一种注射液中磷酸盐的检测方法与流程

本发明属于药品分析检测的技术领域，特别是指一种注射液中磷酸盐的检测方法。

背景技术：

目前，测定磷酸盐的主要方法是磷钼蓝法，该方法易于操作，对环境和仪器要求不高，适用性强。但是，现有的磷钼蓝法在进行磷酸盐测定时，还存在以下几个问题：（1）所用还原剂种类繁多，不同还原剂形成的磷钼蓝络合物稳定时间也有所不同，实验室常用抗坏血酸做还原剂，使用时需水浴加热，冷却至室温后方可测定，操作繁琐；（2）本法在测定混合糖电解质注射液和复方醋酸钠葡萄糖注射液中磷酸盐含量时，结果偏低，增加显色剂的量，结果无明显改善；另外，本法在测定小儿电解质k1号注射液中磷酸盐时，随着样品放置时间的延长，再次测定磷酸盐时，结果呈增长趋势，实验结果不稳定。所有这些因素导致磷钼蓝法在进行磷酸盐测定时，实验结果误差大，准确性差，检测效率低，给检测工作带来了很大的不便。

技术实现要素：

本发明提供一种注射液中磷酸盐的检测方法，解决了现有技术中磷钼蓝法测定磷酸盐含量时存在操作繁琐、显色不完全以及实验结果不稳定、误差大和准确度差的问题。

本发明的一种注射液中磷酸盐的检测方法，其主要是通过以下技术方案加以实现的：包括以下步骤：（1）在室温下，选取0.2-0.5mmol/l的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠为对照品溶液；（2）精密量取若干个不同体积的步骤（1）的对照品溶液，分别置于50ml容量瓶中，加入0.1-0.5%的edta溶液1ml；（3）在步骤（2）的容量瓶中，分别加入3-6%的钼酸铵溶液2ml、0.3-0.6%的对苯二酚溶液2ml、30-40%的醋酸钠溶液6ml，加水定容，摇匀，并置于暗处，放置5-30min；（4）按照紫外-可见分光光度法，在710-715nm波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；（5）在室温下，精密量取待测溶液8-15ml，置于50ml容量瓶中，加入0.1-0.5%的edta溶液1ml，按照步骤（3）至步骤（4）的方法，测其吸光度，并通过步骤（4）得到的标准曲线，计算磷酸根的含量。

本发明在室温下，以对苯二酚为还原剂，在710-715nm波长处测吸光度，其专属性好，在该波长处，无干扰；耐用性好，在暗处放置的5-30min内，溶液稳定性良好；与抗坏血酸相比，对苯二酚还原能力强，显色反应快；edta溶液的添加，准确性提高，同时，有效防止了磷酸盐的继续生成，提高对照品溶液和待测溶液的稳定性，从而充分保证了检测结果的准确性、平行性和可再现性。

作为一种优选的实施方案，所述室温为10-30℃，所述待测溶液中磷酸盐浓度为0.2-0.5mmol/l。在10-30℃条件下，可以进一步提高显色反应的速度，增强溶液的稳定性，方便检测。

作为一种优选的实施方案，所述室温为25℃，所述步骤（3）中于暗处放置5min，所述edta溶液的浓度为0.1%，所述对照品溶液的浓度为0.5mmol/l，所述待测溶液中磷酸盐浓度为0.5mmol/l，所述步骤（4）中在714nm波长处测吸光度。使用0.1%的edta溶液，可以明显提高回收率，即检测的准确度，并降低edta溶液的用量，节约成本；在714nm波长处，阴性溶液无干扰，专属性更好；暗处放置5min，该反应即显色完全，提高了检测效率；25℃的检测条件，便于控制，有利于检测条件一致。

作为一种优选的实施方案，所述步骤（1）中，对照品溶液的配制方法为：（a）精密称取在105℃干燥2h的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠0.4-1.0mmol，置于100ml容量瓶中，加水溶解，稀释，定容，摇匀；（b）精密量取步骤（a）所得溶液5ml置于100ml容量瓶中，加水稀释，定容，摇匀，即得对照品溶液。这种浓度的对照品显色反应明显，显色反应进行的快，有利于提高标准曲线的准确度。

