超高效液相色谱‑串联质谱法同时测定常山胡柚的不同部位中九种功能性成分的方法与流程

本发明涉及一种检测方法，尤其涉及超高效液相色谱-串联质谱法同时测定常山胡柚的不同部位中九种功能性成分的方法。

背景技术：

常山胡柚是浙江省特色柑橘品种，亦为浙江省特有资源，已有一百多年的栽培历史。常山胡柚因其果实品质优良、风味独特，富含氨基酸、维生素、微量元素及黄酮类等功能性成分。具有止咳化痰、降压降糖等保健功效，深受广大消费者欢迎。常山胡柚的果皮和果肉等不同部位中均含有丰富的黄酮类等功能性成分，并有文献报道正在逐步被重视和开发^[1-4]。

随着对胡柚保健功能的认识逐步加强，对常山胡柚果皮和果肉两个部位中所含的主要功能性成分的含量也越来越关注。但常山胡柚中不同部位的多种功能性成分含量的超高效液相色谱-串联质谱法同时测定一直未见文献报道。因此，建立常山胡柚中不同部位的九种功能性成分的分析方法并得到功能成分的含量测定结果，有助于公众更好地了解和应用胡柚的保健功能，也有利于企业和主管部门对功能成分的含量进行有效的跟踪控制，该方法对促进常山胡柚的开发十分必要。

技术实现要素：

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供超高效液相色谱-串联质谱法同时测定常山胡柚的不同部位中九种功能性成分的方法，该方法操作简便、灵敏度高、结果准确，适用于作为常山胡柚中不同部位的九种功能性成分的快速筛查和确证的检测手段。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定常山胡柚的不同部位中九种功能性成分的方法，其特九种功能性成分分别为圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、柠檬苦素、橙皮素和诺米林，该方法包括以下的步骤：

1)标准溶液的配制

精密称取九种功能性成分的标准品10mg，精确至0.1mg，置于10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀配制成1mg/ml的单标储备液；并根据需要移取适量储备液，用甲醇：水＝1∶1(v/v)溶液，稀释成适宜浓度的标准工作溶液，避光保存于4℃冰箱中；

2)试样的制备

将采集的胡柚经超纯水清洗擦干后，分别分离出常山胡柚的果皮和果肉两部分，取各部位的样品适量分别进行搅碎、混匀，备用；

3)样品的前处理

3.1)果皮

称取试样0.5g，精确至0.01g，置于50ml具塞塑料离心管中，准确加入10ml甲醇：水＝6∶4(v/v)溶液，超声提取5min，8000转/min离心10min，取上清液，提取两次，合并提取液过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定；

3.2)果肉

称取试样2.0g，精确至0.01g，置于50ml具塞塑料离心管中，准确加入10ml甲醇：水＝6∶4(v/v)溶液，超声提取5min，8000转/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定；

4)超高效液相色谱分离条件

色谱柱：accucorexlc18柱，150×4mm，4.6μm；柱温：35℃；进样量：50μl；流速：0.5ml/min；流动相：a为甲醇，b为含0.15％甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0.0～1.0min,30％a；1.0～14.0min,30％a～65％a；14.0～14.1min，65％a～95％a；14.1～20.0min,95％a；20.0～20.1min，90％a～30％a；20.1～22.0min，30％a；

5)串联质谱分析条件

离子源：esi；扫描方式：正负离子切换扫描模式；检测方式：多反应监测；电喷雾电压+3500(-3000)v；毛细管温度：270℃，干燥气流量：10l/min；喷雾气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：30l/min；保留时间、质荷比、碰撞能量、s-lens电压和扫描模式条件进行优化后的质谱条件如下：

*为定量离子。

本发明由于采用了上述的技术方案，九种功能性成分在较宽的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.997。三个添加量水平的回收率在83.57％～112.91％之间，相对标准偏差均小于在1.58％～8.33％之间(n＝6)。测定了4批次常山胡柚样品，同时测定了其中的九种功能性成分。本方法快速、灵敏、准确，适用于常山胡柚中九种功能性成分的定性和定量检测。

