一种同时快速测定食品中丙酸、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸含量的方法与流程

本发明属于食品添加剂的检测
技术领域：
，具体涉及一种同时快速测定食品中丙酸、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸含量的方法。
背景技术：
：防腐剂是防止食品腐败变质、延长食品储存期的物质，是食品常用的添加剂类别之一。有调查表明：标注添加防腐剂的食品样本占总样本的52.36％，标注添加山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、丙酸及各自对应盐的样本占标注添加防腐剂食品样本的74.29％，排名分别为第一、第二、第四和第七位，说明上述四种物质是我国食品防腐剂中主要添加的品种。大量的资料表明上述四种防腐剂相对较为安全，但过量使用仍会对人体产生一定的伤害，例如会在一定程度上抑制骨骼生长，危害肾、肝脏的健康，导致体重下降、腹泻以及造成胃黏膜永久性损伤等。各国对其在食品中的含量都有严格的规定，在我国现行的《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(gb2760-2014)中对上述四种防腐剂在食品中的含量也有明确规定，属限制使用含量的食品添加剂；一些食品生产厂家和食品手工作坊往往为延长食品保质期，会过量使用或因控制手段不足而过量使用上述四种防腐剂；在2015年的一次市场食品样本抽检中发现上述四种防腐剂的总超标率在6％左右，甚至在一部分未标注上述四种防腐剂的食品中也有对应检出。因此，上述四种防腐剂的检测成了目前食品安全监管必不可少的检测项目。目前检测食品中丙酸、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸及各自对应盐含量的方法主要有气相色谱法、气相色谱质谱联用法、液相色谱法和液相色谱质谱联用法等。其中气相色谱作为我国目前普及率最高的大型仪器，在上述四种防腐剂的检测应用中也最为广泛，方法最易普及。与本专利方法最接近的现有检测方法包括以下步骤：1、称取适量测试样品，加入适量的饱和盐溶液，并加入适量的酸溶液酸化，2、有机溶剂提取、转移3次；3、合并有机溶剂提取液，经两次盐溶液洗涤净化；4、有机溶剂提取液经两次碱和盐的混合溶液再次萃取，保留水相萃取液；5、萃取液加入适量酸溶液酸化，排除反应气体，加入氯化钠饱和；6、上述处理后的溶液经有机试剂振摇提取3次，合并提取液；7、合并后的溶液经无水硫酸钠干燥；8、干燥后的溶液浓缩近干，吹氮气除去残留溶剂；9、残渣用丙酮溶解定容；10、定容后的溶液经气相色谱经氢火焰离子化检测器检测与标准系列对比定性定量。该检测方法的缺陷为：1、样品前处理过程过于复杂、检测效率低下；2、仪器用具多，试剂用量大，造成检测成本高、环境污染大；3、反复萃取造成的重复性和检出限都很难保证；4、仅提供一种色谱柱定性定量方法，在有杂质对目标物干扰时，只能依靠其他方法进行验证。技术实现要素：本发明提供了一种同时快速测定食品中丙酸、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸含量的方法，解决了现有检测方法中样品前处理过程过于复杂、仪器用具多、试剂用量大、检测效率低下及反复萃取造成的检测结果重复性和检出限都很难保证等问题。提供了两种不同色谱柱的气相色谱定性定量条件，解决了在杂质对目标物测定有干扰时，只能依靠其他方法进行确认验证的问题。为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种同时快速测定食品中丙酸、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：称取经磨碎混匀的食品样品2～3g于50ml离心管中，加入25ml10g/l的碳酸氢钠水溶液，摇匀浸泡3分钟，加入15ml体积比为3:1的石油醚-乙醚混合溶液，涡旋或剧烈振摇1min，静置分层，若出现乳化现象可采用离心的方式分层，弃去上层溶液，若上层提取液提取物较多，可再次加入10ml体积比为3:1的石油醚-乙醚混合溶液重复上述步骤，直至上层提取液无明显提取物，得到下层溶液。步骤二：将所述步骤一中的下层溶液置50℃水浴中挥发至无明显气味，向离心管中加入1.0ml体积比为1:1的盐酸溶液，轻轻振摇至无明显气泡后加入过量氯化钠，振荡溶解至饱和，得到饱和溶液。