玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡及其制备方法与流程

【
技术领域：
】本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体涉及一种玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡及其制备方法。
背景技术：
：玉米赤霉烯酮(zearalenone)，又称f-2毒素，是玉米赤霉菌的代谢产物。它首先从有赤霉病的玉米中分离得到，玉米赤霉烯酮其产毒菌主要是镰刀菌属(fusarium)的菌侏，如禾谷镰刀菌(f.graminearum)和三线镰刀菌(f.tricinctum)。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的阳性检出率为45％，最高含毒量可达到2909mg/kg；小麦的检出率为20％，含毒量为0.364～11.05mg/kg。玉米赤霉烯酮的耐热性较强，110℃下处理1h才被完全破坏。玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，主要作用于生殖系统，可使家畜，家禽和实验小鼠产生雌性激素亢进症。妊娠期的动物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流产、死胎和畸胎。食用含赤霉病麦面粉制作的各种面食也可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心、发冷、头痛、神智抑郁和共济失调等。目前，玉米赤霉烯酮一般采用液相和气相色谱的方法进行测定。该测定方法具有检测周期长、操作复杂、灵敏度低、仪器设备昂贵等缺点，无法应用于大批量样品的筛查工作。因此有必要提供一种新的技术解决上述技术问题。技术实现要素：本发明的目的是克服上述技术问题，提供一种操作简单、灵敏度高、线性范围宽等优点的玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡。本发明的技术方案是：一种玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡，包括底板、设于所述底板且依次搭接的样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述玻璃纤维膜上涂布有由荧光微球标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上间隔设置有检测线和质控线，其中所述检测线由玉米赤霉烯酮偶联抗原包被于所述硝酸纤维素膜上形成，所述质控线由羊抗鼠igg包被于所述硝酸纤维素膜上形成。本发明还提供一种玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的制备方法。包括如下步骤：步骤s1：采用荧光微球对玉米赤霉烯酮单克隆抗体进行标记，并将其喷涂于玻璃纤维膜上；步骤s2：将玉米赤霉烯酮偶联抗原包被于硝酸纤维素膜，形成检测线；将羊抗鼠igg包被于硝酸纤维素膜，形成质控线；步骤s3：在粘性底板上依次搭接样品垫、喷涂有由荧光微球标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体的玻璃纤维膜、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜及吸水垫，并裁切形成玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡。优选的，步骤s1包括荧光微球活化、荧光微球标记抗体、标记抗体封闭、标记抗体喷涂于玻璃纤维膜步骤。优选的，所述荧光微球与所述玉米赤霉烯酮单克隆抗体的质量比为10:1。优选的，所述荧光微球的粒径为50-300nm。优选的，所述标记抗体封闭步骤所用封闭液为浓度7.5％甘氨酸和10％牛血清白蛋白。优选的，步骤s2中，所述羊抗鼠igg的浓度为1mg/ml；所述玉米赤霉烯酮偶联抗原的浓度为2mg/ml。优选的，所述检测线和所述质控线的间隔为5mm。与相关技术相比，本发明提供的玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡及其制备方法，有益效果在于：一、本发明提供的玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡为免疫层析检测卡，通过荧光微球标记玉米赤霉烯酮单克隆抗体，检测玉米赤霉烯酮的操作方便、检测速度快；所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的线性范围为10-300μg/kg。二、所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的制备方法中，将荧光微球表面进行活化处理后，采用化学偶联方法来标记抗体，形成抗体与荧光微球的稳定结合，进一步保证检测结果精度。【附图说明】图1为本发明提供的玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的结构示意图；图2为本发明提供的玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的标准曲线图。【具体实施方式】下面将结合附图和实施方式具体实施方式对本发明作进一步说明。以下详细阐述所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的制备方法。为方便描述，将在所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的制备方法过程中应用到的部分试剂的简称说明如下，在具体描述其制备方法时对应的试剂采用简称。2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，简称mes缓冲液；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，简称edc；n-羟基琥珀酰亚胺，简称nhs；4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，简称hepes缓冲液；甘氨酸，简称gly；牛血清白蛋白，简称bsa。所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的制备方法，包括如下步骤：步骤s1：采用荧光微球对玉米赤霉烯酮单克隆抗体进行标记，并将其喷涂于玻璃纤维膜上；其中，荧光微球和玉米赤霉烯酮单克隆抗体均为市售。具体的，包括：1、荧光微球活化：①取50ul荧光微球(500ug)液体置于大小合适的离心管中，加入1mlmes缓冲液，混匀；②离心，倾倒上清；具体的，4℃离心200nm微球，离心速度至少20000rpm，离心时间约为15min；常温离心400nm微球，离心速度12000rpm；常温离心160nm微球，离心速度16000rpm；③加入1mlmes缓中液，超声重悬；其中超声在冰浴条件下进行，时间为2-3min，功率约为50％；④制备edc溶液和nhs溶液：分别在5mgedc和5mgnhs的离心管中加入各1mlmes缓冲液，充分混匀；⑤向步骤③的重悬液中加入配制好的nhs溶液7ul，混匀；加入配制好的edc溶液1.6ul，混匀；⑥37℃条件下转盘旋转反应1h进行活化处理，离心弃上清；⑦加入1ml去离子水缓冲液，超声重悬；其中超声在冰浴条件下进行，时间2-3min，功率约为50％；⑧离心，倾倒上清；⑨重复步骤⑦、⑧；⑩加入1mlhepes缓冲液，超声重悬；其中超声条件同步骤⑦。