一种测定天然水体中悬浮分散富勒烯浓度的方法与流程

本发明属于环境科学与技术领域，具体涉及一种利用双波长紫外分光光度法分析天然水体中悬浮分散富勒烯（c60）浓度的方法。

背景技术：

富勒烯（c60）是第一种人工合成的纳米材料，被誉为“21世纪材料的先驱”。因其独特的微纳结构和优良的力学、电光学和化学性能而备受关注，已成为电子、化工、冶金、宇航、军事、环境保护、医学和生物工程等众多领域被广泛研究和应用的新型纳米材料之一。当前，富勒烯正从最初的高端应用逐渐进入人们的生活中，将给人类生活带来了巨大的变革。但同时，富勒烯在制备、使用及废弃的全生命周期过程中均有可能进入水环境，使其在水体中的分布数量快速上升。当富勒烯进入水环境后，天然水体中所含的各类杂质，特别是其中普遍存在的天然有机物质，会吸附于富勒烯（c60）表面，并通过增加空间位阻和改变富勒烯表面荷电性质等作用，而促进其在水中的分散，并长期稳定停留在水环境中。近期的毒理学研究发现，富勒烯具有侵入生物体的能力，并对水生生物、植物、动物和人体细胞具有急慢性毒性。因此，其潜在的生态环境负效应已引起了人们的高度关注，并成为当前环境科学领域的研究热点。而天然水体中稳定分散的富勒烯（c60）含量的测定则是其水环境行为和毒理学研究的基础。

现有水中富勒烯（c60）浓度的测定方法主要有总有机碳（toc）法、液相色谱/质谱（lc/ms）联用的方法、重量法和紫外分光光度法等。

chenkl等人(langmuir，2006，aggregationanddepositionkineticsoffullerene(c60)nanoparticles)采用总有机碳（toc）分析仪通过高温氧化的方法测定富勒烯（c60）稳定分散水溶液的浓度。但该方法无法去除吸附在富勒烯上的有机溶剂或杂质因高温氧化而形成toc干扰，使得测定结果偏高。

chenz等人(environmentaltoxicologyandchemistry，2008，quantificationofc60fullereneconcentrationsinwater)采用液相色谱/质谱（lc/ms）联用的方法测定富勒烯（c60）稳定分散水溶液的浓度。但该方法使用了昂贵的大型仪器—lc/ms联用仪，并且样品需要采用复杂的固相萃取（spe）预处理操作，难以满足常规分析的需要。

刘信勇等人（中国科技论文在线，2009，人工碳纳米材料悬浊液的制备及其浓度测定方法）采用重量法测定富勒烯（c60）稳定分散水溶液的浓度。但该方法涉及繁琐的过滤、恒重过程，易引入外源误差，对于本来就微量存在于水中富勒烯，其测定的准确度和精密度难以得到保障。

lyondy等人（environmentalscience&technology，2006，antibacterialactivityoffullerenewatersuspensions:effectsofpreparationmethodandparticlesize）利用富勒烯（c60）易溶于甲苯，及富勒烯—甲苯溶液在紫外波长下具有特征吸收峰（334～336nm）的特性，采用甲苯萃取—紫外分光光度法测定富勒烯（c60）稳定分散水溶液的浓度。此方法无需昂贵的大型仪器，可满足大批量样品的常规检测需要，已成为目前富勒烯（c60）稳定分散水溶液最为常用的浓度测定方法。方华等人（一种测定c60稳定分散水溶液浓度的方法，cn201310690580.7）则以此方法为基础，提出了改进的紫外分光光度法，并提高了该方法的准确度和精密度。张波等人（一种水介质中c60纳米晶体颗粒浓度测定的方法，cn201204581210.6）采用了改进的脱稳剂，保证了紫外分光光度法在表面活性剂存在下可正常进行。但这类测定方法均存在着的将水样中富勒烯（c60）通过液液萃取进入甲苯、并进行有机相分离的步骤，操作较繁琐、历时长，对分析人员的实验技能要求较高，不同操作者间的分析结果存在着明显的差异。

