避光条件下反应40min。再加入40μl(40μg)胰蛋白酶溶液后，体系在37℃中反应16h。所得溶液通过spe柱进行除盐。获得的糖蛋白样品酶解液置于-30℃冰箱中保存备用。
基于均相作用体系的糖基化蛋白预处理及maldi-tofms分析：
1、向离心管中加入0.3mg/ml的金纳米簇材料的水溶液；
2、将上述混合体系常温下超声1-2min使其完全形成均匀的溶液体系；
3、向上述的体系中加入1mg/ml糖基化蛋白酶解液，使金纳米簇材料的水溶液与糖基化蛋白酶解液的体积比为10:1,震荡90-120s实现糖肽的富集；
4、向上述体系中以滴加的方式加入沉淀液，使沉淀液与金纳米簇材料水溶液的体积比为9:1，将材料从体系中分离出来；
5、将步骤4)中得到的材料溶解到水中，使金纳米簇材料的浓度为0.3mg/ml，震荡；
6、重复步骤4)和步骤5)，次数为1-3次；
7、将步骤6)中得到的材料分散到洗脱液，使金纳米簇材料的浓度为0.6mg/ml，从而将保留在水溶性的金纳米簇材料上的糖基化肽洗脱下来以便于后续的质谱检测。
8、将洗脱液1冻干处理后利用20μl10mm碳酸氢胺缓冲液(其中含有100upngasef)进行去糖基化,记为洗脱液2。将上述洗脱液直接用maldi-tof质谱进行检测分析。
所有的maldi-tof质谱分析都在absciex5800飞行时间质谱仪上完成。
分析结果：由图2b可见，igg的糖基化多肽很好得富集并鉴定到，非糖基化多肽基本都被去除掉。由图2c可见，通过加入含pngasef的缓冲液，均相作用体系富集到的糖基化多肽能够完全地被去糖基化，溶液中只含去糖基化的多肽。以上结果说明该均相作用体系能很好地用于糖基化蛋白样品的预处理和分析。
实施例2
基于均相作用体系的糖基化蛋白预处理方法分析标准糖蛋白样品
糖蛋白样品的制备:将1mg人血清免疫球蛋白(igg)加入到1ml0.1m的碳酸氢胺/8m尿素溶液(ph8.2)、20μl1m二硫苏糖醇(dtt)，混匀后在37℃中反应2h。在上述溶液中加入7.2mg碘代乙酰胺(iaa)，在室温避光条件下反应40min。再加入40μl(40μg)胰蛋白酶溶液后，体系在37℃中反应16h。所得溶液通过spe柱进行除盐。获得的糖蛋白样品酶解液置于-30℃冰箱中保存备用。
基于均相作用体系的糖基化蛋白预处理及maldi-tofms分析：
1、向离心管中加入0.5mg/ml的金纳米簇材料的水溶液；
2、将上述混合体系常温下超声1-2min使其完全形成均匀的溶液体系；
3、向上述的体系中加入1mg/ml糖基化蛋白酶解液，使金纳米簇材料的水溶液与糖基化蛋白酶解液的体积比为13:1,震荡90-120s实现糖肽的富集；
4、向上述体系中以滴加的方式加入沉淀液，使沉淀液与金纳米簇材料水溶液的体积比为9:1，将材料从体系中分离出来；
5、将步骤4)中得到的材料溶解到水中，使金纳米簇材料的浓度为0.5mg/ml，震荡；
6、重复步骤4)和步骤5)，次数为1-3次；
7、将步骤6)中得到的材料分散到洗脱液，使金纳米簇材料的浓度为1.0mg/ml，从而将保留在水溶性的金纳米簇材料上的糖基化肽洗脱下来，记为洗脱液1。
8、将洗脱液1冻干处理后利用20μl10mm碳酸氢胺缓冲液(其中含有100upngasef)进行去糖基化,记为洗脱液2。将上述洗脱液直接用maldi-tof质谱进行检测分析。
所有的maldi-tof质谱分析都在absciex5800飞行时间质谱仪上完成。
分析结果：由图3b可见，igg的糖基化多肽很好得富集并鉴定到。由图3c可见，通过加入含pngasef的缓冲液，均相作用体系富集到的糖基化多肽能够完全地被去糖基化，溶液中只含去糖基化的多肽。以上结果说明该均相作用体系能很好地用于糖基化蛋白样品的预处理和分析。
实施例3