2、荧光微球标记抗体①向活化后的荧光微球中加入玉米赤霉烯酮单克隆抗体50ug：抗体浓度大于5mg/ml时，用hepes缓冲液稀释后加入，且根据不同的抗体选择不同的稀释比例，其中荧光微球和抗体投料质量比10:1；②37℃转盘旋转反应2h-12h。3、标记抗体封闭①反应结束后添加封闭缓冲液，封闭2h；具体封闭过程如下：a、500ug荧光微球对应加入5ul浓度为7.5％的gly溶液，30秒内黏壁加入，涡旋仪混匀10秒，轻摇混匀30秒避免产生泡沫；b、再加入5ul浓度为10％的bsa溶液，30秒内贴壁加入，涡旋仪混匀10秒，轻摇混匀30秒避免产生泡沫；②离心，倾倒上清；其中离心速度至少20000rmp，4℃条件下离心时间约为15min；③加入1mlhepes缓冲液，超声重悬：超声在冰浴条件下进行，超声时间2-3min，4℃，功率约为50％；④离心，倾倒上清，离心条件参考步骤②；⑤重复步骤③、④；⑥加入200ul贮存缓冲液，超声重悬，其中超声条件参照步骤③，制备得到由荧光微球标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体；⑦转移至合适容器中，标识浓度5mg/ml；4、标记抗体喷涂于玻璃纤维膜取标记抗体20ul，加入230ul贮存缓冲液，混匀后取30cm×0.5cm玻璃纤维膜进行涂布，并放置于鼓风干燥箱，烘干2h，备用。步骤s2：将玉米赤霉烯酮偶联抗原包被于硝酸纤维素膜，形成检测线；将羊抗鼠igg包被于硝酸纤维素膜，形成质控线；取1mg/ml的羊抗鼠igg以及2mg/ml的玉米赤霉烯酮偶联抗原进行硝酸纤维素膜的包被，其中质控线位置包被羊抗鼠igg，检测线位置包被玉米赤霉烯酮偶联抗原，所述质控线与所述检测线之间的间距为5mm。步骤s3：在粘性底板上依次搭接样品垫、喷涂有由荧光微球标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体的玻璃纤维膜、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜及吸水垫，并裁切形成玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡。以下详细阐述制备得到的所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的结构。请参阅图1，为本发明提供的玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的结构示意图。所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡100包括底板11、设于所述底板11且依次搭接的样品垫12、玻璃纤维膜13、硝酸纤维素膜14、吸水垫15，所述玻璃纤维膜13上涂布有由荧光微球标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜14上间隔设置有检测线16和质控线17，其中所述检测线16有玉米赤霉烯酮偶联抗原包被与所述硝酸纤维素膜14上形成，所述质控线17由羊抗鼠igg包被于所述硝酸纤维素膜14上形成。所述检测线16与所述质控线17的间隔距离为5mm。检测结果判定：在所述样品垫12滴加样品后，观察所述检测线16是否有荧光条带。不管检测样品是阴性还是阳性，所述质控线17均会出现荧光条带；当所述检测线16有荧光条带，判定该样品为阴性，当所述检测线16无荧光条带，判定该样品为阳性。以下详细阐述所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的产品性能。样品稀释液的配制称取1.0g蔗糖、0.5gbsa和2g吐温20，混匀并用超纯水定容至100.0ml。标准曲线的绘制称取玉米赤霉烯酮标准品1.0mg(精确至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至10ml，配制成质量浓度为0.10mg/ml的标准储备溶液，于-20℃下保存，备用；再将储备液梯度稀释配制成10μg/kg、25μg/kg、60μg/kg、100μg/kg、200μg/kg和300μg/kg的系列标准工作溶液，由低到高浓度进行玉米赤霉烯酮时间分辨荧光免疫层析检测，绘制标准曲线。请参阅图2，为本发明提供的玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的标准曲线图。其中，横坐标表示检测线t信号值与质控线c信号值的比值(t/c)，纵坐标表示标准溶液浓度的自然对数值(lnc)。标准曲线方程为：y＝(a-d)/[1+(x/c)^b]+d，r2＝0.9958；其中，a取值为0.75582，b取值为1.09768，c取值为38.92955，d取值为0.01586。由标准曲线可以看出，所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的检测线性范围为10-300μg/kg。使用时每批玉米赤霉烯酮时间分辨荧光免疫层析试纸条产品附带相应的二维码，通过二维码扫描导入黄曲霉毒素时间分辨荧光速测仪，内含预先建立的标准曲线。阴性样本加标验证样本准备：准确称取5.0g±0.05g(秸秆、膨化玉米等强吸水性饲料称取2.5g，过20目筛网)均质样本于离心管中，加入20ml50％乙醇-水溶液，具塞振荡5分钟，静置分层或于4000rpm离心5分钟，得上清液，取100ul上清液加入3ml样本稀释液，混匀待检。称取八组阴性样本，进行加标验证，验证结果如表1：表1：阴性样本加标验证结果序号加标试样浓度ppb测试浓度ppb加标回收率100.30％22521.484.4％35046.993.2％47570.893.7％510092.792.3％6150136.590.8％7200178.489.05％830028595％阳性样品验证取已被液相定值的阳性玉米样本，验证结果如表2：表2：阳性样本验证结果由表1可以看出，阴性样本加标验证测得回收率高于80％；由表2可以看出，阳性样本验证测得回收率高于70％；由此可以看出，本发明提供的玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡，检测结果精度高。与相关技术相比，本发明提供的玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡及其制备方法，有益效果在于：一、本发明提供的玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡为免疫层析检测卡，通过荧光微球标记玉米赤霉烯酮单克隆抗体，检测玉米赤霉烯酮的操作方便、检测速度快；所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的线性范围为10-300μg/kg。二、所述玉米赤霉烯酮荧光定量检测卡的制备方法中，将荧光微球表面进行活化处理后，采用化学偶联方法来标记抗体，形成抗体与荧光微球的稳定结合，进一步保证检测结果精度。以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。当前第1页12