步骤三：在所述步骤二中的饱和溶液中准确加入10ml体积比为3:1的石油醚-乙醚混合溶液，剧烈振摇1min，静置分层，若出现乳化现象可采用离心的方式分层，上层溶液作为待测液。步骤四：将所述步骤三中得到的待测液经气相色谱氢火焰离子化检测器检测,与标准系列对比定性定量。进一步，所述步骤四中的标准系列为不同浓度的标准混合使用液，所述标准混合使用液包括被体积比为3:1的石油醚-乙醚溶解的相同浓度的各待测标准物质。进一步，所述步骤四中待测液中的目标分析物杂质干扰较大时，换另一不同性质的色谱柱进行确认。进一步，所述目标分析物杂质干扰较大的判断标准为干扰物和目标物分离度小于0.8。本发明相对于现有技术所产生的有益效果如下：本发明就是利用气相色谱氢火焰离子化检测器进行检测，建立了一种同时快速测定食品中丙酸、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸含量的方法，该法适用于固体非酯类食品的检测，本发明对比现有的检测方法所产生的有益效果为：1、本发明一次前处理能同时检测丙酸、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸及各自对应盐的含量，解决现有相近检测方法不能同时检测上述四种目标物的问题。2、本发明的检测方法的技术思路是：先经转化、萃取等步骤除干扰物，再经转化即可直接提取目标物进行检测。现有检测方法的技术思路是：先经转化，把目标物和干扰物一起提取出来，提取液经洗涤、萃取等步骤除去干扰物，最后再经转化，萃取出目标物进行检测。本发明解决了现有检测方法中样品前处理过于复杂、仪器用具多、试剂用量大、成本高、污染大、效率低下及反复萃取造成的检测结果重复性和检出限都很难保证等问题。3、现有的检测方法中仅使用一根色谱柱进行定性定量检测，本发明的检测方法提供了两根不同色谱柱的定性定量条件，解决了杂质对目标物测定有干扰时，只能依靠其他方法进行确认验证的问题。附图说明图1为本发明实施例中标准混合使用液在db-ffap柱上的色谱图；图2为本发明实施例中标准混合使用液在db-608柱上的色谱图；图3为本发明实施例中麻辣豆干样品空白测试色谱图；图4为本发明实施例中麻辣豆干样品添加回收测试色谱图；图5为本发明对丙酸在不同食品中同一添加含量运用不同方法检测的回收率对比图。具体实施方式下面结合附图和具体的实施方式来进一步详细的说明本发明，但本发明的保护范围并不限于此。本实施例利用所发明方法检测基质复杂的麻辣豆干、酱菜、豆腐、糕点等食品中丙酸、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸及各自对应盐含量，包括以下步骤：步骤一：样品前处理1.1称取经磨碎混匀的食品试样3.00g于50ml离心管中，加入25ml10g/l的碳酸氢钠水溶液，摇匀浸泡3min，加入15ml体积比为3:1的石油醚-乙醚混合溶液，涡旋混合1min，静置分层，弃去上层溶液；再次加入10ml所述石油醚-乙醚混合溶液，重复上述步骤，得到下层溶液。1.2将所述下层溶液置50℃水浴中挥发至无明显气味，向离心管中加入1.0ml体积比为1:1的盐酸溶液，轻轻振摇至无明显气泡后加入10g氯化钠，振荡溶解至饱和。1.3准确加入10ml体积比为3:1的石油醚-乙醚混合溶液，剧烈振摇1min，静置分层，取上层溶液作为待测液。步骤二：待测液的测定2.1标准系列溶液的配制标准混合储备液：准确称取丙酸、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸标准物质各0.1000g于100ml容量瓶中，用体积比为3:1的石油醚-乙醚混合溶液溶解定容至刻度，得到标准混合储备液，该标准混合储备液中上述各标准物质的浓度均为1mg/ml。标准混合使用液：分别移取所述标准混合储备液1.00ml、2.00ml、4.00ml、8.00ml、16.00ml，用体积比为3:1的石油醚-乙醚混合溶液分别稀释定容至50ml，则得到的各标准混合使用液的浓度梯度为20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml。所有不同浓度的标准混合使用液均保存于4℃冰箱中备用。2.2测定的色谱条件：氢火焰离子化检测器(fid)，温度：240℃；分流/不分流进样口，温度：230℃；载气：含量≥99.999％的高纯氮气，恒流模式进样，流量：5ml/min；进样量：1.0μl，分流比3:1。