一种兽药中金刚烷胺药物残留的检测方法与流程

本发明涉及分析化学技术领域，尤其是一种兽药中金刚烷胺药物残留的检测方法。

背景技术：

金刚烷胺是最早用于治疗流感的人用抗病毒类药物，曾被广泛应用在家禽养殖中。国际上于1966年批准作为预防药，1976年在预防药的基础上确认为治疗药。国内20世纪90年代末兽医临床曾用于动物病毒病的预防和治疗。由于其移植兽用后缺乏有效的动物安全试验数据，金刚烷胺作为抗病毒药物应用于兽医临床，缺乏科学规范、安全有效的实验数据，用于动物病毒性疫病不但给动物疫病控制带来不良的后果，而且影响国家动物疫病防控政策，人在食用带有金刚烷胺药物残留的动物产品后其病毒耐药性会增加。为此，农业部2005年发布第560号公告，明确禁止在动物养殖过程中使用金刚烷胺。在实际生产中，尤其是在肉鸡和蛋鸡养殖过程中仍存在非法使用现象。

目前，药品及血浆中金刚烷胺检测主要采用高效液相色谱法(hplc)、液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)、电化学法、荧光分光光度法、气相色谱法等，同时在动物血浆以及鸡肝、鸡肉等动物源性食品中有相关检测方法报道。用lc-ms/ms法实现了鸡肝中金刚烷胺的测定。金刚烷胺在鸡蛋中的残留检测尚未建立有效的方法。然而,现有的检测方法和标准中绝大部分都只针对动物源性食品，鲜有从兽药源头进行分析的。本方法通过优化提取净化条件，优化色谱和质谱条件，提高了分离效果，可以作为定性、定量的确证方法检测动物兽药中的金刚烷胺残留。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种兽药中金刚烷胺药物残留的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种兽药中金刚烷胺药物残留的检测方法，用液相色谱-串联质谱法测定兽药中的金刚烷胺药物残留，具体步骤如下：

(1)标准工作液和样品溶液在设定的液相色谱-串联质谱条件下进样，以质量浓度x为横坐标，峰面积的比值y为纵坐标，绘制5点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中药物的响应值应在仪器检测的线性范围内，其中，所设定的液相色谱-串联质谱条件如下：

①液相色谱条件

色谱柱：hypersilgoldc18,100mm×2.1mm,1.9μm

流动相：0.1％甲酸水/甲醇；流速：0.3ml/min；柱温：35℃；

进样量：10μl

液相梯度条件

②质谱条件

(2)在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的药物在设定质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的基质标准工作液的相对离子丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则可确定含有该药物。

优选的，上述兽药中金刚烷胺药物残留的检测方法，所述样品溶液的制备方法为试样直接用甲醇乙酸乙酯混合溶液两步提取，氮吹复溶后过0.22μm微孔滤膜。

上述兽药中金刚烷胺药物残留的检测方法，所述样品溶液的制备方法，具体步骤如下：

(1)准确称取1g试样，精确到0.01g，置于50ml聚苯乙烯离心管中，加4ml甲醇乙酸乙酯混合溶液，涡动混匀，离心力4000g-6000g，室温条件下离心10min，取出上清液取至10ml干净的离心管中；

(2)残渣继续用4ml甲醇乙酸乙酯混合溶液重复提取，合并两次提取液混匀后取出1.6ml至干净离心管中，55℃氮吹至干，以1ml复溶液复溶，复溶后样液经稀释10倍溶液过0.22μm微孔滤膜，即可供液相色谱-串联质谱仪测定。

本发明的有益效果是：

上述兽药中金刚烷胺药物残留的检测方法，用液相色谱-串联质谱法测定兽药中的金刚烷胺药物残留，该方法样品前处理时省去了净化过程，具有处理程序简单，快速，测定准确率高等特点；从兽药源头进行分析，有效保障养殖业用药安全，提高动物食品安全。

附图说明

图1为兽药阴性样品和阳性样品检测金刚烷胺总离子流图；

图23种提取溶剂分别提取金刚烷胺结果总离子流图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

一、提取

选取4种不同的兽药样品做3种不同浓度的添加回收实验进行方法验证，兽药中待测药物的提取溶剂，分别采用2％甲酸甲醇，2％甲酸乙腈和甲醇乙酸乙酯混合溶液，3种试剂进行提取条件的选择。实验结果表明，对于兽药中的金刚烷胺残留，甲醇乙酸乙酯混合溶液的提取效率好于另外两种试剂。

具体操作：

(1)准确称取1g试样，精确到0.01g，置于50ml聚苯乙烯离心管中，加4ml提取溶剂，涡动混匀，离心力4000g-6000g，室温条件下离心10min，取出上清液取至10ml干净的离心管中；

(2)残渣继续用4ml提取溶剂重复提取，合并两次提取液混匀后取出1.6ml至干净离心管中，55℃氮吹至干，以1ml复溶液复溶，复溶后样液经稀释10倍溶液过0.22μm微孔滤膜，即可供液相色谱-串联质谱仪测定。

二、测定

本实验定量方法为外标法定量。从冰箱中取出金刚烷胺100ng/ml标准工作液，恢复至室温后用10％甲醇0.1％甲酸水做溶剂配制浓度分别为0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的金刚烷胺标准溶液，每一浓度平行进样3针，按其所得峰面积比值平均数y为纵坐标，相应的标准品浓度x为横坐标绘制标准曲线。根据试样中被测物的药物含量，选取响应值相近的金刚烷胺标准工作液同时进行分析。金刚烷胺标准工作液和待测液中药物的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果含量超过标准曲线范围，应用基质空白溶液稀释到合适浓度后分析。

具体检测参数如下：

①液相色谱条件

色谱柱：hypersilgoldc18,100mm×2.1mm,1.9μm

流动相：0.1％甲酸水/甲醇；流速：0.3ml/min；柱温：35℃；

进样量：10μl

液相梯度条件

②质谱条件

在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的药物在设定质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的基质标准工作液的相对离子丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则可确定含有该药物。

三、具体实施案例结果

本实验共选取4种兽药进行金刚烷胺做添加回收试验，具体回收率和精密度结果如下表：

由以上案例可见，本发明采用液相色谱-串联质谱法测定兽药中的金刚烷胺药物残留，样品首先通过水溶过滤，甲醇乙酸乙酯两步提取，氮吹复溶后过微孔滤膜，然后用液相色谱-串联质谱法进行测定，外表法定量，回收率为78％～94％；相对标准偏差小于10％。本发明的检测方法样品处理程序简单、快速，省去了样品净化过程，降低了检测成本，并且可快速准确的测定出兽药中残留的金刚烷胺。方法测定金刚烷胺底限为0.5μg/kg，完全满足药物残留检测的要求。

上述参照具体实施方式对该一种兽药中金刚烷胺药物残留的检测方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。