附图说明

图1为果肉中九种成分在不同溶剂比下的提取效率图。

图2为果皮中九种成分在不同溶剂比下的提取效率图。

图3为不同提取次数对果肉中九种成分的提取效率图。

图4为不同提取次数对果皮中九种成分的提取效率图。

图5～图13分别为九种功能性成分的多反应监测色谱图。

具体实施方式

1材料与方法

1.1材料与试剂

四份常山胡柚样品购自水果市场，经溯源均采集自浙江省衢州市常山县，为常山胡柚的成熟果实，分别试验编号为常山胡柚1、2、3、4。

标准品：橙皮苷(cas:520-26-3，纯度:97.06％)，新橙皮苷(cas:13241-33-3，纯度：98.76％)，橙皮素(cas:520-33-2，纯度：98.45％)，柚皮苷(cas:10236-47-2，纯度：99.33％)，芸香柚皮苷(cas:14259-46-2，纯度:99.38％)，柚皮素(cas:480-41-1，纯度：98.09％)，柠檬苦素(cas:1180-71-8，纯度：99.08％)，诺米林(cas:1063-77-0，纯度：99.32％)，圣草次苷(cas:13463-28-0，纯度：98.16％)等九个标准品均购自上海安谱实验科技股份有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，试验用水为超纯水。

1.2仪器与设备

ultimate3000超高效液相色谱-tsqvantage三重四极杆串联质谱联用仪(美国thermoscientific公司)；multifugex1r离心机(美国thermoscientific公司)，高速粉碎机200g(浙江屹立工贸有限公司)。

1.3方法

1.3.1标准溶液的配制

精密称取九种功能性成分的标准品10mg(精确至0.1mg)置于10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀配制成1mg/ml的单标储备液；并根据需要移取适量储备液，用甲醇-水(1∶1，v/v)稀释成适宜浓度的标准工作溶液，避光保存于4℃冰箱中。

1.3.2试样的制备

将采集的胡柚经超纯水清洗擦干后，分别分离出常山胡柚的果皮和果肉两部分，取各部位的样品适量分别进行搅碎、混匀，备用。

1.3.3样品的前处理

1.3.3.1果皮

称取试样0.5g(精确至0.01g)，置于50ml具塞塑料离心管中，准确加入10ml甲醇-水(6/4,v/v)溶液，超声提取5min，8000转/min离心10min，取上清液，提取两次，合并提取液过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。

1.3.3.2果肉

称取试样2.0g(精确至0.01g)，置于50ml具塞塑料离心管中，准确加入10ml甲醇-水(6/4,v/v)溶液，超声提取5min，8000转/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。

1.3.4超高效液相色谱分离条件

色谱柱：accucorexlc18柱(150×4mm，4.6μm)；柱温：35℃；进样量：50μl；流速：0.5ml/min。流动相：a为甲醇，b为含0.15％甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0.0～1.0min,30％a；1.0～14.0min,30％a～65％a；14.0～14.1min，65％a～95％a；14.1～20.0min,95％a；20.0～20.1min，90％a～30％a；20.1～22.0min，30％a。

1.3.5串联质谱分析条件

离子源：esi；扫描方式：正负离子切换扫描模式；检测方式：多反应监测(mrm)；电喷雾电压+3500(-3000)v；毛细管温度(capilirrytemperature)：270℃，干燥气流量(gasflow)：10l/min；喷雾气压力(nebulizer)：45psi；鞘气温度(sheathgastemp)：350℃；鞘气流速(sheathgasflow)：30l/min。并对保留时间、质荷比、碰撞能量、s-lens电压和扫描模式等条件进行优化。

2结果与分析

2.1样品处理方法的优化

2.1.1提取方法的优化

常山胡柚中功能性成分的提取方法主要有索氏提取法和超声辅助提取法两种，因超声辅助提取法具有操作简便、快速、提取效率高等优点，所以本实验选择超声提取常山胡柚中九种功能性成分。

2.1.2提取溶剂的优化

实验比较了不同比例的甲醇-水作为提取溶剂对果肉和果皮中九种成分的提取效率的影响，结果分别见图1和图2。图中注：1-圣草次苷、2-芸香柚皮苷、3-柚皮苷、4-橙皮苷、5-新橙皮苷、6-柚皮素、7-柠檬苦素、8-橙皮素、9-诺米林。

