一种茶叶中外源掺杂蔗糖的抗干扰快速检测方法与流程

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种茶叶中外源添加蔗糖的抗干扰快速检测方法。

背景技术：

近年来，为追求茶叶更好的表观品质，个别生产者在茶叶中添加蔗糖的现象时有发生。茶叶加工过程中所添加的蔗糖一方面可在香气、色泽等方面影响对成茶的感官品质评判；同时，由于蔗糖易吸潮、易变质和易滋生细菌等特点，对茶叶质量安全有较大的影响。因而，关于蔗糖添加在茶叶质量监管体系及消费者中引起越来越广泛的关注，相应的快速检测方法成为市场需要。为适应这一现状，我们前期开发了一种基于蔗糖水解和间苯二酚显色反应的针对茶叶中添加蔗糖快速筛查、检测的方法，以便于茶叶生产和流通过程中的实时监测。

但在实际应用中我们发现，该方法对发酵程度较高的红茶等茶类样品中的蔗糖成分检测灵敏可靠，而对绿茶(特别是夏秋绿茶)的显色及检测过程中，存在较严重的干扰现象：一方面，在所采用的强酸性的反应溶液条件下(1：1盐酸溶液)，果糖(蔗糖水解产生)在单纯的盐酸溶液中(不含间苯二酚显色试剂时)与样品基质本身会自发地发生微弱的显色反应，自身呈现一定的浅红色，且易形成絮状浑浊，干扰颜色判断和吸光度测定；而与此现象相反的是，在含有显色试剂的检测试管中，样品基质中的某些成分干扰间苯二酚与果糖的反应，反而使得蔗糖成分无法正常显色，造成假阴性检测结果。

因而，开发一种更加普适的、能够抵抗茶叶样品本身基质干扰的茶叶中所添加蔗糖的快速检测方法，具有明显的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种茶叶中掺杂蔗糖的抗干扰快速检测方法，以适应于不同茶类样品的检测需求。该方法具有抗干扰能力强、适用范围广、操作方便、检测迅速、结果可靠等特点。

为实现上述目标，本发明采用如下技术方案：

一种茶叶中外源掺杂蔗糖的抗干扰快速检测方法，所述方法为：

(1)待测茶叶样品用水提取或冲泡，除去茶叶渣得到待测茶汤样品；

(2)抗干扰处理：将待测茶汤样品中加入吸附剂，混匀后常温下反应或水浴加热3～30min，离心，取上清液作为待测样品溶液；

(3)待测样品溶液利用间苯二酚显色试剂进行定性判定和定量检测；

所述吸附剂为交联聚乙烯吡咯烷酮与活性炭质量比1:0～1的混合，其中的0代表可以为0，即不加活性炭，但优选吸附剂为交联聚乙烯吡咯烷酮与活性炭质量比1:0.1～0.5的混合，更优选1:0.2的混合；吸附剂的加入量是以待测茶汤样品的体积计为5～100mg/ml，优选10～50mg/ml，更优选30mg/ml；

进一步，所述步骤(1)中，待测茶汤样品按以下三种方案之一制备：

(1-a)对于单纯定性判定，将待测茶叶样品，按照茶、水的质量比为1：20～100(优选1:50)加入沸水冲泡2～10min，沥出茶汤作为待测茶汤样品，然后进行步骤(2)的抗干扰处理和步骤(3)的定性判定

(1-b)对于定量检测，准确称取待测茶叶样品，按照茶、水的质量比为1:10～50(优选1:40)，加入煮沸的去离子水，超声提取2次，每次超声提取5～10min，合并滤液，定容后得到待测样品溶液，然后进行步骤(2)的抗干扰处理和步骤(3)的定量检测；滤液定容的体积以茶叶的质量计为50～200ml/g(优选100ml/g)。

进一步，超声提取茶叶样品后，可用水清洗茶叶渣，清洗液并入滤液，然后定容得到待测样品溶液。

(1-c)对于既要定性判定又需进一步定量检测的样品，或需先行定性判定而根据定性判定结果决定是否需定量检测的样品，优先选用(1-b)方法制备待测茶汤样品。

所述步骤(2)中，待测茶汤样品中加入吸附剂后，优选50℃水浴，加热10min，然后离心、取上清液作为待测样品溶液。

所述步骤(3)中，定性判定的步骤优选为：

(3-a1)配制显色试剂：将间苯二酚溶于质量分数7～25％的盐酸(优选18～20％盐酸)，配成间苯二酚浓度0.1～2.0g/l的溶液；其中间苯二酚的浓度优选为0.5g/l；

