液态样品中拟除虫菊酯类农药残留的萃取方法与流程

本发明涉及一种液态样品中拟除虫菊酯类农药残留的萃取方法，尤其是高盐或/和高蛋白样品中拟除虫菊酯类农药残留的萃取方法，属于农药残留检测技术领域。

背景技术：

拟除虫菊酯类农药是一种广谱杀虫剂，对农林、园艺、仓库、畜牧、卫生等多种害虫有良好的防治效果。由于其价格低廉、药效高和毒性低等优点，拟除虫菊酯类农药被广泛用于水果和蔬菜等生长过程中，并且用于室内和室外的除虫过程中。拟除虫菊酯类农药很容易随地表水的渗透和水土流失扩散。但是，此类农药具有神经毒性，可以对昆虫和哺乳动物产生神经毒害作用，而且它们是脂溶性的化合物，对光和温度不敏感。研究表明，长期处于拟除虫菊酯类农药的环境中，会引起头痛、头昏、恶心、呕吐、上腹部灼痛感、乏力、食欲不振、胸闷、流涎等症状。因此，关于拟除虫菊酯类农药的残留检测一直是人们关注的焦点问题。

世界卫生组织(WHO)规定饮用水中每一种农药最大残留限量(MRL)是0.10μg/L，而且规定饮用水中不能有氯菊酯检出。欧盟也对食物和植物种子中的农药最大残留量进行了限定。因此，这就要求要有高灵敏度的检测方法来测定此类农药。然而，样品前处理又是整个检测方法的核心问题。

目前，关于除虫菊酯类农药的样品前处理方法主要有液液萃取、固相萃取、分散液液微萃取、基质固相分散、液相微萃取和顶空固相微萃取等方法。这些前处理方法存在消耗有机溶剂多、样品通量小、应用范围有限、操作繁琐、耗费时间、成本高等不足之处，对于除虫菊酯类农药的萃取净化不是简单或有效的方法。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了一种液态样品中拟除虫菊酯类农药残留的萃取方法，尤其是高盐或/和高蛋白样品中拟除虫菊酯类农药残留的萃取方法，可用于拟除虫菊酯类农药——联苯菊酯(bifenthrin)，氯菊酯(permethrin)，β-氟氯氰菊酯(β-cyfluthrin)和氰戊菊酯(fenvalerate)的萃取、净化。本发明的萃取方法——盐析辅助液液萃取无需对样品基质进行除盐及除蛋白的处理，可直接对样品进行萃取，在萃取的同时实现样品的除盐及除蛋白过程，即在快速萃取样品的同时实现了样品的净化。向样品溶液中加入乙腈，利用拟除虫菊酯类农药在乙腈相中的溶解度大于水相中的溶解度的特点，拟除虫菊酯类农药会溶解到乙腈相中，不必采用超声等方法加速溶解；再向此均一溶液中加入盐析液，由于无机盐在水中的溶解度远远大于乙腈在水中的溶解度，溶解有拟除虫菊酯类农药的乙腈相就从均一溶液中盐析出来，实现相分离，省去了离心的步骤。本发明的萃取方法简单、快速、低耗，最重要的是不需要进行离心、超声等复杂的过程，仅通过盐析就能实现两相分离。萃取后的样品经过滤后可直接进行气相色谱-质谱(GC-MS)测定。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种液态样品中拟除虫菊酯类农药残留的萃取方法，包括以下步骤：

(1)取待检测的液态样品，调节pH值至3(用5％磷酸溶液或0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节)，加入乙腈，乙腈与样品的体积比为1:1，混匀，得均一溶液；

进一步地，所述液态样品，为高盐或/和高蛋白样品，包括尿液、废水、海水等；

(2)向上述均一溶液中加入盐析液，盐析液与均一溶液的体积比为1:1；静置至分层；

(3)分层后，取上层乙腈相，0.45μm微孔滤膜过滤，然后即可直接进行气相色谱-质谱测定；

所述盐析液是通过以下方法制备得到的：配制100mmol/L的磷酸盐缓冲液，加入氯化钠，加入后氯化钠的浓度为5mol/L，调节盐析液的pH值为4(用5％磷酸溶液或0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节)。

