一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法及其应用与流程

本发明属于微小隐孢子虫的检测技术领域，具体涉及一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法及其应用。

背景技术：

隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种重要的人兽共患肠道原虫，其宿主范围十分广泛，可感染包括人类在内的哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类等多种脊椎动物，主要寄生于宿主胃肠道上皮细胞内。隐孢子虫多通过受污染的水源和食物等途径传播，由其感染可导致以腹泻为主要临床症状的人兽共患寄生虫病。目前，31个物种被认为是有效的，其中，微小隐孢子虫（C.parvum）是最常见的人兽共患虫种之一，主要引起未断奶犊牛严重腹泻甚至死亡，并可导致包括人在内的多种脊椎动物腹泻。免疫功能健全的宿主感染隐孢子虫后一般表现为自限性的短期急性腹泻；而免疫力低下、免疫功能缺陷或抑制者则通常表现为持久的水样腹泻，导致体液大量丢失而危及生命。在艾滋病病人和儿童中感染率分别高达48%和17.5%，是艾滋病病人的重要致死因素。该病已被确认为引起人腹泻的六大病因之一，并被世界卫生组织（WHO）和美国疾病防控中心（CDC）列入新发传染病。

隐孢子虫病作为一种重要的人兽共患性原虫病，很常见但很难治疗，目前尚无有效的治疗方法，并且其检出率也比较低。关于免疫学检测法主要有免疫荧光技术、酶免疫分析法、免疫印迹法、免疫磁珠分离法、流式细胞仪技术和间接血凝试验等，因特异性高、敏感性强，便于批量检测等优点，被广泛应用于隐孢子虫病诊断中，但是这些方法对于隐孢子虫的检出率比较低，因此建立简便、特异、敏感的免疫学诊断技术，对于人和动物隐孢子虫病的防控具有重要意义。

技术实现要素：

针对当前粪便检测隐孢子虫灵敏度低、费时费力的缺点，本发明提供一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法及其应用。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法，具体步骤如下：

（1）将微小隐孢子虫卵囊反复冻融和超声波裂解后，离心，上清液作为检测性抗原，沉淀作为免疫性抗原；

（2）用免疫性抗原免疫健康成年家兔，制备兔抗微小隐孢子虫血清抗体IgG，并用盐析法纯化IgG；

（3）用免疫性抗原免疫健康产蛋鸡，制备抗微小隐孢子虫卵黄抗体IgY，并用水稀释硫酸铵盐析法纯化IgY；

（4）以IgG为捕获抗体，IgY为检测抗体的夹心ELISA检测步骤：

a. IgG包被：用包被液将纯化后的IgG稀释后包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃下包被1 h后，4℃下过夜，弃去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干；

b. 封闭：每孔加200μL封闭液，37℃下封闭1h后，弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，拍干；

c. 加抗原：将步骤（1）制备的检测性抗原用0.01M PBS稀释，100μL/孔，37℃下反应lh后，甩弃液体，用洗涤液洗涤3次，拍干；

d. 加IgY：将IgY用0.01M PBS稀释，100μL/孔，37℃下孵育30min后，甩弃液体，用洗涤液洗涤3次，拍干；

e. 加酶标抗体：加用0.01M PBS稀释好的HRP标记的羊抗鸡的酶标抗体，100 μL/孔，37℃下作用45min后，甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干；

f. 加底物显色：加TMB显色液，100μL/孔，室温避光作用10 min；

g. 终止反应：加入终止液，50μL/孔，用酶标仪测OD₄₅₀值，计算出P/N值，P/N=（待检样品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值）/（阴性样品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值），若P/N≥2.1，判为阳性，若P/N< 2.1，判为阴性。

步骤（1）中所述微小隐孢子虫卵囊为用微小隐孢子虫感染犊牛进行传代，大量收集粪便并纯化后获得的卵囊。

所述步骤（4）中的c步骤中，检测性抗原稀释后的浓度为2.5μg/mL。

所述步骤（4）中的a步骤中，用包被液将纯化后的IgG稀释800倍。

所述步骤（4）中的d步骤中，将IgY稀释100倍。

所述步骤（4）中的e步骤中，HRP标记的羊抗鸡的酶标抗体稀释5000倍。

所述步骤（4）中，包被液由无水碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加蒸馏水定容至1000mL而得；

洗涤液由氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，吐温-20 0.5mL，加蒸馏水1000mL而得；

