一种侧柏叶TLC鉴别方法与流程

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种侧柏叶tlc鉴别方法。

背景技术：

侧柏叶又名柏叶、丛柏叶、扁柏、云片柏等，是医家所重视的治血良药。中医认为侧柏叶味苦，性微寒，无毒，入心、肝、大肠经。具有凉血、止血、祛内湿、散肿毒之功。可治吐血、鼻出血、尿血、血痢、崩漏、风湿痛、咳嗽、烫伤等症。根据科学研究表明，侧柏叶含大量的挥发油，油中主要成分为侧柏烯、小茴香酮等，叶中还含有钾、钠、磷、氮、钙、镁、锰和锌等多种微量元素。药理实验表明，侧柏叶煎剂能够明显的缩短出血时间及凝血时间，除此以外，还有镇咳、平喘、祛痰、镇静等作用。相关实验表明，侧柏叶对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、卡他球菌、白喉杆菌、伤寒杆菌等均有很好的抑制作用，有乌须发、止血、止咳喘的功效。

目前，对中药材的理化鉴别方法，主要包括荧光法，微量升华法，显色，沉淀、泡沫反应，钙盐、钠盐等鉴别反应，薄层色谱法（tlc）等。其中，由于tlc法处理简单，成本低，可同时对多个成分进行一个比较，不需使用复杂仪器，应用范围最为广泛。如2015版中国药典侧柏叶项下收载了目前法定的侧柏叶tlc鉴别方法，但由于该法中采用的索氏提取步骤，至少需6小时，加热回流步骤也需要1小时，操作繁琐，操作时间长、有机试剂用量多导致成本较高等缺点，无法满足实际应用中快速、简便的需求。因此，建立一种快速、准确，高效的侧柏叶tlc鉴别方法是很有必要的。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种侧柏叶tlc鉴别方法，具有专属性强、操作简单、快速、准确，高效、成本低廉、重现性好等优点，可用于对侧柏叶药材及饮片质量快速检测。

本发明技术方案如下：

一种侧柏叶tlc鉴别方法，步骤包括：

（1）取待测样品粉末0.5～1.5g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇10～30ml，超声30min，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液；

（2）取槲皮苷标准品，加乙醇配制为0.05～0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液；

（3）薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各2～4μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比为（10:1:1）～（14:1:1）的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂展开，取出，晾干，喷以1wt％的三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。

优选地，步骤（1）中，各原料用量为待测样品粉末1g、70％甲醇20ml。

优选地，步骤（2）中，取槲皮苷标准品，加乙醇配制为0.1mg/ml的溶液。

优选地，步骤（3）中，吸取供试品溶液和对照品溶液各3μl，展开剂乙酸乙酯-甲酸-水的体积比为12:1:1。

优选地，步骤（3）中，所述的薄层色谱法试验为2015年版中国药典四部0502薄层色谱法。

所述的侧柏叶tlc鉴别方法，供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，则待测样品为侧柏叶。

侧柏叶的止血有效成分通常认为是槲皮素和鞣质，实际上，本发明通过实验表明侧柏叶中没有槲皮素，只有槲皮苷，现有检测方法中，也都是将槲皮苷水解成槲皮素后进行鉴定。现有技术中，以药典的鉴别方法为例，是将侧柏叶叶绿素成分进行提取后，再对其所含黄酮类成分槲皮苷进行酸水解，水解成槲皮素，再用乙酸乙酯萃取，水洗，浓缩后进行鉴定。由于其样品制备过程涉及索氏提取，耗时至少6h，且以乙醚为提取液，操作具一定的危险性，黄酮类成分提取、水解共计耗时1.5h。由于侧柏叶中含有的是槲皮苷等黄酮类成分，本发明改变以往采用槲皮素为对照品的通用方法，不通过水解、索氏提取等步骤，在最优条件下，直接将槲皮苷提取出来进行鉴定，经实验验证，本发明方法操作简单，便捷，有效，且能发映出侧柏叶自身的特点，可快速准确用于对侧柏叶进行tlc鉴定。

本发明技术方案相对于现有技术有益效果为：

1、快速、简便、重现性好：①节约时间：该法较药典法省去药典中索氏提取（至少6小时）、加热回流1小时、酸水解等步骤，整体可将鉴定时间缩短90%。②节省试剂：上述步骤中的有机试剂均可节省，尤其是减少了乙醚的使用，减少操作过程的不适性和危险性。③重现性好：该法较为简单、易操作，重现性好。

