一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法与流程

本发明涉及物质检测领域，具体地说涉及一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法。

背景技术：

铁皮石斛，多年生草本植物，是我国传统中药材中最为珍惜名贵的一种。铁皮石斛有很高的药用价值，具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖和提高免疫等作用。铁皮石斛的化学成分主要含有多糖、生物碱、菲类、联苄、类黄酮等。

铁皮石斛中的黄酮类物质有一定的药效，具有研究的价值。其中槲皮素(quercetin)，又名栎精，化学名3,3’，4’，5，7-五羟基黄酮，是铁皮石斛中含有的一种天然的黄酮类化合物。槲皮素具有一定的药用价值，有抗炎、抗过敏、抗氧化、降血压、抗肿瘤、止咳祛痰等功效。

当前对铁皮石斛中黄酮类物质少有研究，尤其是缺少检测铁皮石斛中槲皮素含量的方法，不利于铁皮石斛槲皮素的利用，槲皮素的化学结构式如下式1所示：

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种回收率高，准确性好的高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制

称取槲皮素标准品，溶于色谱级甲醇中，充分混匀，制成两组以上不同浓度的标准品溶液；

(2)供试品溶液的配制

将烘干至恒重的铁皮石斛样品研磨成粉末，加入到乙醇水溶液中进行提取，得到铁皮石斛提取液，将铁皮石斛提取液中的溶剂除干，剩余物复溶于色谱级甲醇中，之后充分震荡混合，再经过过滤处理，得到供试品溶液；

(3)标准品溶液与供试品溶液的测定

采用hplc-dad检测方法对标准品溶液和供试品溶液分别进行检测。

进一步地，步骤(2)中，研磨成粉末的铁皮石斛样品与乙醇水溶液的料液比为1g～2g:25ml～26ml，乙醇水溶液的体积浓度为40％～60％。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用以上配比，提取效果较好，从而保证槲皮素检测的准确性。

进一步地，步骤(2)中，提取的具体过程为：在40℃～60℃条件下超声处理15min～60min，然后离心处理，取上清液，即为铁皮石斛提取液。在实施本发明的过程中，发明人发现，采用以上提取工艺，能够让铁皮石斛中的槲皮素充分析出，从而保证对槲皮素检测的准确性。

进一步地，步骤(2)中，复溶时每3ml铁皮石斛提取液使用200μl～500μl色谱级甲醇。

进一步地，步骤(2)中，过滤处理采用微孔滤膜过滤，滤膜的孔径为0.22μm～0.45μm。

进一步地，步骤(2)中，将铁皮石斛提取液中的溶剂除干的方式为用氮吹仪吹干。

进一步地，铁皮石斛中的槲皮素在19.3min～19.4min，360nm～384nm处有最大吸收峰。

进一步地，步骤(3)中，hplc-dad应用的色谱条件为：色谱柱参数c18column250×4.6mm5um，柱温20℃～35℃，进样量10μl～25μl，流速1.0ml/min，流动相为乙腈和甲酸水溶液，梯度洗脱条件为在0min～60min，有机相在流动相里的比例从5％～20％升至80％～95％。

进一步地，甲酸水溶液的体积浓度为0.01％～0.1％。

本发明的有益效果体现在：

1.与现有检测方法相比，本发明工艺简单、准确性高、重复性好，为铁皮石斛中槲皮素的检测提供了快速、准确的方法，有助于提高铁皮石斛槲皮素利用效率，对铁皮石斛实际生产加工有一定的意义。

2.本发明的提取过程采用超声能够破碎细胞，简化了操作工艺，操作方便、高效，并降低了工艺成本；并使提取更充分，重复提取可以使铁皮石斛中的槲皮素充分溶解于乙醇中，由于槲皮素含量较低，浓缩复溶可以提高溶液中槲皮素的浓度，便于检测。

3.本发明确定了铁皮石斛槲皮素在19.3min～19.4min，360nm～384nm处有最大吸收峰。

附图说明

图1是实施例1得到的槲皮素的液相色谱图。

图2是实施例1得到的槲皮素标品标准曲线图。

图3是实施例2得到的槲皮素的液相色谱图。

图4是实施例3得到的槲皮素的液相色谱图。

图5是实施例5得到的槲皮素的液相色谱图。

图6是实施例6得到的槲皮素的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例所使用的各种原料，如未作特别说明，均为本领域公知的市售产品。为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，在下面的详细描述中，只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例。毋庸置疑，本领域的普通技术人员可以认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。