封闭液由牛血清蛋白1g，加包被液100mL而得；

终止液由浓硫酸11.1mL，加蒸馏水88.9mL而得；

PBS由NaCl8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄·12H₂O 2.9g，加蒸馏水定容至1000mL而得。

如上述的微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法在检测待检测粪便中微小隐孢子虫中的应用，所述待检测粪便先用饱和蔗糖溶液漂浮法进行处理，再反复冻融和超声波裂解后，离心，得到的上清液作为检测性抗原使用，再用所述步骤（4）中的夹心ELISA方法对检测性抗原进行检测，以确定待检测粪便中是否已感染微小隐孢子虫。

本发明相对于巢式PCR方法，有着耗材少，成本低，操作简便，试验时间短，更适用于大量临床样品的检测等优点。本发明只需要封闭液、底物溶液、PBS溶液等，这些试剂价格较低，试验时只需用到酶标仪；而常规的PCR所需试剂如表8，价格较贵，花费高，试验时要用到振荡器，瞬时离心机，PCR仪器等，耗材多；检测样品时，本发明可以用八道手动移液器，一次性加8个样品，而且检测试验时间大约为3个半小时；而常规的PCR只能用微量移液器，一次性加1个样品，且试验时间长达6个小时左右；如果一个地方发生了微小隐孢子虫病情，用本发明提供的检测方法检测的话只需带上ELISA用试剂和酶标仪即可，但是用常规的PCR的话除了要带去要用的各种试剂，还要带振荡器、瞬时离心机、PCR仪等仪器，所以本发明更适用于大量样品的临床检测。

附图说明

图1是敏感性试验结果。

图2是批内重复性试验结果。

图3是批间重复性试验结果。

图4是巢式PCR方法的检测结果，M：DL2000；P：阳性对照；N：空白对照。83：83号样品DNA PCR产物；84：84号样品DNA PCR产物；85：85号样品DNA PCR产物；86：86号样品DNA PCR产物；101：101号样品DNA PCR产物；102：102号样品DNA PCR产物；103：103号样品DNA PCR产物。

图5是第一组样品的夹心ELISA的检测结果。

图6是第二组样品的夹心ELISA的检测结果。

图7是第三组样品的夹心ELISA的检测结果。

图8是巢式PCR方法的反应程序。

图9是抗原最佳稀释度的确定。

图10是IgY最佳反应时间的确定。

图11是最佳酶标抗体工作浓度的选择。

图12是酶标抗体最佳反应时间的确定。

图13是最佳显色时间的确定。

具体实施方式

包被液由无水碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加蒸馏水定容至1000mL而得；

洗涤液，即PBST，由氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，吐温-20 0.5mL，加蒸馏水1000mL而得；

封闭液由牛血清蛋白1g，加包被液100mL而得；

终止液由浓硫酸11.1mL，加蒸馏水88.9mL而得；

PBS由NaCl8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄·12H₂O 2.9g，加蒸馏水定容至1000mL而得；

TMB显色液：

Buffer A：称取66.5063g柠檬酸钾，用800mL四蒸水溶解并用浓盐酸调节pH值至4.0， 加入314μL H₂O₂，用水定容至1L，4℃保存；

Buffer B：称取0.2956g四甲基联苯胺（TMB），0.0633g四丁基硼氢化铵（TBABH） 溶于30mL二甲基乙酰胺（DMA），4℃避光保存；

使用时，将Buffer A和Buffer B以体积比39：1的比例混合，现配现用。

一、 卵囊的传代和收集

试验犊牛饲养于经甲醛-高锰酸钾熏蒸消毒后，又用汽油火焰喷灯消毒的不锈钢笼中。每天饲喂鲜牛奶3次，每次2000 mL。饲喂到第3d时用饱和蔗糖漂浮法处理粪便，显微镜检查犊牛粪便，隐孢子虫卵囊均为阴性。于3日龄感染纯化的微小隐孢子虫卵囊，本试验将感染剂量调整为1.0×10⁷个。接种卵囊后，每天采集粪便，镜检犊牛粪便是否呈阳性。待检出犊牛粪便呈C. parvum阳性粪便，收集排卵高峰期粪便，7天左右，大量纯化卵囊备用。

