一种从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素‑2标准样品的方法与流程

本发明涉及一种贝类毒素标准样品及其制备方法，具体的说，涉及一种从鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素-2标准样品的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

扇贝毒素(pectenotoxins,ptxs)是一类聚醚类大环内酯结构的脂溶性化合物，呈现7个小环醚结成的环状结构，在2004年柏林召开的海洋生物毒素会议上，fao/ioc/who将其列为八大类海洋生物毒素中的一类。扇贝毒素-2(ptx2)是扇贝毒素类中最常见的的一种，化学式为c47h70o14，分子质量为859.07，[m+nh4]⁺：m/z876.5104。扇贝毒素-2主要由海洋甲藻中的鳍藻(dinophysisspp.)产生，如鳍藻dinophysisacuta，d.fortii，d.acuminata，d.caudata，d.norvegica，d.rotundata和d.infundibulus等，于1984年首次从日本的养殖扇贝patinopectenyessoensis中鉴定发现，后在全球各地的贝肉和海水中广泛检出。研究发现这种毒素可导致小鼠腹腔注射高致死率，此外有研究发现其对几株人类肺癌细胞的具有潜在细胞毒性。因此，欧盟规定各种水产品的可食用组织中oa，dtxs和ptxs的含量总和不能超过160μg/kg，但包括中国在内的许多国家和地区尚没有专门针对ptxs毒素的检测规范和食用安全标准。

目前尚未发现扇贝毒素-2的标准制备技术的报道，我国缺乏扇贝毒素的组分结构、分布规律的背景研究资料，国内检测海洋生物毒素的标准样品主要依赖从国外进口，其中加拿大国家研究委员会(nrc)下属的海洋生物科学研究所(ibm)提供的扇贝毒素的标准物质，已被包括我国在内的40多个国家的海产品和水质实验室采用。此外美国sigma公司也成功建立腹泻性贝类毒素oa的标准品制备工序。购买国外标准毒素价格昂贵且含量很少，但是国内的快速检测试剂开发需要大量标准品。总的来说，我国在海洋生物毒素标准品的研制方面鲜见报道，仅见有麻痹性海洋生物毒素标准样品制备专利1项。因此，为加强和建立我国贝毒流行病学管理系统、有效地预防和控制我国贝毒事件的发生，急需海洋生物毒素的标准物质制备技术。

技术实现要素：

本发明针对当前市售扇贝毒素标准品的不足，所要解决的技术问题是：提供一种从大规模培养藻液中提取、分离纯化扇贝毒素-2的简单快捷，易于操作的高效液相制备技术方法。

本发明还提供一种应用本方法制备的扇贝毒素-2的标准样品。

本发明还提供该扇贝毒素-2标准样品的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供的大规模鳍藻培养藻液中扇贝毒素-2标准品的液相制备方法，采用如下技术方案：

1)大规模培养藻液破碎：

取前期培养的中国株鳍藻dinophysisacuminata(days01-e6,f2)的大规模培养液，过10～15μm滤膜后于-196℃左右液氮下冷冻。待冷冻完全后，再将其置于室温下解冻。待解冻完全再反复进行2次冻融。取室温解冻完全的藻液，置于冰水中，在冰浴条件下，使用超声波细胞破碎机进行细胞破碎。超声波细胞粉碎机的实验条件为：超声功率200～325w、超声频率为10～25khz、总工作时间15～20min，超声波处理时样品温度15～30℃，仪器连续工作时间90～150min。

优选的，为了提高藻液破碎效果，在培养液过10～15μm滤膜后中加入无机盐，加入无机盐的质量是培养液的3～10％，优选的无机盐是氯化钠。加入无机盐后再进行冷冻解冻，会大大提高藻细胞的破碎效果，且在后期萃取过程中能够去除。

2)毒素提取：

从藻液中提取毒素的方法是：取经过破碎处理的藻液(30ml)倒入分液漏斗，先用30～40ml乙醚萃取：再加30～40ml乙醚，进一步萃取，充分震荡后，静置5～10min,将水从下口放出，提取毒素的乙醚溶液从上口倒出。再用30～40ml二氯甲烷萃取两次，二氯甲烷萃取时，充分震荡后，静置5～10min,提取毒素的二氯甲烷从下口接出。使两相液层充分接触振荡操作：把分液漏斗倾斜，使漏斗的上口略朝下，倒置45°角，用力振荡的目的是使水与提取的有机溶剂充分混合。合并萃取液加入2～5g无水硫酸钠或无水硫酸镁除水，再除去干燥剂，35～40℃旋转蒸发浓缩，蒸去溶剂，甲醇溶解后，过0.22μm有机相滤膜备用。