作为一种优选的实施方案，所述步骤（2）中，edta溶液的配制方法为：称取edta0.1-0.5g，置于100ml容量瓶中，加适量水溶解，定容，摇匀，即得。edta的添加，能够明显提高检测结果的准确性，即提高回收率，并能够抑制磷酸盐的继续生成，提高溶液的稳定性；edta在0.1-0.5%浓度范围内均可以使显色反应进行完全。

作为一种优选的实施方案，所述步骤（3）中，钼酸铵溶液的配制方法为：称取钼酸铵3-6g，置于100ml容量瓶中，加适量水溶解，再加2ml浓硫酸，用水定容，摇匀，即得。本发明采用了钼酸铵的硫酸溶液，提高了反应的速度，使反应更快的显色。

作为一种优选的实施方案，所述步骤（3）中，对苯二酚溶液的配制方法为：称取对苯二酚0.3-0.6g，置于100ml容量瓶中，加适量水溶解，再加2滴浓硫酸，用水定容，摇匀，即得。

作为一种优选的实施方案，所述步骤（3）中，醋酸钠溶液的配制方法为：称取三水合乙酸钠100-200g，加入100ml水，水浴加热溶解，放置室温，即得。无水醋酸钠溶解后易析出，这里选用三水合醋酸钠加水溶解，折算后醋酸钠质量分数为30-40%。

作为一种优选的实施方案，所述步骤（5）中，待测溶液的配制方法为：精密量取待测样品，加水稀释，形成磷酸根浓度为0.2-0.5mmol/l的溶液。

本发明的有益效果：本发明在室温下，以对苯二酚为还原剂，在710-715nm波长处测吸光度，其专属性好，在该波长处，无干扰；耐用性好，在暗处放置的5-30min内，溶液稳定性良好；与抗坏血酸相比，对苯二酚还原能力强，显色反应快；edta溶液的添加，提高了回收率，增强了检测结果的准确性，同时，有效防止了磷酸盐的继续生成，提高对照品溶液和待测溶液的稳定性；本发明操作简单，条件温和，容易控制，检测效率高，检测结果具有很好的准确性、平行性和可再现性。

附图说明

图1为本发明对照品溶液的吸光光度图；

图2为本发明空白溶液的吸光光度图；

图3为本发明阴性溶液的吸光光度图。

具体实施方式

下面将结合本发明的具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一种注射液中磷酸盐的检测方法，包括以下步骤：

（1）在室温下，选取0.2-0.5mmol/l的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠为对照品溶液；

（2）精密量取若干个不同体积的步骤（1）的对照品溶液，分别置于50ml容量瓶中，加入0.1-0.5%的edta溶液1ml；

（3）在步骤（2）的容量瓶中，分别加入3-6%的钼酸铵溶液2ml、0.3-0.6%的对苯二酚溶液2ml、30-40%的醋酸钠溶液6ml，加水定容，摇匀，并置于暗处，放置5-30min；

（4）按照紫外-可见分光光度法，在710-715nm波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

（5）在室温下，精密量取待测溶液8-15ml，置于50ml容量瓶中，加入0.1-0.5%的edta溶液1ml，按照步骤（3）至步骤（4）的方法，测其吸光度，并通过步骤（4）得到的标准曲线，计算磷酸根的含量。

优选地，所述室温为10-30℃，所述待测溶液中磷酸盐浓度为0.2-0.5mmol/l。

具体地，所述室温为25℃，所述步骤（3）中于暗处放置5min，所述edta溶液的浓度为0.1%，所述对照品溶液的浓度为0.5mmol/l，所述待测溶液中磷酸盐浓度为0.5mmol/l，所述步骤（4）中在714nm波长处测吸光度。

进一步地，所述步骤（1）中，对照品溶液的配制方法为：（a）精密称取在105℃干燥2h的磷酸二氢钾或磷酸二氢钠0.4-1.0mmol，置于100ml容量瓶中，加水溶解，稀释，定容，摇匀；（b）精密量取步骤（a）所得溶液5ml置于100ml容量瓶中，加水稀释，定容，摇匀，即得对照品溶液。