二、 检测性抗原和免疫性抗原的制备

将提纯后的卵囊置液氮-196℃和水浴锅37℃反复冻融5次，超声波细胞粉碎仪100HZ 2min×5次破碎后，10000r/min离心15min，其中，上清作为检测性抗原，沉淀作为免疫性抗原。紫外分光光度计测检测性抗原的蛋白含量为1.734mg/mL，-20℃保存备用。

三、家兔的免疫过程和血清的采集和分离

免疫过程：选择4只隐孢子虫检测为阴性的健康成年兔作为试验兔，其中2只不免疫作为对照组。制定免疫程序和剂量，采取长期多次免疫法，制备兔抗C.parvum高免血清。

（1）首免，抗原含量3×10⁷个/只，抗原与等体积油佐剂充分乳化后，背部、颈部皮下多点注射；

（2）二免，14d后将抗原与等体积油佐剂乳化后二免，2×10⁷个/只；背部、颈部皮下多点注射；

（3）三免，14d后按照二免的方法进行三免，2×10⁷个/只；背部、颈部皮下多点注射；

（4）四免，7天后用抗原液腹腔注射加强免疫，1.2×10⁷个/只。

血清的采集：（1）第三次加强免疫注射后7天，从兔子的耳缘静脉处进行采血。让家兔充分运动，这样会使血流加速，血管充盈，方便采血，将耳缘静脉附近的毛剪去用无菌棉球将皮肤擦干净，用1mL注射器抽取血液，分离血清以备检测。

（2）第四次加强免疫后7天、14天，先进行耳缘静脉采血，间接ELISA法测血清效价，抗体水平达到最大值不再变化，此时一次性心脏采血，2.5公斤体重的家兔一次可取血20～30mL。动物于仰卧位固定，用食指探明心脏博动量高部位，在胸骨左侧，由下向上数第3与第4助骨之间，剪去少许毛，用2.5%碘酒和75%酒精消毒后，在预定位置与胸部呈45度角刺入心脏，微微上下移动针头，待见血液进入针筒后，即将注射器位置固定取血。

血清的分离：将采集好的新鲜兔血呈45-60度角在室温下37℃恒温箱静置1h, 将血液移到合适的离心管中，用低速离心机5000r/min离心3-5min，用无菌玻璃吸管吸取上层淡黄色液体即为血清。

四、产蛋鸡的免疫过程和鸡蛋的收集

免疫过程：从郑州市某养鸡场选择并购买8只120日龄开产健康海兰蛋鸡，将这些蛋鸡单独隔离喂养，给予全价营养饲料和日常管理，随机分组，4只用于实验组，4只用于对照组。

（1）首免，免疫抗原加等体积油佐剂，抗原含量为1×10⁷个卵囊/只，翅根部皮下及胸部肌肉多点注射法进行免疫；

（2）二免，14d后二免，抗原含量为2×10⁷个卵囊/只，免疫部位同（1）；

（3）三免，14d后三免，抗原含量为2.5×10⁷个卵囊/只，免疫部位同（1）。

鸡蛋的收集：收集免疫前鸡蛋，作为阴性对照；三免后收集鸡蛋，提取并纯化卵黄抗体，测其效价。

五、兔抗微小隐孢子虫血清抗体IgG的纯化

用盐析法纯化IgG，步骤如下：

（1）取20ml的血清，加入同等体积的生理盐水，缓慢滴加饱和硫酸铵溶液10ml至终浓度为20%，边加边搅拌，充分混匀后静止30min；

（2）4℃ 3000r/min 离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白；

（3）在上清里加入饱和硫酸铵溶液30ml至终浓度为50%，边加边搅拌，充分混匀后静止30min；

（4）4℃ 3000r/min 离心20min，弃去上清；

（5）于沉淀中加入20ml生理盐水，使之溶解，再缓慢滴加饱和硫酸铵溶液10ml至终浓度为33%，充分混匀后，静止30min；

（6）4℃ 3000r/min 离心20min，弃去上清，以除去白蛋白，重复步骤5, 2-3次；

（7）用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋；透析除盐，在三蒸水中透析过夜，再在0.1M，PH=7.4的生理盐水中透析24h，中间换液数次；