实施例1

一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制

分别精密称取槲皮素标准品，溶于色谱级甲醇中，涡旋仪震荡，充分混匀，制成浓度分别为500μg/ml、25μg/ml、12.50μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml的标准品溶液；

(2)供试品溶液的配制

精密称取0.27g烘干至恒重的铁皮石斛样品，通过球磨仪充分研磨成粉末，按照料液比1g:26ml的比例加入到体积浓度为51％的乙醇水溶液中进行提取，提取的具体过程为：在60℃条件下超声处理30min，然后5000rpm的转速下离心处理10min，取上清液，即为铁皮石斛提取液；

取3ml铁皮石斛提取液，用氮吹仪将铁皮石斛提取液中的溶剂吹干，剩余物再复溶于300μl色谱级甲醇中，然后摇床放置12小时，最后进行过滤处理，过滤处理采用微孔滤膜过滤，滤膜的孔径为0.22μm，所得的滤液即为供试品溶液；

(3)标准品溶液与供试品溶液的测定

采用hplc-dad检测方法对标准品溶液和供试品溶液分别进行检测，应用的色谱条件为：色谱柱参数c18column250×4.6mm5um，柱温25℃，进样量10μl，流速1.0ml/min，流动相为乙腈和体积浓度为0.02％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为在0min～40min，有机相在流动相里的比例从5％升至80％。

(4)结果解析

首先从对槲皮素25μg/ml标准品进行hplc-dad的检测结果中，得到槲皮素的液相色谱图，参见图1。经过分析得知，槲皮素在19.3min～19.4min，360nm～384nm处有最大吸收峰。

通过对标准品溶液的测定，绘制出标准曲线，参见图2，得到槲皮素含量计算公式如下：y＝0.6324x-0.3724，x为浓度(μg/ml)，y为峰面积，r²＝0.9997。根据所作出的标准曲线计算供试品溶液的浓度为0.703±2μg/ml。

实施例2

一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制

分别精密称取槲皮素标准品，溶于色谱级甲醇中，涡旋仪震荡，充分混匀，制成浓度分别为500μg/ml、25μg/ml、12.50μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml的标准品溶液；

(2)供试品溶液的配制

精密称取0.27g烘干至恒重的铁皮石斛样品，通过球磨仪充分研磨成粉末，按照料液比2g:25ml的比例加入到体积浓度为60％的乙醇水溶液中进行提取，提取的具体过程为：在40℃条件下超声处理60min，然后4000rpm的转速下离心处理15min，取上清液，即为铁皮石斛提取液；

取3ml铁皮石斛提取液，用氮吹仪将铁皮石斛提取液中的溶剂吹干，剩余物再复溶于200μl色谱级甲醇中，然后摇床放置12小时，最后进行过滤处理，过滤处理采用微孔滤膜过滤，滤膜的孔径为0.45μm，所得的滤液即为供试品溶液；

(3)标准品溶液与供试品溶液的测定

采用hplc-dad检测方法对标准品溶液和供试品溶液分别进行检测，应用的色谱条件为：色谱柱参数c18column250×4.6mm5um，柱温20℃，进样量15μl，流速1.0ml/min，流动相为乙腈和体积浓度为0.01％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为在0min～50min，有机相在流动相里的比例从10％升至85％。

(4)结果解析

解析手段同实施例1，对槲皮素25μg/ml标准品进行hplc-dad的检测结果中，得到槲皮素的液相色谱图，参见图3，经过分析，本实施例结果与实施例1相似，槲皮素在18.5min～18.8min，360nm～384nm处有最大吸收峰，得到槲皮素含量计算公式如下：y＝0.6473x-0.3656，x为浓度(μg/ml)，y为峰面积，r²＝0.9993。供试品溶液的浓度为0.537±2μg/ml。

实施例3

一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法，包括以下步骤：

(1)标准品溶液的配制

分别精密称取槲皮素标准品，溶于色谱级甲醇中，涡旋仪震荡，充分混匀，制成浓度分别为500μg/ml、25μg/ml、12.50μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml的标准品溶液；