所述拟除虫菊酯类农药，选自联苯菊酯，氯菊酯，β-氟氯氰菊酯或/和氰戊菊酯。

所述气相色谱-质谱测定为常规方法，具体测定时，可采用下述方法：

(1)用甲醇作溶剂配制拟除虫菊酯农药的混合标准溶液，联苯菊酯，氯菊酯，β-氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的浓度范围依次为：5～5000ng/mL、25～5000ng/mL、200～5000ng/mL和25～5000ng/mL；

(2)用GC-MS测定所述拟除虫菊酯农药的混合标准溶液中各农药组分的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，以浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出拟除虫菊酯农药的标准曲线；

(3)测定拟除虫菊酯农药的GC-MS条件为：

色谱柱：型号为ZebronTMZB-5MS的毛细管色谱柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm；进样量：1.0μL，不分流进样；进样口温度：270℃；柱温：初始温度220℃，25℃/min升至270℃，保持4min，5℃/min升至280℃，保持2min；载气：高纯氮气，纯度≥99.999％；恒流模式，流速1mL/min；检测器：质谱检测器；离子源温度：260℃；接口温度：290℃；溶剂延迟时间：2.5min。

(4)采用外标法对样品中拟除虫菊酯类农药进行定量分析。

本发明的拟除虫菊酯类农药残留的萃取方法，减少了有机试剂的用量，且不需用到离心、超声和震荡等设备；缩减了常规方法对拟除虫菊酯农药的检测步骤及人力，提升了检测效率。传统的液液萃取要用到大量的有机试剂，而且操作比较繁琐；而固相萃取虽然是一种经典的萃取方法，但是要用到固相萃取装置、固相萃取小柱，固相萃取小柱的重现性问题会影响后续测定的准确度；另外，固相萃取后续还需要用氮吹仪进行浓缩；整个萃取过程耗时久，而且也要用到大量的有机试剂进行小柱冲洗及样品洗脱。新型的微萃取方法如分散液液微萃取一般要用到氯苯和溴苯等有毒有机试剂，而固相微萃取方法虽然有机试剂用量少，但是微萃取材料的制备及重现性也是目前被广泛关注的问题。本发明不需要特殊的设备，只需进行简单的加试剂就可以实现样品中拟除虫菊酯类农药的萃取，本发明简单、快速、回收率高；同时还明显降低了气相色谱相关耗材的消耗程度，延长了毛细管柱的使用时间及气相色谱-质谱仪的使用寿命。可以预计，本发明的方法在农药残留测定技术领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1：本发明的盐析液液萃取萃取过程示意图。

图2：尿液空白及加标回收色谱图，其中，4种拟除虫菊酯类农药的加标浓度分别为：联苯菊酯50ng/mL，氯菊酯250ng/mL，β-氟氯氰菊酯500ng/mL，氰戊菊酯250ng/mL；a为空白样品，b为加标样品。

图3：废水空白及加标回收色谱图，其中，4种拟除虫菊酯类农药的加标浓度分别为：联苯菊酯50ng/mL，氯菊酯250ng/mL，β-氟氯氰菊酯500ng/mL，氰戊菊酯250ng/mL。

图4：海水空白及加标回收色谱图，其中，4种拟除虫菊酯类农药的加标浓度分别为：联苯菊酯50ng/mL，氯菊酯250ng/mL，β-氟氯氰菊酯500ng/mL，氰戊菊酯250ng/mL。

具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实验 最佳萃取条件的筛选

萃取方法如下：取2mL样品(4种拟除虫菊酯农药混合标准溶液)，置于10mL玻璃离心管中，调节pH值至设计值(用5％磷酸溶液或0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节；见表1)，加入2mL乙腈，混匀，得均一溶液。向均一溶液中加入盐析液(盐析液的用量及pH见表1)，溶液即分为两层，上层为乙腈相，下层为水相。取上层乙腈相，经0.45μm微孔滤膜过滤后进行气相色谱-质谱检测。

所述盐析液是通过以下方法制备得到的：配制100mmol/L的磷酸盐缓冲液，加入氯化钠，加入后氯化钠的浓度为5mol/L，调节盐析液的pH值。

本实验采用三因素三水平正交设计实验获得最佳萃取条件，正交设计表见表1。其中pH1为待检测液态样品pH值，pH2为盐析液pH值，V为盐析液体积。以各拟除虫菊酯类农药峰面积作为衡量指标，峰面积最大时的实验组合为最佳实验组合。