（8）离心去沉淀，上清即为提取的IgG。

六、抗微小隐孢子虫卵黄抗体IgY的纯化

采用水稀释硫酸铵盐析法提取，将蛋壳用碘酊擦拭消毒，75%酒精脱碘。蛋黄分离器分离蛋黄，将蛋黄在灭菌滤纸上轻轻滚动，尽量除去卵黄膜。

（1）测量蛋黄体积，加入9倍体积4℃灭菌蒸馏水稀释，搅拌均匀，调节PH值至5.0-5.5间，4℃静置过夜，4℃，l0000 r·min^-1，离心30 min，收集上清液得到粗提物即WSF(水溶性片段water-soluble fraction)；

（2）过滤去除沉淀及漂浮物，滴加等体积饱和硫酸铵溶液使其饱和度达50%，4℃静置4 h，4℃，l0000 r·min^-1，离心30 min弃上清；

（3）用0.9%生理盐水溶解后滴加饱和硫酸铵溶液使其饱和度达33%，4℃静置4 h后，4℃，10000 r·min^-1，离心30 min弃上清；

（4）用原1/2体积0.01 mol/L无菌PBS溶解沉淀，0.9%生理盐水溶液透析去盐，期间换透析液3次，过滤除菌，即为提取的卵黄抗体，如果长期保存，置-20℃冻存。

七、纯化后的IgG和IgY的效价的测定方法

（1）包被抗原（放于湿盒内，4℃包被过夜）：选取96孔可拆卸的U型板，用包被液稀释步骤二中纯化好的检测性抗原，每孔加100μL；

（2）洗涤：用PBST洗涤3次，300μL每孔，每次静止3min，弃去清洗液；

（3）加封闭液，200μL每孔37℃孵育1h后；洗涤：用PBST洗涤3次，300μL每孔，每次静止3min，弃去清洗液。

（4）加一抗：将一抗按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、等依次倍比稀释；将阴性样品也按此倍数稀释后，每孔100μL，放于湿盒内，37℃孵育1.5h（设置4个重复孔）；

（5）洗涤：用PBST洗涤3次，300μL每孔，每次静止3min，弃去清洗液；

（6）加酶标二抗，37℃ 1h；

（7）洗涤：用PBST洗涤3次，300μL每孔，每次静止3min，弃去清洗液；

（8）加入底物液，每孔100μL，显色10-15min，避光；底物A与底物B等体积混合；

（9）终止显色：加入2moL/L H₂SO₄终止反应，每孔50μL；

（10）读数：立即用酶标仪测定其OD₄₅₀值，读数。计算出P/N值，P/N=(待检样品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值)／(阴性样品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值)。若P/N≥2.1，判为阳性；若P/N< 2.1，判为阴性。

八、微小隐孢子虫夹心ELISA检测方法的建立

以纯化过的IgG为捕获抗体，以纯化过的IgY为检测抗体，按照夹心ELISA的操作流程进行各个最优条件的选择，如表2-4和图9-13所示，由方阵滴定结果可知，捕获抗体IgG包被浓度为1:800，检测抗体IgY稀释度为1:100时，OD_450nm接近于1.0，且此时P/N最大，故在ELISA检测方法中IgG包被浓度为1:800，被检样品的稀释倍数为1:200；试验确定抗原最佳稀释浓度为2.5μg/mL；最佳包被条件为37℃作用1 h后4℃过夜；最佳封闭条件为1%明胶作为封闭剂37℃封闭1h；IgY最佳作用时间为37℃孵育30min；酶标抗体最佳作用时间为37℃孵育45min，最佳稀释浓度为1:5000；最佳显色时间室温显色10min；最佳终止条件为2 mol/L H₂SO₄，每孔50µL。

微小隐孢子虫夹心ELISA检测步骤如下：

a. IgG包被：用包被液将纯化后的IgG稀释后包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃下包被1 h后，4℃下过夜，弃去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干；

b. 封闭：每孔加200μL封闭液，37℃下封闭1h后，弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，拍干；

c. 加抗原：将步骤（1）制备的检测性抗原用0.01M PBS稀释，100μL/孔，37℃下反应lh后，甩弃液体，用洗涤液洗涤3次，拍干；

d. 加IgY：将IgY用0.01M PBS稀释，100μL/孔，37℃下孵育30min后，甩弃液体，用洗涤液洗涤3次，拍干；

e. 加酶标抗体：加用0.01M PBS稀释好的HRP标记的羊抗鸡的酶标抗体，100 μL/孔，37℃下作用45min后，甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干；

f. 加底物显色：加TMB显色液，100μL/孔，室温避光作用10 min；

g. 终止反应：加入终止液，50μL/孔，用酶标仪测OD₄₅₀值，计算出P/N值，P/N=（待检样品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值）/（阴性样品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值），若P/N≥2.1，判为阳性，若P/N< 2.1，判为阴性。