测试柱：规格为30m×530μm×0.50μm；型号：db-ffap；对应柱温箱条件：初始温度100℃，保持1min，然后以20℃/min升至140℃，30℃/min升至170℃，10℃/min升至190℃，40℃/min升至230℃，保持3min。标准混合使用液浓度为80μg/ml时的测定图谱如图1所示。验证柱：规格为30m×530μm×0.83μm；型号：db-608；对应柱温箱条件：初始温度60℃，保持1min，然后以10℃/min升至80℃，30℃/min升至140℃，10℃/min升至170℃，30℃/min升至230℃，保持3min，标准混合使用液浓度为：80μg/ml，验证的结果如图2所示。从图1和图2中可以看出，测试柱和验证柱的测试结果在于目标分析物的相对保留时间和出峰顺序都不相同，这样，在测试柱上出现目标物和杂质的分离度小于0.8，影响定性定量时，用验证柱再次进行定性定量分析，就可避免上述问题。2.3测定将1μl标准系列中各浓度标准使用液和样品待测液进入气相色谱中，以目标物的保留时间定性；以标准系列中各标准物质的浓度为横坐标x，对应峰面积为纵坐标y绘制标准曲线，各标准曲线的线性回归方程如步骤3.2中的表1所示，将待测液与标准系列的标准曲线进行比较定量。2.4结果计算样品中的上述四种防腐剂含量分别以丙酸、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸计，按下式进行计算：式中：x——样品中各防腐剂含量(以对应酸计)，单位为g/kg；c——样品测试液中各防腐剂浓度(以对应酸计)，单位为μg/ml；v——测试提取液体积，单位为ml；m——试样质量，单位为g。若测定结果以丙酸钠或丙酸钙、山梨酸钾或山梨酸钠、苯甲酸钠或苯甲酸钾、脱氢乙酸钠等各自对应盐计，则测得的以酸计含量乘以换算系数即可得各自对应盐的含量；换算系数为测定目标物盐的分子量除以相应酸的分之量，可根据需要自行计算。步骤三：结果与分析3.1目标物在测定条件下的线性响应在所述步骤二的条件下，其标准系列的线性回归方程和相关系数见下表1：表14种防腐剂的标准曲线及相关系数化合物名称线性回归方程相关系数(r)丙酸y＝4.126x-3.3200.99995山梨酸y＝5.737x-2.5780.99993脱氢乙酸y＝6.123x-5.7660.99991苯甲酸y＝5.857x-3.1850.99993注：标准物质的浓度范围为10μg/ml～1000μg/ml，具体见步骤2.1。从表1中可以看出：4种防腐剂在10μg/ml～1000μg/ml的浓度范围内具有很高的相关性，利用本发明进行检测，则标准曲线的浓度范围对应至样品中的含量范围为0.05g/kg～5.0g/kg，此范围完全涵盖了4种防腐剂的常规添加量，说明本发明的线性相关性完全满足实际样品检测要求。3.2方法的检测效果麻辣豆干中含有较多的脂肪、色素、添加剂等影响分析的干扰物质，是公认难处理净化的样品类别之一，但在本发明中，样品处理过程仅在一只50ml的离心管中进行，且只使用了振摇、离心等常规操作，其样品经过本发明方法测试的图谱如图3，说明本发明用具少，分析成本低；前处理简单，可操作性强；由于样品中不会同时含有上述4种防腐剂，为了便于测定说明，本发明往干扰较大的空白麻辣豆干试样中加入折算成样品中含各目标物为0.3g/kg的标准物质，混匀后其样品测试图谱如图4。从图4中可以看出，样品测试液在目标分析物附近无干扰峰，杂质峰也很少，且色谱峰峰形尖锐，分离度好，说明本发明样品处理效果好，目标物分析干扰少，易于定性定量。3.3方法的准确度方法的准确度通常用添加回收率来反映。本发明以较难处理的几种常见固体非脂类食品作为方法的验证对象，向样品中添加不同浓度的4种防腐剂标准物质，混匀后进行检测，计算其回收率，测定结果见表2：表2不同添加浓度的4种防腐剂在不同食品中的回收率(％)注：1#样品4种防腐剂的添加浓度均为0.5g/kg，2#样品4种防腐剂的添加浓度为0.1g/kg。从表2可知，山梨酸的回收率在95.4％～98.6％之间，脱氢乙酸的回收率在96.2％～99.4％之间，苯甲酸的回收率在95.2％～96.9％之间，添加标准物质的浓度含量高的比添加标准物质的浓度的含量低的回收率高，属正常规律，主要是由于系统性测量损失造成的；这三种防腐剂的最低回收率均在95％以上，其结果完全符合《gb/t27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》附录f—检测方法确认的技术要求中关于回收率的要求：被测组分含量在0.001～0.1g/kg时，回收率在90～110％之间；被测组分含量大于0.1g/kg时，回收率在95～105％之间。