3)葡聚糖凝胶色谱柱分离：

葡聚糖凝胶色谱柱采用sephadexlh20进行装填，凝胶预先甲醇活化，湿法装填入玻璃层析柱(60cm×1.2cm)。将经有机试剂提取后的扇贝毒素样品提取液(2～5ml)上柱后，以甲醇(200～250ml)洗脱，分段收集，每管收集液为6～8ml。每管取0.5～1ml于进样瓶中，进行hplc-ms/ms分析。根据分析结果，选取含有扇贝毒素-2的组分(约为25～60管含有扇贝毒素-2组分)合并、浓缩，进行进一步的高效液相色谱的纯化。

4)扇贝毒素-2高效液相色谱分离条件：

采用高效液相色谱法探索最佳分离条件，确定最终优化条件为：色谱柱为c18分析色谱柱，流动相组成为a：纯水(含6.7mm氨水)；b：乙腈/水(90:10，v/v，含6.7mm氨水)，流速为1ml/min，柱温为40℃。确定样品中目标峰扇贝毒素-2的出峰时间，将优化后的色谱条件应用于液相制备，从而达到快速准确的分离目的。

5)扇贝毒素-2高效液相色谱纯化：

色谱柱：c18柱，长250mm，内径4.8mm，粒度5μm；

流动相：a：纯水(含6.7mm氨水)；b：色谱纯乙腈/水(90:10，v/v，含6.7mm氨水)；

流速：1ml/min；

柱温：40℃；

检测波长：235nm；

根据扇贝毒素-2的保留时间，收集目标色谱峰，将收集的组分利用旋转蒸发工艺去除试剂，即得扇贝毒素-2标准样品。

6)检验所述标准样品的均匀性和稳定性。

本发明的有益效果：

本发明采用高效液相色谱法制备扇贝毒素-2，前处理简单快捷，易于操作；收集方法简单；制备的标准样品纯度达90％以上。

附图说明

图1扇贝毒素-2的化学结构式。

图2本发明粗提液中毒素分析的lc-ms谱图。

图3高效液相色谱串联紫外(hplc-uv)检测的色谱图。

图4本发明纯化后扇贝毒素-2的lc-ms谱图。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明的技术方案进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的显著。

实施例1

本实施例提供的从大规模鳍藻培养藻液中制备扇贝毒素-2标准品的方法，具体步骤如下：

1)大规模培养藻液破碎：

取前期培养的中国株鳍藻dinophysisacuminata(days01-e6,f2)的大规模培养液，过10～15μm滤膜后于-196℃左右液氮下冷冻。待冷冻完全后，再将其置于室温下解冻。待解冻完全再反复进行2次冻融。取室温解冻完全的藻液，置于冰水中，在冰浴条件下，使用超声波细胞破碎机进行细胞破碎。超声波细胞粉碎机的实验条件为：超声功率200～325w、超声频率为10～25khz、总工作时间15～20min，超声波处理时样品温度15～30℃，仪器连续工作时间90～150min。

在培养液过10～15μm滤膜后中加入无机盐，加入无机盐的质量是培养液的10％，本实施例的无机盐是氯化钠。加入无机盐后再进行冷冻解冻，会大大提高藻细胞的破碎效果，且在后期萃取过程中能够去除。

2)毒素提取：从藻液中提取毒素的方法是：取经过破碎处理的藻液(30ml)倒入分液漏斗，先用30～40ml乙醚萃取：再加30～40ml乙醚，进一步萃取，充分震荡后，静置5～10min，将水从下口放出，提取毒素的乙醚溶液从上口倒出。再用30～40ml二氯甲烷萃取两次，二氯甲烷萃取时，充分震荡后，静置5～10min,提取毒素的二氯甲烷从下口接出。使两相液层充分接触振荡操作：把分液漏斗倾斜，使漏斗的上口略朝下，倒置45°角，用力振荡的目的是使水与提取的有机溶剂充分混合。合并萃取液加入2～5g无水硫酸钠或无水硫酸镁除水，再除去干燥剂，35～40℃旋转蒸发浓缩，蒸去溶剂，甲醇溶解后备用，过0.22μm有机相滤膜备用，即得扇贝毒素-2粗产品。