九、检测性试验

1、敏感性试验

将微小隐孢子虫抗原从5×10⁵个/mL开始做2倍连续稀释至7.5×10³个/mL，共做7个稀释度，其他条件不变，按照已建立的夹心ELISA操作方法测定OD_450nm值，检测其灵敏度。以出现阳性的最高稀释倍数推算出其最小检出量，结果如图1和表5所示。

将微小隐孢子虫抗原做7个2倍连续稀释，按照已建立的夹心ELISA操作方法测定OD_450nm值，结果显示当抗原含量为1.5×10⁴个/mL时P/N为3.22，依旧为阳性，当抗原为7.5×10³个/mL时，P/N值为1.04，为阴性。故本方法的最低检出量为1.5×10⁴个/mL。

2、特异性试验

对已知的圆线虫虫卵，球虫卵囊，蛔虫虫卵作为抗原作1:100稀释，同时设微小隐孢子虫阳性对照和阴性对照，每份样品重复4孔，然后应用本试验建立的夹心ELISA检测方法进行测定。除阳性对照外，结果均为阴性，说明该夹心ELISA方法具有良好的特异性，结果如表6所示。

3、重复性试验

以批内和批间重复性试验来检验夹心ELISA方法的重复性，随机选取3份样本在不同时间、相同条件下重复做夹心ELISA测定，每个样品重复3次，按照已建立的夹心ELISA操作程序测定，计算同一份样本OD_450nm值的变异系数，比较试验结果。结果如图2, 3和表7所示，随机选取3份样本批内变异系数和批间变异系数在3.88%和8.12%之间，均小于10%，说明此检测方法重复性好。

十、已经建立的夹心ELISA法检测微小隐孢子虫的应用

1. 样品的采集和处理

从长春某养殖场采集猪的粪便样品，共108份。取每份粪样5-10g, 加适量自来水, 搅匀, 铜筛过滤，滤液置离心管中以 3000r/min离心10min，弃去上清。

将上述处理好的粪便样品分四组，分别为一、二、三、四组，每组27份，每份样品均进行人工植入卵囊。第一组用饱和食盐水漂浮法处理，第二组用饱和蔗糖溶液漂浮法，第三组用洗涤剂PBST洗涤处理，第四组不再进行处理直接提取DNA，基于18S扩PCR，电泳检测扩增效果。

第一组对样品进行标记，分别标记为1，2，3....27号，1到19植入浓度从10万个卵囊/mL开始倍比稀释感染15个梯度，即10万，5万，2.5万…到0个卵囊/mL；21到27植入浓度依次为10⁵，10⁴，10³，10² ，10 ¹，10 ⁰ ,10 ^-1个卵囊/mL。

第二组对样品进行标记，分别标记为28，29，30....54号，植入卵囊量同第一组，28到46号同第一组1到19号的卵囊植入量；47到54号同第一组21到27号的卵囊植入量；

第三组对样品进行标记，分别标记为55，56，57....81号，植入卵囊量同第一组，55到73号同第一组1到19号的卵囊植入量；74到81号同第一组21到27号的卵囊植入量；

第四组对样品进行标记，分别标记为82，83，48....108号，植入卵囊量同第一组，82到100号同第一组1到19号的卵囊植入量；101到108号同第一组21到27号的卵囊植入量。

第一组至第三组处理方法如下：

第一组的处理方法：饱和食盐水漂浮法，步骤如下：

（1）每份样品取5mL-6mL处理过的粪便，加水稀释，离心10min，弃上清；

（2）加饱和食盐水至25mL, 搅拌均匀；

（3）离心10min，用吊环蘸取10-15下；

（4）重复步骤（3）；

（5）吊取的液体于10倍的水中稀释，离心浓缩。

第二组的处理方法：饱和蔗糖溶液漂浮法：步骤如下：

（1）每份样品取5mL-6mL处理过的粪便，加水稀释，离心10min，弃上清；

（2）加饱和蔗糖溶液至35mL, 搅拌均匀

（3）离心10min，用吊环蘸取10-15下；

（4）重复步骤（3）；

（5）吊取的液体于10倍的水中稀释，离心浓缩。

第三组的处理方法：PBST洗涤：步骤如下：

（1）每份样品取5mL-6mL处理过的粪便，加水稀释，离心10min，弃上清；

（2）加PBST至35mL，搅拌均匀；

（3）3000r/min离心10min，弃去上清，沉淀用PBS5倍稀释。

上述三组共81份处理过的样品分别置液氮和水浴锅37℃反复冻融5次，超声波细胞粉碎仪（100HZ）2min×5次破碎后，10000r/min离心15min，取上清作为检测性抗原。