2、以槲皮苷为对照更适宜于鉴别侧柏叶：因侧柏叶中含有槲皮苷不含槲皮素成分，因此更适于侧柏叶的鉴别。

3、色谱清晰，各斑点分离良好：该方法所得图谱的斑点清晰，分离良好，重现性好。

4、节约药材：与药典方法相比，鉴别用侧柏叶由3g降到1g，明显节约了药材用量。

附图说明

图1为实施例1侧柏叶tlc鉴别图谱，图中1-5，6-9均为侧柏叶，5-槲皮苷对照品；

图2为实施例2侧柏叶tlc鉴别图谱，图中1-4,6-9均为侧柏叶，5-槲皮苷对照品；

图3为实施例3侧柏叶tlc鉴别图谱，图中1-4,6-9均为侧柏叶，5-槲皮苷对照品；

图4为对比例1侧柏叶tlc鉴别图谱，图中1-5,7-10均为侧柏叶，6-槲皮素对照品；

图5为对比例2侧柏叶tlc鉴别图谱，图中1-4,6-9均为侧柏叶，5-槲皮苷对照品；

图6为对比例3侧柏叶tlc鉴别图谱，图中1-4,6-9均为侧柏叶，5-槲皮素对照品。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明方案及有益效果。

实施例1

一种侧柏叶tlc鉴别方法，步骤包括：

（1）取待测样品粉末1g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇20ml，超声30min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液；

（2）取槲皮苷标准品，加乙醇配制为0.1mg/ml的溶液，作为对照品溶液；

（3）照2015年版中国药典四部0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比为12:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂展开，取出，晾干，喷以1wt％的三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，tlc薄层图谱见图1，待测样品为侧柏叶。由图1可见，8批侧柏叶中均检出槲皮苷，且斑点清晰，分离度良好。

实施例2

一种侧柏叶tlc鉴别方法，步骤包括：

（1）取待测样品粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，，加70％甲醇10ml，超声30min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液；

（2）取槲皮苷标准品，加乙醇配制为0.05mg/ml的溶液，作为对照品溶液；

（3）照2015年版中国药典四部0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比为10:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂展开，取出，晾干，喷以1wt％的三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，tlc薄层图谱见图2，待测样品为侧柏叶。由图2可见，8批侧柏叶中均检出槲皮苷，且斑点清晰，分离度良好。

实施例3

一种侧柏叶tlc鉴别方法，步骤包括：

（1）取待测样品粉末1.5g，置具塞锥形瓶中，，加70％甲醇30ml，超声30min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液；

（2）取槲皮苷标准品，加乙醇配制为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液；

（3）照中国药典四部0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各4μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比为14:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂展开，取出，晾干，喷以1wt％的三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，tlc薄层图谱见图3，待测样品为侧柏叶。由图3可见，8批侧柏叶中均检出槲皮苷，且斑点清晰，分离度良好。

对比例1：2015版中国药典

取样品（同实施例1）粉末3g，置索氏提取器中，加乙醚适量，加热，回流至提取液无色，弃去乙醚液，药渣挥干乙醚，加70％乙醇50ml，加热回流1小时，趁热滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，加盐酸3ml，加热水解30分钟，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，用水洗涤3次，每次10ml。水浴蒸干，残渣加甲醇5ml溶解作为供试品溶液。另取槲皮素对照品，加乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2015年版中国药典四部通则0502）试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液3μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。tlc薄层图谱见图4。由图4可见，9批侧柏叶中均检出槲皮素，且斑点清晰，分离度良好。

对比例2

将步骤（2）对照品槲皮苷替换为槲皮素,其余步骤同实施例1；tlc薄层图谱见图5。由图5可见，8批侧柏叶在槲皮素相应位置均未检出相同颜色的荧光斑点，因此可以断定侧柏叶中不含槲皮素成分。

对比例3

将步骤（1）70％甲醇20ml替换为乙醇20ml，其余步骤同实施例1；tlc薄层图谱见图6。由图6可见，8批侧柏叶在槲皮苷相应位置均检出相同颜色的荧光斑点。因此认为改法中甲醇和乙醇均可作为提取溶剂。

结果分析

由实施例1-3可见，本发明方法快速、简便、耗时短，易操作，受影响因素小，重现性好；有效减少了有机试剂的用量，一方面减少危险性，另一方面节约了成本。采用hplc法对该方法进行验证发现，侧柏叶中含有槲皮苷成分，不含槲皮素成分，因此本方法建立的以槲皮苷为对照品用于侧柏叶的tlc鉴定合理可行。

实施例及对比例结果分析：（1）新建方法与药典法比较可见，并未影响槲皮苷的鉴别，新建方法的斑点清晰，分离良好。

（2）与药典法比较，采用槲皮苷为对照品进行鉴别更适宜于鉴别侧柏叶，因侧柏叶中含有槲皮苷不含槲皮素成分，从理论上讲更适于侧柏叶的鉴别，因此专属性更强。

（3）该法与药典法比较，所用侧柏叶样品由3g降到1g，明显节约了侧柏叶用量。

综上所述，本发明方法具有现有侧柏叶鉴别方法不可比拟的突出优点，可用于替代现行药典法等用于侧柏叶的tlc鉴别。