一种快速定量测定铁氧化菌对铁氧化能力的方法与流程

技术领域：

本发明涉及生态环境领域，更具体涉及一种厌氧条件下快速定量测定铁氧化菌对铁氧化能力的方法，尤其适用于测定土壤、沉积物和地下水等环境中活性铁的含量及铁氧化细菌的铁氧化能力测定。

背景技术：
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铁是自然界中较为活跃的变价元素，在不同的氧化还原条件下，可频繁的发生还原溶解、氧化沉淀等反应，能深刻影响到土壤有机质(碳元素和氮元素)的转化、温室气体的排放以及土壤/沉积物中重金属的迁移特征。

土壤中的活性铁一般指容易被还原、络合和酸、碱溶解的铁氧化物，由于目前提取方法各异，即便是同一样品，所测定的含量相差甚远。参照近十年来国内外的研究报道：研究土壤中活性铁参与的生物地球化学循环过程，基本上是以盐酸浸提为主；即便如此，盐酸浸提的方法尚存较大差异，如浸提液中hcl的浓度从0.5m到2m不等，浸提时间从0.5h到24h不等，浸提方式包括自然静置、震荡、无氧环境等。由于各实验方法的不统一，对研究结果必定会造成较大影响。基于此，本发明旨在开发一种快速定量测定微生物氧化铁能力的比色方法。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种快速定量测定厌氧条件下铁氧化菌对其铁氧化能力的方法。在土壤、沉积物和溶液中测定微生物驱动的铁氧化/还原能力时，本方法大大缩短了浸提时间和过滤时间，降低了实验成本，提高了研究效率，且实验结果准确，重现性高。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种快速定量测定厌氧条件下铁氧化菌群的铁氧化能力的方法，其步骤是：

(1)富集液的取样和浸提：

在厌氧手套箱中(n2,h2和co2比例为80:10:10,v/v)准确吸取不同培养时间段的富集液2ml(或土壤、沉积物等固体样品不高于2g)，加入28ml浓度为0.5mol/l的盐酸溶液(若试样中活性铁含量较高，所用的盐酸溶液的浸提体积提高数倍)浸提28－32分钟，每3－6分钟晃动浸提液5－8次，浸提结束后用中速定性滤纸过滤，即得到浸提液，在厌氧条件下放置备用。

所述的不同培养时间段指的是：培养间隔时间为1－2d；浸提固体样品时应适度分散。

(2)溶液制备：

稀盐酸(0.5mol/l)的制备：吸取43ml浓盐酸，用去离子水定容至1l容量瓶；

铁标样的制备：称取1.000g高纯铁，溶解于稀盐酸(0.5mol/l)中，加热(50℃－60℃)使高纯铁溶解，待冷却(20℃－25℃)后用稀盐酸(0.5mol/l)定容至1l容量瓶，即为母液；吸取25ml母液，加入稀盐酸(0.5mol/l)定容至1l容量瓶，即配成25mg/l的铁标样；

邻菲罗啉显色剂(1.00g/l)的制备：称取1.000g固体邻菲罗啉溶于水中，用去离子水定容至1l容量瓶；

盐酸羟胺溶液(100g/l)的制备:称取10g固体盐酸羟胺(nh2oh·hcl)溶于水中，用去离子水定容至100ml容量瓶；

乙酸钠溶液(100g/l)的制备:称取100g固体乙酸钠(ch3coona·3h2o)溶于水中，用去离子水定容至1l容量瓶。

(3)标准曲线测定：

分别取步骤(2)中的铁标样0,1,2,3,4,5,6ml于25ml比色管中，加入1ml步骤(2)中的盐酸羟胺溶液，加入8ml步骤(2)中的乙酸钠溶液，加入10ml步骤(2)中的邻菲罗啉显色剂，加去离子水定容至25ml容量瓶，厌氧下摇匀，30min后在510nm波长处比色测定各个吸光度，根据各吸光度和7个标样的浓度算出标准曲线。

(4)fe²⁺的测量：

吸取步骤(1)中的浸提液1ml(该体积可因体系中活性铁浓度可适当调整)于25ml比色管中，加入1ml步骤(2)中的乙酸钠溶液，加10ml步骤(2)中的邻菲罗啉显色剂，加去离子水定容至25ml容量瓶，摇匀，30min后在510nm波长处比色测定吸光度；