第四组样品提取DNA，步骤如下：

（1）取50-100 mg处理过的粪便样品于2mL离心管中，加入200mg玻璃珠，将离心管置于冰上孵育2 min。

（2）添加300μL SP1 Buffer，然后再加入Proteinase K溶液10μL，震荡10 min。

（3）将离心管置于70℃恒温水浴锅中孵育15 min，期间震荡3次，每次30s~1min，以充分混匀样品。

（4）冰上孵育2min。

（5）添加100μL Buffer SP2，震荡30s，充分混匀样品。

（6）冰上孵育5min。

（7）15000r·min^-1离心5min。

（8）小心吸取上清液至1.5mL离心管中，不要触碰沉淀和杂质。

（9）添加200μL HTR Reagent，震荡10s，混匀样品，HTR Reagent用之前必须充分震荡混匀。

（10）室温孵育2min。

（11）15000r·min^-1离心2min。

（12）吸取250μL上清液至新的2.0mL离心管中。

（13）添加250μL BL Buffer，然后再加入250μL无水乙醇，震荡10s。

（14）将第13步的样品全部移入到一个HiBind DNA柱中，直接倒入，将HiBind DNA柱安装在一个2mL的集合管中，15000r·min^-1离心1min，弃掉集合管及废液。

（15）将HiBind DNA柱置于新的集合管中，使用500μL HB Buffer清洗HiBind DNA柱子，15000r·min^-1离心1min，弃掉集合管及废液。

（16）再将HiBind DNA柱子置于新的集合管中，添加750μL DNA Wash Buffer，15000r·min^-1离心1min，弃掉集合管及废液。

（17）将HiBind DNA柱安装到新的集合管中，15000r·min^-1离心2min，以干燥柱子。

（18）将HiBind DNA柱子置于新的1.5mL离心管中，在70℃条件下预热Elution Buffer，添加200μL Elution Buffer以洗脱DNA，室温下浸泡2min，15000r·min^-1离心1min，收集DNA。

2. 处理后的样品中微小隐孢子虫的检测

用步骤八中建立的夹心ELISA法检测已经处理好的第一、二、三组的81份样品，第一组样品的检测结果如图5所示，共检测出6份阳性样品；第二组样品的检测结果如图6所示，共检测出7份样品；第三组样品的检测结果如图7所示，共检测出4份阳性样品。

第4组提取好的DNA样品基于18SrRNA进行PCR扩增，扩增18SrRNA序列的引物：

18S1：TTCTAGAGCTAATACATGCG

18S2：CCCATTTCCTTCGAAACAGGA

18S3：GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG

18S4：CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA

PCR反应程序，如图8所示：

第一次反应：94℃预变性5min；然后35个循环，94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min；最后72℃延伸10min；最后温度降到10℃。

第二次反应：94℃预变性5min；然后35个循环，94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min；最后72℃延伸10min；最后温度降到10℃。

进行PCR反应前，将反应液混合，短暂离心后，置2720Thermal Cycler PCR仪，按程序作热循环反应，结束后样品进行琼脂糖凝胶电泳。

PCR反应体系如表8所示。

基于18s rRNA PCR扩增结果如图4所示，用巢式PCR方法共检测出8份阳性样品。

上述三种处理方法的检测结果与巢式PCR结果比较如表9所示，用巢式ＰＣＲ共检测出８份阳性样品，三种对粪便样品的不同处理方法（饱和蔗糖溶液漂浮法、饱和食盐水溶液漂浮法和PBST洗涤液处理）用建立的夹心ELISA方法分别检测出7份，6份和4份样品，与巢式PCR扩增方法的总符合率分别为95.83%、91.67%和83.33%。由此可知，饱和蔗糖溶液漂浮法处理粪便样品的方法效果更佳，进而用建立好的夹心ELISA检测样品。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。