3)葡聚糖凝胶色谱柱分离

葡聚糖凝胶柱采用sephadexlh20进行装填，凝胶材料经甲醇活化后，以甲醇悬浮，湿法装填入玻璃柱(60cm*1.2cm)。将经有机试剂提取后的扇贝毒素样品提取液(2～5ml)上柱后，以甲醇(200～250ml)洗脱，分段收集,每管收集液为6～8ml。每管取0.5～1ml于进样瓶中，进行hplc-ms/ms分析。根据分析结果，选取含有扇贝毒素-2的组分(约为25～60管含有扇贝毒素-2组分)合并、浓缩，进行进一步的高效液相色谱的纯化。

4)扇贝毒素-2高效液相色谱分离：

采用高效液相色谱法探索最佳分离条件，确定最终优化条件为：色谱柱为c18半制备型色谱柱，流动相组成为a：纯水(含6.7mm氨水)；b：乙腈/水(90:10，v/v，含6.7mm氨水)，流速为1ml/min，柱温为40℃。确定样品中扇贝毒素-2出峰时间，将优化后的色谱条件应用于液相制备，从而达到快速准确的分离目的。

5)扇贝毒素-2高效液相色谱纯化：

色谱柱：半制备型c18柱，长250mm，内径4.8mm，粒度5μm；

流动相：a：纯水(含6.7mm氨水)；b：色谱纯乙腈/水(90:10，v/v，含6.7mm氨水)；

流速：1ml/min；

柱温：40℃；

检测波长：235nm；

根据扇贝毒素-2的保留时间进行收集，将收集的组分利用旋转蒸发工艺去除试剂，即得扇贝毒素-2标准样品。

6)定量并检验所述标准样品的均匀性：

均匀性的检验包括瓶间均匀性研究评估和瓶内均匀性研究评估。依据国家标准物质研制的要求，采用方差分析法(anona)对扇贝毒素-2标准物质的均匀性进行检验。从分离纯化得到的毒素纯化储备液中随机抽取10瓶，用甲醇溶液充分混合均匀后，分别稀释至50ng/ml，20ng/ml，以及10ng/ml的溶液，装入样品瓶中，每瓶样品体积1ml。以液相色谱串联质谱检测，单个浓度测试3次，计算变异系数。所有试料以随机次序在重复性条件下测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同的测试方法和仪器在较短时间内测试，在均匀性检验中间隔插入质控品以监控漂移并纠正。标准品中ptx2的对数值呈正态分布，测量结果见表1、2。

表1扇贝毒素-2(ptx2)标准样品均匀性试验

表2扇贝毒素-2-标准样品均匀检验方差分析结果

经过单因素方差分析，对50ng/ml，20ng/ml，以及10ng/ml三个浓度的溶液进行的均匀性检验，表3的结果表明，三个浓度在瓶内是无显著性差异的(p1>0.05，p2>0.05,p3>0.05)。同时进行组内方差和组间方差的比较(f值)，当α＝0.05，f1＝2，f2＝27，查f分布表，f临界值为6.49。因此比较结果显示，f1<f(2，27)＝6.49，f2<f(2，27)＝6.49，f3<f(2，27)＝6.49，即各组测量值之间无系统误差，各浓度的组内方差和组间方差之比均小于统计检验的临界值(f检验临界值)，证明瓶间和瓶内无显著差异，扇贝毒素-2样品均一，且标准样品纯度约为91.2％，能够满足质控等实验要求。

7)稳定性检验

用于稳定性检验的扇贝毒素-2标准物质应在低温条件下避光、密封保存。本实验采用同步的稳定性研究，样品从不同的储存条件在预先实验设计的时间点取出，放到参考储备条件下(-80℃)，最终进行同步的测定。这种实验方案可减少测量重复性和(实验室内)再现性之间的差异，使得同步稳定性研究比经典方法得到的不确定度要小。

为检测标准样品的短期稳定性，将包装完好的标准样品置于+20℃条件下保存，根据先密后疏的原则，按照保存天数，分别在0，2，8，16，30天取样，进行毒素含量和组成成分分析。为考察扇贝毒素-2标准物质的长期稳定性，根据先密后疏的原则，按照保存月份，分别在0，2，3，6，9，12月取出保存在+4℃条件下的样品，进行毒素含量和组成成分分析。在检测时，从分离纯化得到的毒素纯化储备液中随机抽取10瓶，用甲醇溶液充分混合均匀后，分别稀释至50ng/ml，20ng/ml，以及10ng/ml的溶液，装入样品瓶中，每瓶样品体积1ml。随机取出三瓶，以液相色谱串联质谱检测，平行分析3次，取平均值，在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。