进一步地，所述步骤（2）中，edta溶液的配制方法为：称取edta0.1-0.5g，置于100ml容量瓶中，加适量水溶解，定容，摇匀，即得。

进一步地，所述步骤（3）中，钼酸铵溶液的配制方法为：称取钼酸铵3-6g，置于100ml容量瓶中，加适量水溶解，再加2ml浓硫酸，用水定容，摇匀，即得。

进一步地，所述步骤（3）中，对苯二酚溶液的配制方法为：称取对苯二酚0.3-0.6g，置于100ml容量瓶中，加适量水溶解，再加2滴浓硫酸，用水定容，摇匀，即得。

进一步地，所述步骤（3）中，醋酸钠溶液的配制方法为：称取三水合乙酸钠100-200g，加入100ml水，水浴加热溶解，放置室温，即得。

进一步地，所述步骤（5）中，待测溶液的配制方法为：精密量取待测样品，加水稀释，形成磷酸根浓度为0.2-0.5mmol/l的溶液。

实施例一

通过如下方法对复方醋酸钠葡萄糖注射液中磷酸盐进行检测：

（1）配制0.1%的edta溶液：称取edta0.1g，置于100ml容量瓶中，加适量水溶解，并至刻度，摇匀，即得。

（2）配制钼酸铵溶液：称取钼酸铵5g，置100ml量瓶中，加适量水溶解，再加2ml浓硫酸，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

（3）配制对苯二酚溶液：称取对苯二酚0.5g，置100ml量瓶中，加适量水溶解，再加2滴浓硫酸，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

（4）配制的醋酸钠溶液：称取三水合乙酸钠100g，加入100ml水，水浴加热溶解，放置室温，即得。

（5）配制的对照品溶液：精密称取在105℃干燥2小时的磷酸二氢钾136.09mg，置于100ml量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置于100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

（6）精密量取5个不同体积的上述对照品溶液，分别为4、6、8、10、12ml，分别置于50ml容量瓶中，加入上述0.1%的edta溶液1ml；

（7）在上述5个容量瓶中，分别加入5%的钼酸铵溶液2ml、0.5%的对苯二酚溶液2ml、30%的醋酸钠溶液6ml，加水定容，摇匀，并置于暗处，放置5min；

（8）按照紫外-可见分光光度法，在714nm波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

（9）精密量取待测样品即复方醋酸钠葡萄糖注射液15ml，置于50ml容量瓶中，用水稀释刻度，摇匀，即得待测液；精密量取该待测液10ml，置于50ml容量瓶中，加入上述0.1%的edta溶液1ml，然后，按照步骤（7）至步骤（8）的方法，测其吸光度，并通过上述标准曲线，计算磷酸根的含量，实验结果如表1所示。

本实施例中，复方醋酸钠葡萄糖注射液待测液中磷酸根的理论浓度为1.4927mmol/l，由表1可以看出，采用本发明的检测方法所得磷酸根含量与其理论值非常吻合，其标示量在99.56-99.83%之间；标示量就是测得的磷酸根浓度与理论值的比值，例如1.4879÷1.4927×100%=99.68%；表1中还列出了该待测样品即复方醋酸钠葡萄糖注射液在采用中国药典中规定的磷含量检测方法（简称常规方法）所得磷酸根的含量及其标示量，与常规方法相比，本发明的检测方法所得磷酸根的含量其检出值更切近理论值，即其标示量更接近100%。

表1复方醋酸钠葡萄糖注射液中磷酸根含量

实施例二

通过如下方法对混合糖电解质注射液中磷酸盐进行检测：

（1）配制0.5%的edta溶液：称取edta0.5g，置于100ml容量瓶中，加适量水溶解，并至刻度，摇匀，即得。

（2）配制钼酸铵溶液：称取钼酸铵6g，置100ml量瓶中，加适量水溶解，再加2ml浓硫酸，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

（3）配制对苯二酚溶液：称取对苯二酚0.6g，置100ml量瓶中，加适量水溶解，再加2滴浓硫酸，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

（4）配制的醋酸钠溶液：称取三水合乙酸钠150g，加入100ml水，水浴加热溶解，放置室温，即得。

（5）配制的对照品溶液：精密称取在105℃干燥2小时的磷酸二氢钾108.87mg，置于100ml量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置于100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