(3-a2)定性判定：取两只试管，分别为试管a、b，分别加入等体积的显色试剂，然后取相同体积的去离子水和待测样品溶液分别加入试管a、b，去离子水或待测样品溶液与显色试剂的体积比为1：5～50，(优选1：10)。然后将两试管同时浸入开水浴中，反应2～10min后取出试管，用水冲洗冷却后对比两试管内液体颜色，以试管a颜色为参照，若试管b内出现明显红色，则判定为阳性，即所测茶叶中掺杂了蔗糖；若试管b内未出现明显红色，则判定为阴性，茶叶中未添加蔗糖。

所述步骤(3)中，定量检测的步骤优选为：

(3-b1)配制显色试剂：间苯二酚溶于质量分数7～25％的盐酸(优选18～20％盐酸)，配成间苯二酚浓度0.1～2.0g/l的溶液，所述间苯二酚的浓度优选为0.5g/l；

(3-b2)配制蔗糖标准溶液：以去离子水溶解分析纯蔗糖样品，分别配制3种以上不同浓度的蔗糖水溶液作为标准溶液，蔗糖标准溶液的浓度范围0.01～5g/l；

(3-b3)绘制工作曲线：根据前述所配制蔗糖标准溶液个数取相应数量的试管，编号记录；分别将去离子水以及蔗糖标准溶液与显色试剂按照体积比1：10～100(优选1：30)加入对应编号的试管，并分别混合摇匀，80～100℃水浴加热1～10min后取出，立即用水冲洗冷却至室温，在400～500nm波长条件下，以前述去离子水所在试管溶液为参比溶液，使用分光光度计测定各试管中蔗糖溶液的吸光度；然后以蔗糖标准溶液的浓度为横坐标、相应的吸光度数值为纵坐标，绘制工作曲线并拟和得到标准曲线方程；

(3-b4)实际样品测定：按照待测样品数量，取相应数量的试管并编号记录，试管中分别加入相应样品编号的、与步骤(3-b3)中试管中去离子水或蔗糖标准溶液相同体积的待测样品溶液，并加入与步骤(3-b3)中各试管中相同体积的显色试剂，混匀后按照步骤(3-b3)相同的方法水浴加热、分光光度计检测，仍以步骤(3-b3)所用参比溶液作为此次检测的参比溶液，使用分光光度计测定各试管中溶液的吸光度，然后根据步骤(3-b3)的标准曲线方程，换算得到相应待测样品溶液中的蔗糖浓度，并结合前述前处理步骤中的样品质量和定容后的提取液体积关系，计算得到相应待测茶叶中掺杂蔗糖的含量。

所述定量检测步骤(3-b3)中，蔗糖标准溶液与显色试剂的体积比优选为1:30；

步骤(3-b3)中，水浴温度优选为100℃，水浴加热时间优选为4min，分光光度计的检测波长优选为485nm。

本发明的抗干扰检测原理是：根据本实验研究，当茶叶样品提取液中存在较高浓度的儿茶素类组分时，会对间苯二酚显色反应本身造成严重的干扰；除此之外，提取液中的其他有色成分对显色后的检测过程——特别是用肉眼进行定性判定的过程存在较大的干扰，影响了直接判定结果的可靠性。交联聚乙烯吡咯烷酮和活性炭分别对上述两种干扰有一定的去除效果，因此本方法中，采用交联聚乙烯吡咯烷酮-活性炭组合吸附剂，有效消除了茶叶提取液中的前述两类干扰基质。经过抗干扰处理以后，茶叶提取液中的蔗糖在盐酸条件下发生水解反应，生成一分子的葡萄糖和一分子的果糖；果糖在盐酸条件下与显色试剂中的间苯二酚发生高选择性的显色反应，生成鲜红色的产物，产物在485nm附近有最大吸收，因而可根据反应后的溶液颜色识别和吸光度数值分别进行茶叶中掺杂蔗糖的定性判别和定量检测，从而解决了绿茶中掺杂蔗糖快速检测方法中的假阴性问题；同时，本抗干扰方法消除了待测样品溶液本身在酸性条件下的颜色背景，避免了吸光度测定时特殊参比溶液的配置和使用，不需要每个样品都单独配制一个该样品的参比溶液，而是所有的样品均采用相同的参比即可，由此简化了吸光度测定操作并减少了浓盐酸用量，因而对于红茶等儿茶素含量较低的发酵茶类的检测也同样具有实际应用价值。

本发明的茶叶中蔗糖抗干扰快速检测方法具有如下技术特点：

1.本发明可对茶叶加工过程或成茶中人为添加的蔗糖实现快速的定性判定和定量检测。方法有效消除了茶叶样品基质对检测的干扰，适用范围广，可用于经过发酵或不发酵工艺加工生产的所有茶类的茶叶样品；且半定量检测不需借助任何检测设备，肉眼即可判定；可以实现实时、快速、现场检测，适用于我国目前茶叶流通和销售相对分散的特点，可用于茶叶销售端的质量监管。