采用经典的线性模型对标准物质稳定性的检测结果的进行统计检验，使用如下统计学公式，结果如表3，4所示。

斜率的估计值：

截距的计算公式：

估计b1的标准偏差：

直线上的点的标准偏差计算公式为：

表3扇贝毒素-2标准样品短期稳定性测定结果

短期稳定性结果表明，自由度为n-2和p＝0.95(95％置信水平)的分布t-因子等于3.18。由于|b1|＜t0.95，n-2·s(b1),故斜率不显著的，即未观测到不稳定性，验证制得的标准样品的短期稳定性良好。

表4扇贝毒素-2标准样品长期稳定性测定结果

长期稳定性结果表明，自由度为n-2和p＝0.95(95％置信水平)的分布t-因子等于2.78。

由于|b1|＜t0.95，n-2·s(b1),故斜率不显著的，即未观测到不稳定性，验证制得的标准样品的长期稳定性良好。

以上结果说明扇贝毒素-2标准物质在保存期间内稳定。

实施例2本发明提供的方法的提纯结果

图2是粗提液中毒素分析的lc-ms谱图。

藻液中检测的毒素的色谱图(hplc-uv)如图3所示，根据组分的保留时间进行收集；将收集的组分按常规的旋转蒸发工艺除去试剂，用2ml甲醇溶解，经高效液相色谱-串联质谱仪分析，定性检测到出峰时间为16.02min的组分为扇贝毒素-2，经加拿大国家研究所标准溶液(nrccrm-ptx2-blot#20120516)定量，纯化后浓度为243.16ng/ml，纯度达90％以上。

纯化后扇贝毒素-2的lc-ms谱图如图4所示。其中，根据出峰时间，保留时间5.64min的离子峰是ptx2，与图2相比，其他毒素与杂质经纯化得到去除。

实施例3本发明应用到实际样品检测

取本发明制备的标准样品，依次用甲醇稀释为2ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml系列浓度的标准溶液，检测本实验室于2015年11月至2016年10月从中国广西北部湾海域贝类养殖区采集的贝肉样品和spatt(solidphaseadsorptiontoxintracking，固相毒素吸附跟踪技术)吸附的海水中的毒素样品，即制作吸附采样装置，利用hp20大孔树脂吸附的海水悬浮颗粒中的脂溶性海洋生物毒素，以下简称spatt样品。36份贝肉样品和51份spatt样品经过前处理后，分别与制备的标准样品及购买的加拿大生物研究所标准品(nrccrm-ptx2-blot#20120516)配置的相同浓度的系列标准溶液(2ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)，同时进行hplc-ms/ms检测，检测结果发现贝肉中扇贝毒素-2均显示未检出，spatt样品中扇贝毒素-2的含量n/a—13.23(ng/(g·30d))，检出率为86.27％。其中制备标准品标准曲线y＝15128.12902x+29573.33092(r＝0.99997)。spatt样品中扇贝毒素-2的含量在8月达到最高，与以往监测结果类似。且该样品测定结果与加拿大生物研究所标准品相比没有显著性差异(p>0.05)。

实施例4本发明应用到实际样品检测

取本发明制备的标准样品，依次用甲醇稀释为2ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml系列浓度的标准溶液，检测本实验室于2014年至2015年从中国青岛黄海海域流清湾贝类养殖区采集的贝肉样品和spatt吸附的海水中的毒素样品，贝肉样品和spatt样品经过前处理后，与制备的标准样品，及购买的加拿大生物研究所标准品(nrccrm-ptx2-blot#20120516)配置的相同浓度的系列标准溶液(2ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)，同时进行hplc-ms/ms检测，检测结果发现扇贝贝肉中扇贝毒素-2中检出量为n/a—5.5μg/kg，检出率为20.15％，其中8月份达到最高，与以往监测结果类似。spatt样品中扇贝毒素-2的含量3.5—30(ng/(g·d))，在8月和9月的检出率为100％。其中制备标准品标准曲线y＝15128.12902x+29573.33092(r＝0.99997)。且该样品测定结果与加拿大生物研究所标准品相比没有显著性差异(p>0.05)。