（6）精密量取5个不同体积的上述对照品溶液，分别为2、4、6、8、10，分别置于50ml容量瓶中，加入上述0.5%的edta溶液1ml；

（7）在上述5个容量瓶中，分别加入6%的钼酸铵溶液2ml、0.6%的对苯二酚溶液2ml、36%的醋酸钠溶液6ml，加水定容，摇匀，并置于暗处，放置30min；

（8）按照紫外-可见分光光度法，在715nm波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

（9）精密量取待测样品即混合糖电解质注射液3ml，置于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得待测液；精密量取该待测液15ml，置于50ml容量瓶中，加入上述0.5%的edta溶液1ml，然后，按照步骤（7）至步骤（8）的方法，测其吸光度，并通过上述标准曲线，计算磷酸根的含量，实验结果如表2所示。

本实施例中，混合糖电解质注射液待测液中磷酸根的理论浓度为9.9897mmol/l，由表2可以看出，采用本发明的检测方法所得磷酸根含量与其理论值非常吻合，其标示量在99.52-99.63%之间；表2中还列出了该待测样品即混合糖电解质注射液在采用中国药典中规定的磷含量检测方法（简称常规方法）所得磷酸根的含量及其标示量，与常规方法相比，本发明的检测方法所得磷酸根的含量其检出值即磷酸根浓度更切近理论值，即其标示量更接近100%。

表2混合糖电解质注射液中磷酸根含量

实施例三

通过如下方法对小儿电解质k1号注射液中磷酸盐进行检测：

（1）配制0.3%的edta溶液：称取edta0.3g，置于100ml容量瓶中，加适量水溶解，并至刻度，摇匀，即得。

（2）配制钼酸铵溶液：称取钼酸铵3g，置100ml量瓶中，加适量水溶解，再加2ml浓硫酸，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

（3）配制对苯二酚溶液：称取对苯二酚0.3g，置100ml量瓶中，加适量水溶解，再加2滴浓硫酸，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

（4）配制的醋酸钠溶液：称取三水合乙酸钠200g，加入100ml水，水浴加热溶解，放置室温，即得。

（5）配制的对照品溶液：精密称取在105℃干燥2小时的磷酸二氢钾54.44mg，置于100ml量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置于100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

（7）精密量取7个不同体积的上述对照品溶液，分别为4、6、8、10、12、14、16ml，分别置于50ml容量瓶中，加入上述0.3%的edta溶液1ml；

（8）在上述7个容量瓶中，分别加入3%的钼酸铵溶液2ml、0.3%的对苯二酚溶液2ml、40%的醋酸钠溶液6ml，加水定容，摇匀，并置于暗处，放置10min；

（8）按照紫外-可见分光光度法，在710nm波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

（9）精密量取待测溶液即小儿电解质k1号注射液8ml，置于50ml容量瓶中，加入上述0.3%的edta溶液1ml，然后，按照步骤（7）至步骤（8）的方法，测其吸光度，并通过上述标准曲线，计算磷酸根的含量，实验结果如表3所示，表3中还列出了该待测样品即小儿电解质k1号注射液在采用中国药典中规定的磷含量检测方法（简称常规方法）所得磷酸根的含量。

由表3可以看出，本实施例中，小儿电解质k1号注射液成分为甘油磷酸钾，根据标准中国药典中规定的磷含量检测方法进行小儿电解质k1号注射液中磷酸盐测定时，其含量在0.2606-0.2738mmol/l之间，而采用本发明的检测方法所得磷酸根含量在0.2773-0.2916mmol/l之间；因此，中国药典中规定的磷含量检测方法所得磷酸根含量的测定结果偏低，采用本发明的检测方法可以明显提高小儿电解质k1号注射液中磷酸根含量的测定结果，即本发明的方法可以更大程度的检出小儿电解质k1号注射液中的磷酸盐。

表3小儿电解质k1号注射液中磷酸根含量

实验1

样品制备：按照实施例一的方法配置对照品溶液；

按照复方醋酸钠葡萄糖注射液处方（醋酸钠3.20g，氯化镁0.31g，氯化钾1.30g，磷酸氢二钾0.26g，葡萄糖50.0g，注射用水加至1000ml）配制不含磷酸盐的阴性溶液，并按照实施例一的方法配置阴性溶液的待测液。

专属性实验：精密量取上述对照品溶液、阴性溶液待测液各10ml，分别置于50ml容量瓶中，另取一干燥洁净的50ml容量瓶作为空白溶液，分别立刻加入0.1%的edta溶液1ml；测定时，先后加入5%的钼酸铵溶液2ml、0.5%的对苯二酚溶液2ml、30%的醋酸钠溶液6ml，加水稀释至刻度，摇匀，暗处放置5min；按照紫外-可见分光光度法，在200-800nm波长范围内进行全波长扫描，实验结果见图1、图2、图3和表4。