(5)总活性铁的测量：

取样品浸提液(取样和浸提方法同步骤1)1ml(该体积可因体系中活性铁含量适当调整)于25ml比色管中，加入1ml步骤(2)中的盐酸羟胺，加8ml步骤(2)中的乙酸钠溶液，加10ml步骤(2)中的邻菲罗啉显色剂，加去离子水定容至25ml容量瓶，摇匀，30min后在510nm波长处比色测定吸光度；

(6)厌氧条件下铁氧化菌铁氧化能力计算：

富集液/样品中总活性铁的含量＝n×(aa+b)(1)

其中：a为步骤(4)和(5)中510nm处的吸光度；n为取样稀释倍数；a，b分别为步骤(3)中标准曲线对应的数值；

厌氧条件下fe³⁺含量＝样品/富集液中总活性铁的含量-样品/富集液中二价铁的含量(2)

亚铁氧化速率＝(x1–x0)/(d1–d0)(3)

式中，x1和x0分别代表样品d1天fe³⁺含量和上一次d0天所对应的样品fe³⁺含量，亚铁氧化速率的单位为mg.l^-1.d^-1或mg.kg^-1.d^-1。

通过上述技术措施，解决了因传统方法浸提、滤膜过滤等与空气长时间接触造成的亚铁自然氧化，呈“假阳性”结果等技术难点；通过一系列对照试验证实，本发明方法具有测试结果快速准确、成本低廉、重现性强等特点。

具体而言，本方法在测定富集液、土壤和沉积物中微生物驱动的铁氧化/还原能力时，缩短了浸提时间1.5h－23.5h，节省过滤时间1h－2h，每个样品降低了实验成本2－3元。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、快速准确，实验结果重现性好；

2、用中速定性滤纸过滤浸提液，替代了传统的一次性滤膜注射过滤，降低了实验成本，提高了实验效率，同时也避免了试样中的fe²⁺在操作中再次被氧化；

3、提供了仔细完整的实验操作步骤；

4、方法可靠，适用面广，可检测不同环境中的微生物驱动铁氧化/还原能力。

附图说明

图1为一种快速定量测定厌氧条件下铁氧化菌群的铁氧化能力的方法测定铁标准曲线示意图。

图1表示测样体系中标铁含量在0－6mg/l范围内，吸光度od值与铁含量符合线性关系，满足如下关系：

y＝5.3803x－0.0045

其中：x为所测溶液吸光度值；y为溶液体系对于铁浓度(mg/l)。

图2和图3为几种土壤中硝酸盐依赖性铁氧化细菌对亚铁的氧化能力测定示意图：

图2表示四种土壤中硝酸盐依赖性铁氧化细菌对富集培养基中亚铁的氧化能力(转化为fe³⁺含量)；

图3表示四种土壤中硝酸盐依赖性铁氧化细菌培养过程中对亚铁的氧化速率。

具体实施例

实施例1

一种快速定量测定厌氧条件下铁氧化菌群的铁氧化能力的方法，其步骤是：

(1)富集液的取样和浸提：

在厌氧手套箱中(n2,h2和co2比例为80:10:10,v/v)准确吸取不同培养时间段的富集液2ml，加入28ml浓度为0.5mol/l的盐酸溶液浸提30分钟，每5分钟晃动浸提液5－8次，浸提结束后用中速定性滤纸过滤，即得到浸提液，在厌氧条件下放置备用。

所述的不同培养时间段指的是：培养间隔时间为1或2d；浸提固体样品时应适度分散。

(2)溶液制备：

稀盐酸(0.5mol/l)的制备：吸取43ml浓盐酸，用去离子水定容至1l容量瓶；

铁标样的制备：称取1.000g高纯铁，溶解于稀盐酸(0.5mol/l)中，水浴加热(50℃－60℃)使高纯铁溶解，待冷却(20℃－25℃)后用稀盐酸(0.5mol/l)定容至1l容量瓶，即为母液；吸取25ml母液，加入稀盐酸(0.5mol/l)定容至1l容量瓶，即配成25mg/l的铁标样；

邻菲罗啉显色剂(1.00g/l)的制备：称取1.000g固体邻菲罗啉溶于水中，用去离子水定容至1l容量瓶；

盐酸羟胺溶液(100g/l)的制备:称取10g固体盐酸羟胺(nh2oh·hcl)溶于水中，用去离子水定容至100ml容量瓶；

乙酸钠溶液(100g/l)的制备:称取100g固体乙酸钠(ch3coona·3h2o)溶于水中，用去离子水定容至1l容量瓶。

(3)标准曲线测定：

分别取步骤(2)中的铁标样0,1,2,3,4,5,6ml于25ml比色管中，加入1ml步骤(2)中的盐酸羟胺溶液，加入8ml步骤(2)中的乙酸钠溶液，加入10ml步骤(2)中的邻菲罗啉显色剂，加去离子水定容至25ml容量瓶，厌氧下摇匀，30min后在510nm波长处比色测定各个吸光度，吸光度和铁标准浓度对应关系见表1：