总体来看，上述方法或步骤繁琐、准确度精密度低；或需要大型高值仪器，不能满足常规检测需要。另一方面，现有方法均是以人工配制的富勒烯（c60）稳定悬浮液为对象，测定其中所含的富勒烯（c60）含量；针对富勒烯（c60）进入水环境后，在天然有机物作用下，存在于天然水体中悬浮分散的富勒烯（c60）浓度并无对应的方法进行快速、准确地测定。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能快速、准确测定天然水体中悬浮分散的富勒烯浓度的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种测定天然水体中悬浮分散富勒烯浓度的方法。该方法包括以下步骤：

（1）建立富勒烯-甲苯溶液标准工作曲线；

（2）根据步骤（1）建立的富勒烯-甲苯溶液标准工作曲线，采用甲苯萃取-紫外分光光度法测定富勒烯稳定分散水溶液的标准浓度；

（3）将步骤（2）中已测定浓度的富勒烯稳定分散水溶液分别稀释成不同浓度，并加入等量的代表性天然有机物，制得不同浓度的模拟天然水体富勒烯悬浮分散液，采用双波长紫外分光光度法，建立模拟天然水体富勒烯浓度标准工作曲线；

（4）根据步骤（3）建立的模拟天然水体富勒烯浓度标准工作曲线，计算待测天然水体中悬浮分散富勒烯的浓度。

其中，步骤（3）中加入的代表性天然有机物为腐殖酸，制得的模拟天然水体富勒烯悬浮分散液中腐殖酸浓度为2mg/l。

步骤（3）中建立模拟天然水体富勒烯浓度标准工作曲线时，根据各模拟天然水体富勒烯悬浮分散液中富勒烯浓度和对应的吸光度差值δa进行线性拟合；当在λ1=265nm和λ2=344nm处进行双波长紫外分光光度法测定时，δa=a2-0.4a1；当在λ1=285nm和λ2=344nm处进行双波长紫外分光光度法测定时，δa=a2-0.5a1；当在λ1=295nm和λ2=344nm处进行双波长紫外分光光度法测定时，δa=a2-0.6a1；当在λ1=305nm和λ2=344nm处进行双波长紫外分光光度法测定时，δa=a2-0.7a1；所述a1为各模拟天然水体富勒烯悬浮分散液在λ1处对应的紫外吸光度，a2为各模拟天然水体富勒烯悬浮分散液在λ2处对应的紫外吸光度。

步骤（3）中建立模拟天然水体富勒烯浓度标准工作曲线的优选方案为：分别测定各模拟天然水体富勒烯悬浮分散液在λ1=285nm和λ2=344nm处对应的紫外吸光度a1和a2，计算吸光度差值δa=a2-0.5a1，然后根据各模拟天然水体富勒烯悬浮分散液中富勒烯浓度和对应的吸光度差值δa进行线性拟合。

建立的模拟天然水体富勒烯浓度标准工作曲线为y=31.2156x-0.3899；式中，x为各模拟天然水体富勒烯悬浮分散液对应的吸光度差值δa，y为各模拟天然水体富勒烯悬浮分散液中富勒烯浓度。

步骤（1）中建立富勒烯-甲苯溶液标准工作曲线时，以富勒烯-甲苯溶液的浓度和在336nm处对应的吸光度进行线性拟合。

步骤（2）采用甲苯萃取-紫外分光光度法测定富勒烯稳定分散水溶液的标准浓度的具体步骤如下：取富勒烯稳定分散水溶液5ml于玻璃瓶中，加入0.1mol/l高氯酸镁溶液2.5ml和甲苯5ml，使富勒烯稳定分散液、高氯酸镁溶液和甲苯的体积比为2:1:2，迅速密封后混合；将盛有混合液的玻璃瓶置于超声波振荡器中超声分散15min，使溶液变为白色乳状液；然后置于振荡器上，以300r/min快速振荡30min，静置10min后得清澈透明双层溶液；将盛有分层溶液的玻璃瓶置于-20℃条件下冷冻60min，使小瓶内水相完全冰冻凝结为固态，而上层含有富勒烯的甲苯相仍保持液态；将上层有机相完全吸出，测定336nm处的紫外吸光度值，并与步骤（1）中建立的富勒烯—甲苯溶液标准工作曲线对照，得到稳定分散水溶液中富勒烯标准浓度。