由上图可知，果皮和果肉采用甲醇-水(6/4,v/v)超声提取后均能达到接近100％的提取率，较为充分。

2.1.3提取次数的优化

实验比较了不同提取次数对果肉和果皮中九种成分的提取效率的影响，结果分别见图3和图4。

由上图可知，果皮一次提取后提取率为75％-90％，而经两次提取后，均接近100％，较为充分，所以果皮提取两次更为合适。果肉经一次提取后提取率即达到94％以上，已较为充分，所以果肉提取一次即可。综上表明，果皮采用甲醇-水(6/4,v/v)超声提取10min，经两次提取，较为充分。而果肉含水量大，采用甲醇-水(6/4,v/v)超声提取5min，经一次提取，即较为充分。

2.2色谱条件的优化

流动相的组成和配比不但影响目标成分的色谱分离效果和离子化效率。本实验考察了甲醇-水(a)、乙腈-水(b)、甲醇-0.15％甲酸水溶液(c)、乙腈-0.15％甲酸水溶液(d)等4种流动相体系对圣草次苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柠檬苦素、柚皮素、橙皮素、诺米林等九种目标分析物的分离效果和峰信号强度。结果表明，九种目标分析物在甲醇-0.15％甲酸水溶液流动相体系下色谱峰分离效果和峰信号响应值最佳。故最终确定甲醇-0.15％甲酸溶液作为分离九种化合物的流动相。由此得到九种功能性成分的多反应监测色谱图，如图5～图13所示。

2.3质谱条件的优化

分别将九种化合物标准品溶液采用流动注射直接进样，分别在电喷雾电离源(esi)的正离子和负离子模式下进行扫描。确定各化合物的母离子，分别优化质谱的s-lens电压、碰撞能量(collisionenergy)等参数，进行子离子扫描，选取2种丰度强、稳定的碎片离子作为定量与定性离子。

芸香柚皮苷与柚皮苷为同分异构体，试验表明，芸香柚皮苷的[m+h]⁺离子信号强度大于[m-h]^-，而柚皮苷的[m+h]⁺离子信号强度弱于[m-h]^-。同样橙皮苷与新橙皮苷互为同分异构体，试验表明，橙皮苷的[m+h]⁺离子信号强度大于[m-h]^-，而新橙皮苷的[m+h]⁺离子信号强度弱于[m-h]^-。

实验发现，毛细管温度(capilirrytemperature)对诺米林的离子加合物形态有较大的影响。当毛细管温度(capilirrytemperature)270℃左右时，诺米林的[m+h]⁺准离子峰信号最强。

对保留时间、质荷比、碰撞能量、s-lens电压和扫描模式等条件进行优化后的质谱条件，见表1。

表1九种功能性成分的质谱条件

注：*为定量离子

2.4方法的线性范围和定量限

配制一系列不同质量浓度的混合标准工作溶液，并依次进样，分别以九种功能性成分的峰面积y为纵坐标，以相应的质量浓度x为横坐标，作标准曲线，结果表明：九种功能性成分在0.1～20ng/ml范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。九种功能性成分的线性方程及相关系数、线性范围、检出限及定量限见表2。

表2九种功能性成分的线性方程及相关系数、信噪比及定量限

2.6方法的回收率和精密度

分别在50％、100％和200％水平下进行加样回收率实验，每个水平重复6次，测定平均回收率及精密度。九种功能性成分的回收率和相对标准偏差rsd分别见表3，均符合检测要求。

表3九种功能性成分的回收率和相对标准偏差

2.7九种功能性成分的含量检测结果

按上述方法进行试验，每个样品重复3次，取平均值，得到九种功能性成分的含量检测结果，分别见表4-1和表4-2。

表4-1果皮中九种功能性成分的含量检测结果

表4-2果肉中九种功能性成分的含量检测结果

3结论

本实验建立了超高效液相色谱-串联质谱同时检测胡柚中九种功能性成分的分析方法。该方法作为常山胡柚中九种功能性成分的确证和定量方法，具有简便、快捷、准确的优点，可以用于常山胡柚中九种功能性成分的定性和定量分析。