基于均相作用体系的糖基化蛋白预处理方法分析标准糖蛋白样品
糖蛋白样品的制备:将1mg辣根过氧化酶(hrp)加入到1ml0.1m的碳酸氢胺/8m尿素溶液(ph8.2)、20μl1m二硫苏糖醇(dtt)，混匀后在37℃中反应2h。在上述溶液中加入7.2mg碘代乙酰胺(iaa)，在室温避光条件下反应40min。再加入40μl(40μg)胰蛋白酶溶液后，体系在37℃中反应16h。所得溶液通过spe柱进行除盐。获得的糖蛋白样品酶解液置于-30℃冰箱中保存备用。
基于均相作用体系的糖基化蛋白预处理及maldi-tofms分析：
1、向离心管中加入0.6mg/ml的金纳米簇材料的水溶液；
2、将上述混合体系常温下超声1-2min使其完全形成均匀的溶液体系；
3、向上述的体系中加入1mg/ml糖基化蛋白酶解液，使金纳米簇材料的水溶液与糖基化蛋白酶解液的体积比为30:1,震荡90-120s实现糖肽的富集；
4、向上述体系中以滴加的方式加入沉淀液，使沉淀液与金纳米簇材料水溶液的体积比为9:1，将材料从体系中分离出来；
5、将步骤4)中得到的材料溶解到水中，使金纳米簇材料的浓度为0.5mg/ml，震荡；
6、重复步骤4)和步骤5)，次数为1-3次；
7、将步骤6)中得到的材料分散到洗脱液，使金纳米簇材料的浓度为1.0mg/ml，从而将保留在水溶性的金纳米簇材料上的糖基化肽洗脱下来，记为洗脱液1。
8、将上述洗脱液直接用maldi-tof质谱进行检测分析。
所有的maldi-tof质谱分析都在absciex5800飞行时间质谱仪上完成。
分析结果：由图4b可见，hrp的糖基化多肽很好得富集并鉴定到，非糖基化多肽基本都被去除掉。
实施例4
基于均相作用体系的糖基化蛋白预处理方法分析复杂糖蛋白样品
糖蛋白样品的制备:将1mg包含等质量比的辣根过氧化酶(hrp)、人血清免疫球蛋白g(igg)、人转铁蛋白(trf)、牛胎球蛋白(fetuin)、鸡卵清白蛋白(ova)、鸡卵清亲合素(cav)和人酸性糖蛋白(agp)的混合糖蛋白加入到1ml0.1m的碳酸氢胺/8m尿素溶液(ph8.2)、20μl1m二硫苏糖醇(dtt)，混匀后在37℃中反应2h。在上述溶液中加入7.2mg碘代乙酰胺(iaa)，在室温避光条件下反应40min。再加入40μl(40μg)胰蛋白酶溶液后，体系在37℃中反应16h。所得溶液通过spe柱进行除盐。获得的糖蛋白样品酶解液置于-30℃冰箱中保存备用。
基于均相作用体系的糖基化蛋白预处理及maldi-tofms分析：
1、向离心管中加入0.5mg/ml的金纳米簇材料的水溶液；
2、将上述混合体系常温下超声1-2min使其完全形成均匀的溶液体系；
3、向上述的体系中加入1mg/ml糖基化蛋白酶解液，使金纳米簇材料的水溶液与糖基化蛋白酶解液的体积比为13:1,震荡90-120s实现糖肽的富集；
4、向上述体系中以滴加的方式加入沉淀液，使沉淀液与金纳米簇材料水溶液的体积比为9:1，将材料从体系中分离出来；
5、将步骤4)中得到的材料溶解到水中，使金纳米簇材料的浓度为0.5mg/ml，震荡；
6、重复步骤4)和步骤5)，次数为1-3次；
7、将步骤6)中得到的材料分散到洗脱液，使金纳米簇材料的浓度为1.0mg/ml，从而将保留在水溶性的金纳米簇材料上的糖基化肽洗脱下来，记为洗脱液1。
8、将洗脱液1冻干处理后利用20μl10mm碳酸氢胺缓冲液(其中含有100upngasef)进行去糖基化,记为洗脱液2。将洗脱液2直接用液相色谱串联质谱进行检测分析。
所有的液相色谱串联质谱分析都在赛默飞qexactivetm组合型四极杆orbitrap质谱仪上完成。
分析结果：由表1可见，七种标准糖蛋白的糖基化多肽很好得富集并得到了鉴定。
表1为基于均相作用系统的糖基化蛋白样品预处理方法从复杂糖蛋白样品中鉴定到的糖基化多肽及糖基化位点。