从表1可以看出，7号组合得到的各拟除虫菊酯类农药的峰面积最大，所以选定样品pH为3，盐析液pH为4，盐析液体积为4mL。

表1正交设计表及相应的峰面积数值

实施例1：尿液、废水和海水样品中拟除虫菊酯农药残留的萃取及检测

1.萃取及检测方法

萃取方法步骤如下：各取2mL尿样、废水和海水样品，分别置于10mL玻璃离心管中，调节pH值至3(用5％磷酸溶液或0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节)，各加入2mL乙腈，混匀，得均一溶液。向均一溶液中加入4mL盐析液(pH＝4)，溶液即分为两层，上层为乙腈相，下层为水相。取上层乙腈相，经0.45μm微孔滤膜过滤后进行气相色谱-质谱检测(流程如图1所示)。

所述盐析液是通过以下方法制备得到的：配制100mmol/L的磷酸盐缓冲液，加入氯化钠，加入后氯化钠的浓度为5mol/L，调节盐析液的pH值为4。

气相色谱-质谱检测步骤如下：

(1)用甲醇作溶剂配制拟除虫菊酯农药的混合标准溶液，联苯菊酯，氯菊酯，β-氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的浓度范围依次为：5～5000ng/mL、25～5000ng/mL、200～5000ng/mL和25～5000ng/mL；

(2)用GC-MS测定所述拟除虫菊酯农药的混合标准溶液中各农药组分的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，以浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出拟除虫菊酯农药的标准曲线；

(3)测定拟除虫菊酯农药的GC-MS条件为：

色谱柱：型号为ZebronTMZB-5MS的毛细管色谱柱，规格为30m×0.25mm×0.25μm；进样量：1.0μL，不分流进样；进样口温度：270℃；柱温：初始温度220℃，25℃/min升至270℃，保持4min，5℃/min升至280℃，保持2min；载气：高纯氮气，纯度≥99.999％；恒流模式，流速1mL/min；检测器：质谱检测器；离子源温度：260℃；接口温度：290℃；溶剂延迟时间：2.5min。

(4)采用外标法对样品中拟除虫菊酯类农药进行定量分析。

2.结果

(1)采用上述GC-MS条件测定4种拟除虫菊酯农药混合标准溶液，标样分离效果较好，峰形对称，基线稳定，说明仪器条件适合。在此色谱条件下拟除虫菊酯类农药保留时间分别为：联苯菊酯4.50min，氯菊酯6.52min和6.70min，β-氟氯氰菊酯7.60min和7.69min，氰戊菊酯10.05min和10.62min(如图2、图3、图4所示)。

(2)方法的线性范围、回归方程与检出限

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，4种农药在其浓度范围内线性良好，相关系数(r)均大于0.990，如表2所示。以3倍信噪比计算各农药的检出限(LOD)，4种拟除虫菊酯农药的LOD在1.5～60.6ng/mL之间。

表2拟除虫菊酯类农药的线性范围、回归方程、相关系数和检出限

(3)尿样、废水和海水样品的测定结果

结果如表3所示，尿液和海水样品中均未有4种拟除虫菊酯类农药检出，在废水样品中有联苯菊酯、氯菊酯和氰戊菊酯检出，其浓度分别为4.2ng/mL，30.0ng/mL和35.5ng/mL。

(4)本发明方法的回收率与精密度

取2.0mL样品(即上述的尿样、废水和海水样品)，分别加入3种不同浓度水平的农药混合标准溶液，拟除虫菊酯农药的添加水平为20～100ng/mL，每个浓度水平平行3份样品，按照上述方法进行样品前处理和色谱条件测定。采用外标法定量，计算各农药的平均回收率及其标准偏差(即SD)，结果如表3所示，样品空白及加标色谱图如图2、图3、图4所示。

由表3可知，4种拟除虫菊酯农药联苯菊酯、氯菊酯、β-氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的平均回收率分别为74～110％、75～109％、75～89％和78～103％，相应的SD分别为2.1～9.8％、1.8～8.9％、4.6～9.6％和3.5～9.2％，说明本发明的方法具有良好的准确性和重复性。

以上实施例表明，盐析液液萃取-气相色谱-质谱方法可用于尿液、废水和海水样品中拟除虫菊酯类农药的检测，盐析液液萃取方法简单、快速、低耗，在萃取样品的同时去除了样品基质(除盐和除蛋白)。气相色谱-质谱方法为此类农药的检测提供了高的灵敏度。结果证明此方法灵敏、快速，可作为一种农药残留测定的方法进行推广。

表3 4种农药在尿液、废水和海水样品中的添加回收结果(n＝3)