2.与常用的液相色谱或液相色谱-质谱联用技术相比较，本方法所用仪器简单，对操作者的专业化水平要求低，避免了检测过程对大型仪器和专业实验室的严重依赖，并可显著提高检测效率，适用于我国茶叶生产和流通相对分散的特点，对茶叶实际生产、流通及监督过程均具有推广应用价值。

综上所述，本发明旨在提供一种针对目前茶叶产业现状中人为掺杂蔗糖问题的抗干扰快速检测技术，为茶叶产业的质量安全管理提供技术支持。该方法能够快速地定性或者定量地测定样品中蔗糖掺杂情况。

附图说明

图1经抗干扰处理前(a)后(b、c、d)3％蔗糖含量的绿茶样品定性判定实验现象对比图。其中，a图为未经抗干扰处理，b图为加入活性炭处理，c图为加入交联聚乙烯吡咯烷酮处理，d图为加入交联聚乙烯吡咯烷酮和活性炭混合吸附剂处理。

图2吸附剂用量对茶叶加工过程中所添加蔗糖的检测回收率影响结果图。其中插入的试管照片为三例不同吸附剂用量条件下的绿茶样品显色结果照片。

图3茶汤经抗干扰处理后加标回收率实验结果。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步说明，但是本发明的保护范围不限于此。

实施例1

不同吸附剂处理效果对比实验

1)称取间苯二酚0.10g溶于100ml浓盐酸后，与100ml去离子水混合，配成显色试剂；

2)称取实验室预先炒制的3％蔗糖含量的绿茶样品3.0g，加入沸水150ml冲泡5min，沥出茶汤，作为待测茶汤。

3)取上述茶汤样品1ml各四份，分别置于4个编号的离心管中，离心管1不加入吸附剂，离心管2加入30mg活性炭，离心管3加入30mg交联聚乙烯吡咯烷酮，离心管4加入25mg交联聚乙烯吡咯烷酮和5mg活性炭；

混匀后50℃水浴加热10min，离心；

4)取8支相同规格的透明玻璃试管，其中4只各加入1ml盐酸溶液(浓盐酸与去离子水体积比1:1混合得到)，计为a1、b1、c1、d1管；另外四支各加入1ml显色试剂，计为a2、b2、c2、d2管。在a1和a2管中分别加入0.1ml离心管1的上清液；在b1和b2管中分别加入0.1ml离心管2的上清液；在c1和c2管中分别加入0.1ml离心管3的上清液；在d1和d2管中分别加入0.1ml离心管4的上清液；

5)将上述8支试管同时浸入沸水浴中加热，约5min后同时取出，自来水冲洗试管冷却后，实验结果照片如图1中所示；

每组的两个玻璃瓶中分别包括样品-盐酸本底颜色情况(左瓶)和样品-间苯二酚显色结果(右瓶)；当右瓶与左瓶颜色相比，呈现明显红色时判定为蔗糖添加阳性，否则为阴性。与其他组现象相比，d组本底颜色最低，且显色结果最为明显，抗干扰能力最强；d组明显为阳性检测结果，与样品实际情况一致；b、c两组颜色辨别可靠性弱于d组，表明前处理的抗干扰能力较差；而a组由于茶叶基质的干扰，呈现假阴性结果。因此，综合来看，采用交联聚乙烯吡咯烷酮和活性炭混合吸附剂的抗干扰效果最佳。

实施例2、吸附剂用量对含蔗糖的茶汤样品显色效果的影响

1)分别称取加工过程中加入蔗糖的红茶、绿茶样品各1.0g分别置于锥形瓶中，各加入约40ml沸水，锥形瓶放入超声波处理器中超声提取5min；滤出提取液后，再次加入沸水40ml，重复上述超声处理。用去离子水清洗各自茶渣两次，合并同一茶叶样品的两次超声提取液和茶渣清洗液，冷却后定容至100ml，作为茶汤样品。

2)取7个离心管，分别放入上述所得红茶茶汤样品各1ml，并依次加入不同质量的吸附剂，吸附剂为交联聚乙烯吡咯烷酮和活性炭质量比1:0.2的混合，混匀后水浴加热10min，离心、取上清液作为红茶待测样品溶液(7个)；以相同的操作处理绿茶茶汤样品，得到7个经不同吸附剂用量抗干扰处理的绿茶待测样品溶液。

