本发明涉及一种体内代谢产物的检测方法，特别涉及一种阿司匹林的耐药性监测方法。
背景技术：
阿司匹林作为抗血小板药物广泛用于心脑血管疾病的一、二级预防，可明显减少各类栓塞和血栓形成事件，但仍有部分患者虽然长期服用常规剂量的阿司匹林（75-325mg）其血小板聚集能力扔未被很好抑制，称为生化阿司匹林抵抗，有的患者仍发生血栓栓塞事件，称为临床阿司匹林抵抗或阿司匹林治疗失败。随着抗血小板药物种类的增多和药物在患者身上生物学作用的不均一性，检测个体对抗血小板治疗的反应是非常有意义的，可以据此调节个体的用药类型和剂量达到最优化，来控制和减少发生血栓和出血的风险。
血栓烷a2（txa2）是血小板内花生四烯酸代谢产生的一种具有强烈生物学活性的物质，是目前已知最强的缩血管物质和最强的血小板聚集剂之一，与血小板的活化密切相关，在血栓及血栓性疾病的病理生理过程中起重要作用。由于其在体内半衰期很短（约30s），故以往一般通过检测其在血浆中的稳定代谢产物txb2的浓度间接得知txa2的生成水平，从而了解体内血小板活化的程度。但因采血取样及实验操作过程中血小板体外活化也可产生txb2，这就影响了实验结果的准确性，使得txb2这一指标不能真实的反映体内血小板活化的水平。
近年，人们发现txbz的主要酶代谢产物11脱氢血栓烷b2（11-dh-txb2）不在体外生成，催化txb2转变为11-dh-txb2的脱氢酶主要存在于肝、肺、肾，故11-dh-txb2的体外浓度不受血小板体外活化的影响，且半衰期也较长（约46min），因此是反映体内血小板活化的一个新的强特异性敏感指标。由于11-dh-txb2在尿液中的含量随饮水量及取样时间的不同变化较大，现在常用pg11-dh-txb2/mg肌酐使尿液浓度标准化。
现在测定11-dh-txb2含量的主要方法是试剂盒法，该方法步骤繁琐，从样品处理到得到数据至少需要几个小时，根据文献的报道，不同实验室测得数据差异性较大，数据差异能到两个数量级甚至三个数量级。因此试剂盒对操作人员、实验室条件等要求均较高，需要专业的生物学专业人员及酶标仪等设备。
技术实现要素：
为弥补现有技术的不足，本发明提供一种快速、准确、能真实反映血小板活化程度的阿司匹林的耐药性监测方法，其目的是为患者提供阿司匹林的用药指导。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种阿司匹林的耐药性监测方法，其特殊之处在于：该方法通过检测尿液中11脱氢血栓烷b2含量实现，具体为：采用液相质谱法检测尿液样本，带入标准曲线分别得到尿液样本的11脱氢血栓烷b2浓度和肌酐浓度。
具体的，本发明的一种阿司匹林的耐药性监测方法，包括以下步骤：
（1）标准曲线溶液的制备
将11脱氢血栓烷b2溶液逐级稀释，稀释范围为10pg/ml-25ng/ml，向稀释后的各级11脱氢血栓烷b2溶液中加入内标液，混合均匀得11脱氢血栓烷b2标准曲线溶液；将肌酐溶液逐级稀释，稀释范围为1mg/dl-300mg/dl，向稀释后的各级肌酐溶液中加入内标液，混合均匀得肌酐标准曲线溶液；
（2）待测尿液样本的制备
将人体尿液样本处理后加入内标液，混合均匀；
（3）标准曲线的绘制
将步骤（1）获得的11脱氢血栓烷b2标准曲线溶液和肌酐标准曲线溶液进行液相质谱检测，线性回归分析，分别得到11脱氢血栓烷b2溶液标准曲线和肌酐溶液标准曲线；
（4）待测尿液样本检测
将步骤2得到的待测尿液样本进行液相质谱检测，带入步骤3得到的标准曲线中，分别得到尿液样本的11脱氢血栓烷b2浓度和肌酐浓度，按照11脱氢血栓烷b2值（pg/ml）/肌酐值（mg/dl）×100计算得报告值。
进一步的，本发明的一种阿司匹林的耐药性监测方法，所述内标液为11脱氢血栓烷b2氘代物（11-dh-txb2-d4）溶液。
进一步的，本发明的一种阿司匹林的耐药性监测方法，所述待测尿液样本的处理过程为：取人体尿液样本加入蛋白沉淀剂离心，取上清液过微孔滤膜。
进一步的，所述微孔滤膜孔径为0.22um。
进一步的，本发明的一种阿司匹林的耐药性监测方法，步骤（3）中以11脱氢血栓烷b2氘代物（11-dh-txb2-d4）作为内标溶液，以峰面积为纵坐标，以样品浓度为横坐标进行线性回归分析。