(2)供试品溶液的配制

精密称取0.27g烘干至恒重的铁皮石斛样品，通过球磨仪充分研磨成粉末，按照料液比1.5:25.5ml的比例加入到体积浓度为40％的乙醇水溶液中进行提取，提取的具体过程为：在50℃条件下超声处理15min，然后6000rpm的转速下离心处理5min，取上清液，即为铁皮石斛提取液；

取3ml铁皮石斛提取液，用氮吹仪将铁皮石斛提取液中的溶剂吹干，剩余物再复溶于500μl色谱级甲醇中，然后摇床放置12小时，最后进行过滤处理，过滤处理采用微孔滤膜过滤，滤膜的孔径为0.30μm，所得的滤液即为供试品溶液；

(3)标准品溶液与供试品溶液的测定

采用hplc-dad检测方法对标准品溶液和供试品溶液分别进行检测，应用的色谱条件为：色谱柱参数c18column250×4.6mm5um，柱温35℃，进样量25μl，流速1.0ml/min，流动相为乙腈和体积浓度为0.08％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为在0min～60min，有机相在流动相里的比例从20％升至95％。

(4)结果解析

解析手段同实施例1，对槲皮素25μg/ml标准品进行hplc-dad的检测结果中，得到槲皮素的液相色谱图，参见图4，经过分析，本实施例结果与实施例1相似，槲皮素在19.3min～19.4min，360nm～384nm处有最大吸收峰，得到槲皮素含量计算公式如下：y＝0.6531x-0.3672，x为浓度(μg/ml)，y为峰面积，r²＝0.9987。供试品溶液的浓度为0.254±2μg/ml。

实施例4

一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法

本实施例的具体步骤与实施例1相似，区别仅在于本实施例在步骤(2)进行提取时，没有采用超声处理，仅在60℃条件下浸泡了30min。

经过测定和解析后，得到槲皮素含量计算公式如下：y＝0.6324x-0.3724，x为浓度(μg/ml)，y为峰面积，r²＝0.9997。根据所作出的标准曲线计算供试品溶液的浓度为0.626±3μg/ml。较之实施例1的结果，本实施例未经过超声处理，槲皮素的提取效率较低。

实施例5

一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法

本实施例的具体步骤与实施例1相似，区别仅在于本实施例在步骤(3)中，流动相为乙腈和体积浓度为0.1％的甲酸水溶液。

经过测定，从对槲皮素25μg/ml标准品进行hplc-dad的检测结果中，得到槲皮素的液相色谱图，参见图5，对谱图进行分析，结果为槲皮素在18.6min～18.8min，360nm～384nm处有最大吸收峰，从峰型的对称度和物质的保留时间来看，本实施例较之实施例1，检测效果较差。

实施例6

一种高效检测铁皮石斛中槲皮素的方法

本实施例的具体步骤与实施例1相似，区别仅在于本实施例在步骤(3)中，流动相为乙腈和体积浓度为1％的乙酸水溶液。

经过测定，从对槲皮素25μg/ml标准品进行hplc-dad的检测结果中，得到槲皮素的液相色谱图，参见图6，对谱图进行分析，结果为槲皮素在4.4min～4.6min，360nm～384nm处有最大吸收峰，从峰型的对称度和物质的保留时间来看，本实施例较之实施例1，检测效果较差。

实施例7

精密度实验

制6份浓度相等的槲皮素标准品溶液，按实施例1的方法检测槲皮素标准品溶液的中槲皮素含量，检测结果见下表1。

表1精密度实验数据

试验结论：6份槲皮素标准溶液含量的rsd为0.9845％，表明本发明有较好的精密度，符合gb/t27404-2008质量控制规范食品理化检测》的要求【gb/t27404-2008要求rsd(％)≤1.3％】。

实施例8

回收率试验

精密称取槲皮素标准品一份，溶于色谱级甲醇，制得槲皮素标准品溶液一份，按实施例1的方法检测槲皮素含量；再精密称取铁皮石斛样品一份，按实施例1的方法制得供试品溶液，并检测其槲皮素含量。将已知含量的标准品溶液与供试品溶液各取100μl混合，共制6组，按实施例1的方法检测槲皮素含量。计算每组的回收率，回收率(％)＝(混合液所测含量－已知标准品含量)/已知标准品含量，检测结果见下表2。

表2回收率实验数据

试验结论：槲皮素加标平均回收率为：99.61％，相对标准偏差(rsd)分别为0.875％，符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求【gb/t27404-2008要求回收率为95％～105％】

应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。