表1fe标准曲线

经计算，吸光度和铁含量满足以下关系:

y＝5.3803x-0.0045r²＝1

其中：y表示铁溶液的浓度(含量)；x表示测量体系对应的吸光度；r²表示相关系数。

(4)fe²⁺的测量：

吸取步骤(1)中的浸提液1ml于25ml比色管中，加入8ml步骤(2)中的乙酸钠溶液，加10ml步骤(2)中的邻菲罗啉显色剂，加去离子水定容至25ml容量瓶，摇匀，30min后在510nm波长处比色测定吸光度；

(5)总活性铁的测量：

取样品浸提液(取样和浸提方法同步骤(1))1ml(该体积可因体系中铁浓度适当调整)于25ml比色管中，加入1ml步骤(2)中的盐酸羟胺，加8ml步骤(2)中的乙酸钠溶液，加10ml步骤(2)中的邻菲罗啉显色剂，加去离子水定容至25ml容量瓶，摇匀，30min后在510nm波长处比色测定吸光度；

(6)厌氧条件下铁氧化菌铁氧化能力(fe³⁺产量)的计算：

富集液/样品中总活性铁的含量＝n×(5.3803a-0.0045)

其中：a为步骤(4)和(5)中510nm处的吸光度；n为取样稀释倍数。

厌氧条件下铁氧化菌铁氧化能力(fe³⁺产量)＝富集液中总活性铁的含量-富集液中二价铁的含量。

亚铁氧化速率＝(x1–x0)/(d1–d0)

式中，x1和x0分别代表样品d1天fe³⁺含量和上一次d0天所对应的样品fe³⁺含量，亚铁氧化速率的单位为mg.l^-1.d^-1或mg.kg^-1.d^-1。

本方法测定效率高、成本相对较低、实验重复性好，盐酸浸提的铁浓度在0-6mg/l之间与吸光度的线性关系良好，表明本方法准确可靠，适用面广，可以快速检测土壤、沉积物、微生物培养基、地下水等各种环境体系中的二价铁和三价铁含量。

实施例2：

一种快速定量测定四种土壤中硝酸盐依赖性铁氧化细菌在厌氧条件下对亚铁氧化能力的测定：

在本实施例中，使用实施例1中的测定方法在厌氧条件下测定了湖北省咸宁和潜江市不同土壤中硝酸盐依赖性铁氧化细菌在富集条件下的亚铁氧化能力。

本实施例中的实验组为：富集培养基接种经过三代富集培养的菌悬液，接种量为5％(v/v)。

本实施例中的对照组：富集培养基未接种菌悬液。

厌氧条件下，25℃培养14天，分别在1、2、3、4、5、6、8、10、12、14天按照实施例1中的方法取样分析各样品的亚铁氧化能力。表2、图2和图3为实验组和对照组亚铁氧化能力的结果：

表2不同培养时间段土壤的亚铁氧化能力

图2和图3为几种土壤富集液经过10次取样分析，各样品中的亚铁氧化能力，因富集液中总活性铁的初始浓度为558.5mg/l，由图2可知，四种土样在培养结束时微生物驱动的铁氧化能力为80.42％–86.58％，而未接种的对照处理中因环境因素造成溶液中亚铁的自然氧化仅为2.73％；由图3可知，四种土壤在培养过程中，微生物驱动的亚铁氧化速率为0.01mg.l^-1.d^-1–141.27mg.l^-1.d^-1，大部分土壤在培养前6天氧化能力较强。

通过该方法测定的土壤微生物驱动的铁氧化能力与已公开报道的文献数据(sobolevd,rodenee.suboxicdepositionofferricironbybacteriainopposinggradientsoffe(ii)andoxygenatcircumneutralph[j].applied&environmentalmicrobiology,2001,67(3):1328-34，和erice.roden,dmitrisobolev,brianglazer,etal.potentialformicroscalebacterialferedoxcyclingattheaerobic-anaerobicinterface[j].geomicrobiologyjournal,2004,21(6):379-391)较为接近，证实了该方法可靠性高。