进一步的，本发明的一种阿司匹林的耐药性监测方法，所述液相质谱法检测11脱氢血栓烷b2溶液所用离子对为381.2/265.2，381.2/260.0，381.2/144.2，369.3/247.9，369.3/301.1，369.3/309.3；所述液相质谱法检测肌酐溶液所用离子对为114.3/99.0，114.3/72.3，114.3/86.3。
本发明的有益效果是：
（1）本发明的检测方法灵敏度高，检测限低，定量下限可到10pg/ml。
（2）本发明的检测方法线性范围广，标准曲线浓度范围10pg/ml-25ng/ml，能满足正常人及心血管相关疾病病人体内11脱氢血栓烷b2的含量范围。
（3）本发明的检测方法步骤简单，快速准确，本发明样本从接收到出数据仅需要30min，大大缩短了样品的检测时间。
（4）本发明采用液相质谱法，方法耐受性和重现性好。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，本发明的保护范围包括但不限于以下实施例，在不偏离本申请的精神和范围的前提下任何对本发明的技术方案的细节和形式所做出的修改均落入本发明的保护范围内。
1.仪器与药品
高效液相色谱仪：岛津nexeraxr，泵：lc-20adxr，自动进样器：sil-20acxr，柱温箱：cto-20a。质谱仪：absciexapi4000，离心机：thermosorvallst8r。
11-dh-txb2及11-dh-txb2-d4购自caymanchemicalsco，肌酐购自于中检所，乙腈、甲醇均为色谱纯，水为二级纯化水。
2.色谱检测条件
色谱柱：watersc182.5μm（2.1×75mm）色谱柱，流动相a相为甲醇：2.5mmol/l乙酸铵=3：97，流动相b相为甲醇：乙腈=3：97，流速0.2-0.3ml/min，柱温40℃，进样体积5ul。
3.储备液的制备
（1）11-dh-txb2储备液的制备：将购买的11脱氢血栓烷b2溶液稀释至100ng/ml，标记为stock1。
（2）11-dh-txb2-d4储备液的制备：将购买的11-dh-txb2-d4溶液稀释至10ng/ml，标记为stock2。
（3）肌酐储备液的制备：称取肌酐固体10mg，加入到10ml容量瓶中，加纯化水定容，标记为stock3。
4.标准曲线溶液的制备
（1）11-dh-txb2标准曲线溶液制备：将储备液stock1用稀释液（纯化水）逐级稀释到25ng/ml，5ng/ml，1ng/ml，200pg/ml，50pg/ml，10pg/ml。
分别取上述各浓度溶液190ul，加入10ul的储备液stock2，混合均匀，得11脱氢血栓烷b2标准曲线溶液。
（2）肌酐标准曲线溶液的制备：将储备液stock3用稀释液（纯化水）逐级稀释到300mg/d，100mg/dl，50mg/dl，20mg/dl，5mg/dl，1mg/dl。
分别取上述各浓度溶液190ul，加入10ul的储备液stock2，混合均匀，得肌酐标准曲线溶液。
5.待测尿液样本的制备
取人体尿液样本1ml，加入蛋白沉淀剂2ml，1000×g/min离心15min，取上清液过0.22um微孔滤膜。取190ul滤液加入10ul储备液stock2，混合均匀。
6线性分析
分别取步骤4获得的11脱氢血栓烷b2标准曲线溶液和肌酐标准曲线溶液，进行液相质谱检测，采用液相色谱-质谱仪连用进行检测，11脱氢血栓烷b2的色谱检测条件为步骤2所述条件，质谱仪采用的离子对为381.2/265.2，381.2/260.0，381.2/144.2，369.3/247.9，369.3/301.1，369.3/309.3；肌酐的色谱检测条件为步骤2所述条件，质谱仪检测采用的离子对为114.3/99.0，114.3/72.3，114.3/86.3；线性回归分析：以11-dh-txb2-d4作为内标溶液，以峰面积为纵坐标，以样品浓度为横坐标进行线性回归分析，得到11脱氢血栓烷b2标准曲线和肌酐标准曲线；其中，11脱氢血栓烷b2回归曲线r2=0.9993，无权重；肌酐回归曲线r2=0.9989，无权重。
7.待测尿液样本检测
将10份人体尿液样本，进行液相质谱检测，采用液相色谱-质谱仪连用进行检测，带入步骤6的标准曲线分别得到尿液样本的11脱氢血栓烷b2浓度和肌酐浓度如下表所示：