本发明测定天然水体中悬浮分散富勒烯浓度的具体方法如下：

（1）采用高纯c60（≥99.9%）配制100mg/l富勒烯（c60）—甲苯标准储备液；

（2）分别取不同剂量富勒烯（c60）—甲苯标准储备液，稀释为不同浓度富勒烯（c60）—甲苯标准溶液待用；

（3）在紫外光波长为336nm（特征峰）处测定各标准浓度富勒烯（c60）—甲苯溶液吸光度，对浓度值和对应吸光度值进行线性回归，建立富勒烯（c60）—甲苯溶液标准工作曲线；

（4）采用甲苯萃取—紫外分光光度法测定富勒烯（c60）稳定分散水溶液（市售或自行配置）标准浓度：取富勒烯（c60）稳定分散水溶液5ml于玻璃瓶中，加入0.1mol/l高氯酸镁溶液2.5ml和甲苯5ml，使富勒烯稳定分散液、高氯酸镁溶液和甲苯的体积比为2:1:2，迅速密封后混合；将盛有混合液的玻璃瓶置于超声波振荡器中超声分散15min，使溶液变为白色乳状液；然后置于振荡器上，以300r/min快速振荡30min，静置10min后得清澈透明双层溶液。将盛有分层溶液的玻璃瓶置于-20℃条件下冷冻60min，使小瓶内水相完全冰冻凝结为固态，而上层含有富勒烯的甲苯相仍保持液态；将上层有机相完全吸出，测定336nm处的紫外吸光度值，并与富勒烯（c60）—甲苯溶液标准工作曲线对照，得到稳定分散水溶液中富勒烯标准浓度。

（5）取设定剂量上述已知浓度的富勒烯稳定分散水溶液于5个比色管中，加入适量代表性天然有机物—腐殖酸（ha）溶液，并用超纯水定容稀释2、4、5、10、20倍，混合均匀，制得不同浓度的模拟天然水体富勒烯（c60）悬浮分散液（其中ha的浓度为2mg/l）；在波长285nm（λ1）和344nm（λ2）处分别测定不同浓度富勒烯模拟天然水体分散液的吸光度值，记为a1和a2，并采用公式：δa=a2-0.5a1，计算各个标准浓度模拟液对应的吸光度差值δa；对各个标准富勒烯浓度和对应吸光度差值δa进行线性回归，建立模拟天然水体富勒烯浓度标准工作曲线。

（6）取待测天然水体富勒烯悬浮分散液，分别测定波长285nm和344nm处吸光度值，带入上步所得标准工作曲线中，即可算得该天然水体样品中悬浮分散的富勒烯浓度。

在进行步骤（6）天然水体中悬浮分散富勒烯浓度测定之前，可先检测其中有机物含量，若大于2mg/l，先稀释至2mg/l后进行吸光度测定，代入模拟天然水体富勒烯浓度标准工作曲线，计算结果根据稀释倍数反推出该天然水体样品中悬浮分散的富勒烯浓度；亦可根据水样中天然有机物浓度，调整代表性天然有机物投加量，绘制标准工作曲线用于样品测定。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明通过在水体中加入代表性天然有机物，并通过双波长紫外分光光度计法建立模拟天然水体富勒烯浓度标准工作曲线，以此对天然水体中悬浮分散富勒烯浓度测定，可以有效减少甚至消除天然有机物引起的干扰，便捷、准确地测定天然水体中悬浮分散富勒烯浓度。且在建立模拟天然水体富勒烯浓度标准工作曲线，在进行待测水体富勒烯浓度检测时，不涉及现有紫外分光光度法中必须采用的萃取过程，操作简便、快速，省时省力，并减少了萃取过程带来的系统与人为误差，提高了精密度和准确度。同时，本方法测定无需昂贵的大型仪器，可进行批量测定；所需有机溶剂大幅减少，绿色环保。本发明方法是一种测定天然水体中悬浮分散富勒烯（c60）浓度的有效方法，可促进环境科学与技术领域对富勒烯（c60）的水环境行为和生物毒性研究的深入开展。

附图说明

图1为本发明建立的c60-甲苯标准溶液工作曲线；

图2为本发明建立的模拟天然水体富勒烯浓度标准工作曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细说明。

本发明测定天然水体中悬浮分散富勒烯浓度的方法，具体步骤如下：

（1）称取50mg高纯（≥99.9%）富勒烯（c60）粉末，与甲苯混合，置于摇床中振荡12h，确保c60完全溶解，然后转入500ml容量瓶中，定容并混合均匀，得到浓度为100mg/l的富勒烯（c60）—甲苯标准储备液。