3)以去离子水溶解分析纯蔗糖样品，分别配制0，0.05，0.10，0.30，0.50g/l浓度的蔗糖溶液作为标准溶液。

4)称取间苯二酚0.10g溶于100ml浓盐酸后，与100ml去离子水混合，配成显色试剂；

5)取编号为s0#～s4#的5支试管，依次加入0.2ml步骤3)所配制的蔗糖标准溶液和6ml步骤4)所配制的显色试剂，混匀后，于沸水浴中加热4min后取出，立即用水冲洗冷却至室温；在485nm波长条件下，以s0#试管溶液为参比溶液，使用分光光度计测定s1#～s4#试管中液体的吸光度；然后以蔗糖标准溶液的浓度为横坐标、相应的吸光度数值为纵坐标，绘制工作曲线并拟和得到标准曲线方程；

6)取编号1#～14#的14支试管，依次加入步骤2)所得到的待测样品溶液各0.2ml，并各加入6ml步骤4)所配制的显色试剂，混匀后，于沸水浴中加热4min，取出试管并立即用水冲洗冷却至室温；在485nm波长条件下，仍以s0#试管溶液为参比溶液，使用分光光度计测定1#～14#试管中液体的吸光度；然后根据步骤5)的标准曲线方程，计算得到相应待测样品溶液中的蔗糖浓度，并结合前述前处理步骤中的样品质量和定容后的提取液体积关系，计算得到相应待测茶叶中掺杂蔗糖的含量；根据样品加工过程中所加入的蔗糖量，换算得到相应回收率。具体实验结果如图2所示。

可见，使用吸附剂进行茶汤样品抗干扰处理后，红茶样品中蔗糖的回收率有一定的提高；绿茶样品中的蔗糖检测回收率则有显著提高，从-76％提高到101％，检测性能明显增强；综合本实验结果和对茶汤基质的检测，最终选定30mg/ml为最佳吸附剂用量。

实施例3、加标回收率实验

按前述实施例2的条件配制试剂和红茶、绿茶空白茶汤样品，并绘制工作曲线。在所得两种茶汤样品中，各作0，0.05，0.10，0.20，0.30，0.60g/l五个浓度水平的蔗糖添加，吸附剂同实施例2，吸附剂用量为30mg/1ml茶汤样品；并测定检测方法的回收率。实验结果显示，在0.05～0.60g/l的加标水平下，方法对红茶茶汤中蔗糖的检测回收率为103.4％～117.8％，对绿茶茶汤中蔗糖的检测回收率为91.9％～100.5％。

将上述茶汤中加标浓度水平折算成干茶中蔗糖含量并在excel中作图，拟合得蔗糖加入量与检出量之间的线性方程为y＝1.0022x+0.52(r²＝0.9985),具体结果如图3所示。由此结果可知，本发明所提供的方法对不同的红茶、绿茶基质响应高度一致，证明了本方法在蔗糖检测中优异的抗干扰能力。

实施例4、对两个茶叶样品(编号为样品1和样品2)进行蔗糖掺杂定性判别

1)按前述实施例2的条件配制显色试剂；

2)分别称取待测茶叶样品3.0g，加入沸水150ml冲泡5min，沥出茶汤作为茶汤样品1和茶汤样品2。

3)分别取上述茶汤样品1和茶汤样品2各1ml，置于离心管中，各加入30mg吸附剂(吸附剂为交联聚乙烯吡咯烷酮和活性炭质量比1:0.2的混合)，混匀后水浴加热10min，离心，各取上清液0.1ml加入透明试管中(分别计为试管a和b)，另取一支试管加入0.1ml去离子水，计为试管c。上述三支试管中各加入1ml显色试剂，混匀。

4)将上述三支试管同时浸入沸水浴中加热，约5min后同时取出，自来水冲洗试管冷却后，以c为标准，分别对比a，b试管的颜色。与试管c相比，发现试管a内出现明显红色，说明相应的茶叶样品1为阳性样品，即茶叶样品1中掺杂了蔗糖；而试管b内溶液颜色无肉眼可见红色，故判断知其相对应的茶叶样品2中未掺杂蔗糖。

实施例5、茶叶中掺杂蔗糖含量的定量检测

1)按前述实施例2步骤1)的条件提取茶汤样品，并按照实施例2步骤3)、4)、5)绘制工作曲线，excel中拟合得到工作曲线方程为y＝5.0143x+0.0091(r²＝0.9986)。

2)取步骤1)所提取茶汤样品1ml加入事先放入30mg吸附剂的离心管，摇匀后50℃水浴加热10min；离心，取上清液0.2ml于玻璃试管中，加入6ml显色试剂后，将试管放入沸水浴中加热4min。

3)取出试管并在流动自来水下冲洗冷却至室温。在485nm波长条件下，以与工作曲线数据测定时相同的参比溶液作为参比，测定试管中液体的吸光度。将吸光度数据带入步骤1)所得工作曲线，计算得到各样品中相应的蔗糖添加量(以干茶百分比计)。实验结果如下表1：

表1