表4扫描结果统计表

由图1、图2、图3和表4可以看出，本发明的检测方法在710-715nm范围内吸收正常，阴性溶液无干扰；并且，在714nm处，达到最大吸收；这说明本发明的检测方法专属性好，无干扰。

实验2

实施例一中，在室温25℃条件下，精密量取对照品溶液10ml，两份，置于50ml容量瓶中，立刻加入0.1%的edta溶液1ml；测定时，各加入5%的钼酸铵溶液2ml，再分别加入0.5%的对苯二酚溶液2ml和10%的抗坏血酸溶液2ml，然后，各加入30%的醋酸钠溶液6ml，加水稀释至刻度，摇匀；按照紫外-可见分光光度法，分别于0、5、10、20、30、60min，在714nm波长处测吸光度。结果如表5所示。

由表5可以看出，与抗坏血酸相比，以对苯二酚作为还原剂时，显色速度快，其在5min时吸光度即达到最大值，5-30min内稳定性良好。

表5不同还原剂对吸光度的影响

实验3

实施例一中，分别在10℃、20℃、30℃的室温条件下，精密量取对照品溶液10ml，置于50ml容量瓶中，立刻加入0.1%的edta溶液1ml；测定时，先后加入5%的钼酸铵溶液2ml、0.5%的对苯二酚溶液2ml、30%的醋酸钠溶液6ml，加水稀释至刻度，摇匀，并于暗处，分别放置0、5、10、20、30、60min；按照紫外-可见分光光度法，在714nm波长处测吸光度，结果见表6。

表6温度对吸光度的影响

由表6可以看出，随着温度的升高，显色反应加快，开始显色完全的时间逐渐缩短，稳定时间变长；在20-30℃范围内，所有显色反应可在5min内显色完全，并且，在5-30min内具有良好的稳定性。

实验4

按照复方醋酸钠葡萄糖注射液处方（醋酸钠3.20g，氯化镁0.31g，氯化钾1.30g，磷酸氢二钾0.26g，葡萄糖50.0g，注射用水加至1000ml），配制磷酸根含量分别为1.1942、1.4927、1.5226mmol/l的待测样品，每个浓度的样品3份，按照实施例一中步骤（9）的方法配制待测液，按照实施例一中步骤（7）至步骤（8）的方法，测定其吸光度，通过实施例一得到的标准曲线计算磷酸根的含量，并以测得值除以加入值来计算回收率。

按照相同的方法，分别在不加edta、0.1%edta、0.3%edta及0.5%edta的条件下，测定其吸光度，计算磷酸根的含量及其回收率，结果见表7。

由表7可以看出，与不添加edta的样品相比，edta的加入能明显提高磷酸根的回收率，edta的量对结果无明显影响。

表7edta对回收率的影响

实施5

实施例三中，在室温25℃条件下，精密量取小儿电解质k1号注射液10ml，6份，置于50ml容量瓶中；平行4组，在第2、3、4组中，分别立刻加入0.1%、0.3%、0.5%的edta溶液1ml，并分别于0、2、4、8、16、24h后，依次加入3%的钼酸铵溶液2ml、0.3%的对苯二酚溶液2ml、40%的醋酸钠溶液6ml，加水稀释至刻度，摇匀，暗处放置5min；按照紫外-可见分光光度法，在710nm波长处测吸光度，结果见表8。

由表8可以看出，与第1组相比，即表8中的第1行，待测溶液中加入edta后，即表8中的第2-4行，能明显增加样品溶液稳定性。

表8edta用量对结果的影响

本发明的有益效果：本发明在室温下，以对苯二酚为还原剂，在710-715nm波长处测吸光度，其专属性好，在该波长处，无干扰；耐用性好，在暗处放置的5-30min内，溶液稳定性良好；与抗坏血酸相比，对苯二酚还原能力强，显色反应快；edta溶液的添加，明显提高磷酸根的回收率，即提高磷酸根检测的准确性，同时，有效防止了磷酸盐的继续生成，提高对照品溶液和待测溶液的稳定性；本发明操作简单，条件温和，容易控制，检测效率高，检测结果具有很好的准确性、平行性和可再现性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。