（2）分别量取0.125ml、0.25ml、0.5ml、1ml、1.25ml、2.5ml和5ml的浓度为100mg/l的富勒烯（c60）—甲苯标准储备液加入到25ml比色管中，并用甲苯将各比色管定容至25ml刻度处。则得到一系列的富勒烯（c60）—甲苯标准溶液，其富勒烯（c60）浓度依次为0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、4mg/l、5mg/l、10mg/l和20mg/l。

（3）采用cary50型紫外-可见分光光度计，在紫外光波长336nm（特征峰）处分别测定各个浓度富勒烯（c60）—甲苯标准溶液的吸光度，根据浓度和对应的吸光度值进行线性拟合（如图1所示），得工作曲线y=15.232x-1.9732；式中，x为富勒烯（c60）—甲苯溶液在336nm处的吸光度，y为富勒烯（c60）浓度。

（4）取市售或自制的富勒烯（c60）稳定分散水溶液5ml于玻璃瓶中，加入0.1mol/l高氯酸镁溶液2.5ml和甲苯5ml，使c60稳定分散水溶液、高氯酸镁溶液和甲苯的体积比为2:1:2，迅速密封后混合。

（5）将盛有混合液的玻璃瓶置于超声波振荡器中超声分散15min，使溶液变为白色乳状液，然后置于振荡器上，以300r/min快速振荡30min，静置10min后得清澈透明双层溶液。

（6）将盛有分层溶液的玻璃瓶置于-20℃条件下冷冻60min，使小瓶内水相完全冰冻凝结为固态，而上层含有c60的甲苯相仍保持液态；将上层有机相完全吸出，测定336nm处的紫外吸光度，并与标准曲线对照，可以得到标准稳定分散水溶液中富勒烯（c60）标准浓度。

（7）取12.5ml、6.25ml、5ml、2.5ml和1.25ml上述已知浓度的标准富勒烯（c60）稳定分散水溶液于25ml比色管中，并同步加入适量代表性天然有机物—腐殖酸（ha），后定容至25ml，使原悬浮稳定液稀释2、4、5、10、20倍，并使天然有机物浓度为2mg/l；分别测定344nm（λ2）和285nm（λ1）处的紫外吸光度a2和a1，带入公式δa=a2-0.5a1，计算吸光度差值δa。根据各浓度和对应的吸光度差值δa值进行线性拟合（如图2所示），得天然水体悬浮分散富勒烯（c60）液标准工作曲线y=31.2156x-0.3899；式中，x为含有标准样品在344nm和285nm波长处吸光度值按关系式δa=a2-0.5a1求得的吸光度差值δa，y为富勒烯（c60）浓度。

（8）取待测含有悬浮分散富勒烯（c60）的天然水样，在344nm和285nm处分别测定紫外吸光度值，带入公式：δa=a2-0.5a1，求出吸光度差值δa，根据天然水体悬浮分散富勒烯（c60）液标准工作曲线y=31.2156x-0.3899，即可计算得到待测天然水样中悬浮分散富勒烯（c60）的浓度。

实施例1

采用本发明方法测定含有悬浮分散富勒烯（c60）的某地表水样。该水样通过在某天然地表水样中直接投加富勒烯（c60），并置于磁力搅拌器上快速搅拌1周后静置，上清液用0.22μm微滤膜过滤后制得。取平行样品10份，分别按上述实施方式中步骤（8）中操作，测定吸光度、计算吸光度差值后，代入步骤（7）中所得天然水体悬浮分散富勒烯（c60）液标准工作曲线，计算得到水样中富勒烯（c60）浓度，结果见表1。由表1可知，本发明提出的方法测定样品浓度标准偏差和相对标准偏差小，方法具有较好的精密度。

表1本发明测得水样中富勒烯（c60）浓度

对比实施例1

目前最为常用的富勒烯（c60）稳定分散水溶液浓度测定方法为lyondy等人（environmentalscience&technology，2006，antibacterialactivityoffullerenewatersuspensions:effectsofpreparationmethodandparticlesize）提出甲苯萃取—紫外分光光度法，该方法步骤为：