丙酸的回收率在85.1％～91.3％之间，丙酸回收率相对较低是因为丙酸具有跟水互溶的性质，造成丙酸很难从水中提取出来，这也是气相色谱法测定丙酸普遍遇到的问题，属较难处理的物质，其运用本发明的回收率优于较难处理方法有关目标物回收率的要求：70～120％。另外，本发明对运用不同方法测定相同添加量下的丙酸回收率进行了比对，如图5所示，其中标准样品的添加量为0.1g/kg；国标方法为《gb5009.120-2016食品安全国家标准食品中丙酸钠、丙酸钙的测定》第二法—气相色谱法，从图5可知，运用本发明测定丙酸的回收率和国标方法的基本相同，基质干扰较少的食品类样品如豆腐、糕点等高于国标方法。从上述分析说明本发明能完全满足检测需要，是一个适应范围广、准确度高的检测方法。另外，若用本发明测定样品中的丙酸，应注意在实验过程中用氯化钠充分饱和被提取的水溶液，以提高丙酸的回收率。3.4方法的精密度由于样品中不可能同时含有上述4种防腐剂，为了便于测定说明，本发明往干扰较大的空白麻辣豆干试样中加入较低量的标准物质(0.1g/kg)，充分匀化后按此法测定6次，计算其测定结果的实验室内变异系数cv值(相对标准偏差rsd)来表示方法的精密度，结果见表3。表34种防腐剂在麻辣豆干中的精密度实验结果及检出限汇总注：表中数据在目标物添加浓度为0.1g/kg时测定。从表3中可知，4种防腐剂测定结果的实验室内变异系数cv(n＝6)均小于5％，其结果优于《gb/t27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》附录f—检测方法确认的技术要求中关于精密度的要求：被测组分含量在0.1g/kg时，实验室内变异系数cv＝5.3％。说明用本发明进行检测时具有很好的重复性。3.5方法的检测限方法的检出限是方法能不能满足检测要求的根本保证。利用本发明进行检测，当检出限以3倍噪音除以灵敏度(标准曲线方程的斜率)计算，其结果见表3。从表3可知，4种防腐剂的检出限均在0.002g/kg以下，比上述几种食品中国家规定的最低限量值0.25g/kg还要低100多倍，说明本发明检测限低，能完全满足食品安全检测的需要。3.6方法的适用性分析丙酸、山梨酸、苯甲酸和脱氢乙酸在使用中均可以酸或相应盐的形式加入到食品中，都能起防腐作用，即使加入的是相应的盐，也可能因食品本身的酸性或食品酸败变成酸的形式存在。本发明的方法先将称量试样加入25ml的10g/l的碳酸氢钠水溶液中，摇匀并浸泡3分钟，在此条件下，试样中的上述四种防腐剂无论是以酸形式存在还是以盐形式存在，现均以相应盐的形式溶于水溶液中，因此，本发明测定的是样品中上述四种防腐剂的总量，其结果自然也可根据需要以相应盐的形式表示。在我国食品添加剂限量标准中也是要求总量以酸的形式计，因此本发明也满足我国限量标准的要求。本发明是在食品试样中加入一定量的碱性水溶液提取的，考虑到液体样品本身含水量对测定结果的影响，不将其列入考虑范围，也未对液体样品进行验证；另外，本发明是用最后提取目标物的混合溶液先萃取分析干扰物并去除的，在去除干扰物的条件下，目标物是更易溶于碱性水溶液的，试样和目标物直到最后一步萃取分析时才分开，说明只要试样的主要成分不被除干扰物时去除且能被水溶液浸提，就能利用本发明进行检测，酯(脂)类样品由于溶于萃取干扰物溶剂，造成回收率无法保证而不能使用本发明；因此，本发明将适用样品范围定义为固体非酯类食品，同时也说明本发明具有广泛的适用性。3.7方法在实际检测中的应用利用本发明对市场上的风味小食品类、酱菜类、豆腐类、糕点类共计300份食品样品进行检测，取得了很好的应用效果，工作效率比使用国标方法分开检测提高10倍以上，其样品中检出的含有上述4种防腐剂及其盐的大概情况为：丙酸检出率为14.0％，超标率为0.7％；山梨酸检出率为55.7％，超标率为1.7％；脱氢乙酸检出率为52.0％，超标率为2.3％；苯甲酸检出率为45.3％，超标率为1.3％；大部分样品中添加了一种到两种本发明所检防腐剂。实际检测结果表明，完全可以利用本发明对固体类食品中的上述4种防腐剂进行检测。要说明的是，上述实施例是对本发明技术方案的说明而非限制，所属
技术领域：
普通技术人员的等同替换或者根据现有技术而做的其它修改，只要没超出本发明技术方案的思路和范围，均应包含在本发明所要求的权利范围之内。当前第1页12