（1）称取50mg纳米高纯富勒烯（c60）（≥99.9%）粉末，与适量甲苯混合，置于摇床中震荡12h，确保富勒烯（c60）完全溶解，然后转入500ml容量瓶中，定容并混合均匀，得到浓度为100mg/l的富勒烯（c60）—甲苯标准储备液。

（2）分别量取0.125ml、0.25ml、0.5ml、1ml、1.25ml、2.5ml和5ml的浓度为100mg/l的富勒烯（c60）—甲苯标准储备液加入到25ml比色管中，并用甲苯将各比色管定容至25ml刻度处。则得到一系列的富勒烯（c60）—甲苯标准溶液，其富勒烯（c60）浓度依次为0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、4mg/l、5mg/l、10mg/l和20mg/l。

（3）采用cary50型紫外-可见分光光度计，在紫外光波长336nm（特征峰）处分别测定各个浓度富勒烯（c60）—甲苯标准溶液的吸光度，根据浓度和对应的吸光度值进行线性拟合（如图1所示），得工作曲线y=15.232x-1.9732；式中，x为富勒烯（c60）—甲苯溶液在336nm处的吸光度，y为c60浓度。

（4）取待测的富勒烯（c60）稳定分散水溶液4ml于玻璃瓶中，加入0.1mol/l高氯酸镁溶液2ml和甲苯4ml，使富勒烯（c60）稳定分散水溶液、高氯酸镁溶液和甲苯的体积比为2:1:2。

（5）将盛有混合液的玻璃瓶置于振荡器上，以300r/min快速振荡2h。

（6）将盛有分层溶液的玻璃瓶置于-20℃条件下冷冻，直至小瓶内水相完全冰冻凝结为固态，而上层含有富勒烯（c60）的甲苯相仍保持液态；将上层有机相完全吸出，测定336nm处测定紫外吸光度，并与标准曲线对照，可以得到稳定分散水溶液中富勒烯（c60）浓度。

以实施例1中采用的含有悬浮分散富勒烯（c60）的某地表水样为测定对象，取平行样品10份，按上述步骤操作，测定结果见表2。由表2可知，采用甲苯萃取—紫外分光光度法所得样品结果较本发明方法低，这主要是因为萃取过程不能使水相中富勒烯（c60）完全进入甲苯相，造成测定结果偏低；另外采用甲苯萃取—紫外分光光度法所得样品结果偏差较大，表明该方法精密度低。

表2现有甲苯萃取—紫外分光光度法得水样中富勒烯（c60）浓度

实施例2

采用本发明提出步骤（1）—步骤（6），取12.5ml、6.25ml、5ml、2.5ml和1.25ml已知浓度的标准富勒烯（c60）稳定分散水溶液于25ml比色管中，并同步加入适量代表性天然有机物—腐殖酸（ha），后定容至25ml，使原悬浮稳定液稀释2、4、5、10、20倍，并使天然有机物浓度为2mg/l；分别测定344nm（λ2）与255、265、275、285、295和305nm（λ1）处的紫外吸光度值，记为a2与a1，并分别带入公式δa=a2-0.1a1、δa=a2-0.2a1、δa=a2-0.3a1、δa=a2-0.4a1、δa=a2-0.5a1、δa=a2-0.6a1和δa=a2-0.7a1，计算吸光度差值δa。根据各浓度和对应的吸光度差值δa值进行线性拟合，得不同计算条件下天然水体悬浮分散富勒烯（c60）液标准工作曲线，各计算条件下对应相关系数（r²）如表3所示。由表3可知，在①λ1=265nm、δa=a2-0.4a1，②λ1=285nm、δa=a2-0.5a1，③λ1=295nm、δa=a2-0.6a1和④λ1=305nm、δa=a2-0.7a1四种计算条件下，采用双波长法对天然水样中富勒烯浓度和对应的吸光度差值δa值进行线性拟合，均获得了很高的相关系数（r²=0.9999），表明这4种条件下，天然水样中富勒烯浓度和对应的吸光度差值δa高度线性相关。

表3不同条件下线性拟合结果

根据上述初步筛选的双波长法计算条件，进一步计算4种条件计算过程中的δa值，结果见表4所示。由表4可知，在λ1=285nm、δa=a2-0.5a1条件下，δa计算值较高，可使测定过程中方法与器材所引起的系统误差相对较小，因此选为本方法的优化计算条件。

表4不同条件下吸光度差值