本发明属于免疫检测领域，更具体地，涉及一种黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒、制备方法及检测方法。
背景技术：
黄曲霉毒素b1(aflatoxinb1，afb1)是二氢呋喃香豆素的衍生物，因其二氢呋喃环末端有双键而毒性较强，是已知的化学物质中致癌性最强的一种。据研究，afb1的毒性约为砒霜的68倍，致癌性为二甲基亚硝胺的75倍。人畜误食该类毒素能够引起内脏出血性坏死，慢性中毒，甚至可导致癌症发生。它存在于土壤，动植物各种坚果，特别是花生和核桃中，在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。由于黄曲霉毒素b1多见于天然食物中，危害性很强，国家质检总局规定黄曲霉毒素b1是大部分食品的必检项目之一。
目前，黄曲霉素b1的检测方法有薄层色谱法(tlc)、液相色谱法、酶联免疫法(elisa)、荧光光度法(iac/sfb)等。其中薄层色谱法(tlc)是测定黄曲霉毒素的经典方法，是中国测定食品及饲料中aft黄曲霉素b1(afb1)的标准方法之一(gb/t5009.23-2006)，该方法的优点是检测费用低廉，一般实验室均可完成；缺点是操作繁琐、费事，提取和净化效果不甚理想，灵敏度差，对操作人员身体健康存在较大程度的威胁。液相色谱法检测快速而且定性定量准确，检测限是目前所知黄曲霉素检测方法中最低的，可以作为仲裁法使用，但其仪器设备价格昂贵，且前处理方法相对繁琐。酶联免疫法(elisa)的优点是检测速度快捷，对人体危害小；缺点是重复性差，试剂寿命短，需低温保存，假阳性概率较高，需要配置专门的酶标仪。荧光光度法(iac/sfb)对检测人员身体健康无危害，检测样品速度迅速，灵敏度高，适宜于大量样品检测，且定量准确；缺点是检测费用较高，需配备专门的设备。对于现场监管、执法，必须建立一种科学、准确、快速、简单的检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒、制备方法及检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)胶体金标记物的制备：用胶体金标记抗黄曲霉素b1单克隆抗体和第二种属动物蛋白；获得胶体金标记物；
(2)金标微孔的制备：用ph为7～7.5的pbs缓冲液溶解步骤(1)的胶体金标记物，3～5℃、9000～11000r/min离心15～25min，取沉淀，用含8～12g/l第二种属动物蛋白的pbs缓冲液重悬，获得免疫胶体金溶液，此时胶体金标记物浓度为5～10g/l，取20～30μl免疫胶体金溶液点样于微孔反应板中，预冻3～5h，冻干10～18h，得到金标微孔；
(3)检测线和质控线的制备：将黄曲霉素b1-第二种属动物蛋白偶联物喷在硝酸纤维膜的检测线上，将第二种属动物蛋白的igg喷在硝酸纤维膜的质控线上，干燥；其中，质控线上包被的抗第二种属动物蛋白的igg的浓度≥检测线上包被的黄曲霉素b1-第二种属动物蛋白偶联物的浓度，干燥，制得硝酸纤维膜；
(4)试剂条的组装：将样品垫、步骤(3)获得的硝酸纤维膜、吸水垫依次首尾搭接并固定于pvc底板上，其中硝酸纤维膜上的检测线靠近样品垫一端，质控线靠近吸水垫一端，切裁制得试剂条；
(5)将试剂条和金标微孔装入盒中，即得黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒。
作为上述制备方法的优选，步骤(1)中，胶体金标记物的制备方法为：将胶体金溶液调节ph至7.5～8.5；加入抗黄曲霉素b1单克隆抗体，搅拌25～35min，加入第二种属动物蛋白，搅拌10～20min，加入聚乙二醇20000，搅拌10～20min，此时，胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为0.5～0.15g/l，抗黄曲霉素b1单克隆抗体浓度为15～25mg/l，第二种属动物蛋白浓度为1～2g/l，聚乙二醇2000浓度为1.5～2.5g/l；然后4℃、3500～4500r/min离心12～18min，取上清液，然后4℃、9000～11000r/min离心15～25min，取沉淀，即得胶体金标记物。
作为上述制备方法的优选，步骤(3)中，质控线上黄曲霉素b1-第二种属动物蛋白偶联物浓度为0.3～0.5mg/ml，检测线上抗第二种属动物蛋白的igg的浓度为0.3～0.5mg/ml。
作为上述制备方法的优选，胶体金的制备方法为柠檬酸三钠还原法。
作为上述制备方法的优选，胶体金颗粒直径为25～35nm。
作为上述制备方法的优选，第二种属动物蛋白为非抗体来源的蛋白质。
作为上述制备方法的优选，第二种属动物蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白或人血清白蛋白。
一种黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒，包括试剂条和金标微孔；所述试剂条包括pvc底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次首尾搭接并固定于pvc底板上，所述硝酸纤维素膜靠近样品垫一端设有检测线，远离样品垫一端设有质控线，所述检测线上包被有黄曲霉素b1-第二种属动物蛋白偶联物，所述质控线上包被有抗第二种属动物蛋白的igg，质控线上包被的抗第二种属动物蛋白的igg的浓度≥检测线上包被的黄曲霉素b1-第二种属动物蛋白偶联物的浓度；所述金标微孔中包被有胶体金标记的第二种属动物蛋白和抗黄曲霉素b1单克隆抗体；其特征在于：按照上述制备方法制备。
一种黄曲霉素b1的检测方法，其特征在于：采用上述试剂盒检测，包括如下步骤：
将待测样品溶解，形成样品液，取150μl样品液加入到金标微孔中，静置2min后，混匀，将金标微孔中的全部液体转移到试剂条的样品垫上，10～15min后判读结果；
判断方法如下：
阴性：检测线显色比质控线深或一样深，表示待测样品中无黄曲霉素b1存在或黄曲霉毒素b1浓度低于检出限；
阳性：检测线显色明显比质控线浅，表示待测样品中有黄曲霉素b1存在；
强阳性：检测线无显色，表示待测样品中有较多的黄曲霉素b1存在；
无效：质控线不出现。
本发明的有益效果是：
本发明的黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒，利用高度特异的抗体-抗原特异性结合反应及免疫膜层析技术，通过免疫竞争抑制法来定性检测食品中出现的黄曲霉素b1成分，具有快捷，高效，准确的定性检测效果。
其工作原理是：如果样品液中含有黄曲霉素b1，首先与金标微孔中的胶体金标记的抗黄曲霉素b1单克隆抗体结合，随后转移至样品垫上，依靠毛细作用层析至硝酸纤维素膜，顺序通过硝酸纤维素膜上喷点了黄曲霉素b1-牛血清白蛋白偶联物的检测线和喷点了羊抗兔igg的质控线，当样品液中黄曲霉素b1浓度达到产品设计的阈值浓度以上时，黄曲霉素b1占据了胶体金标记的抗黄曲霉素b1单克隆抗体的全部的抗原结合位点，这样就阻止了胶体金标记的抗黄曲霉素b1单克隆抗体和检测线的黄曲霉素b1-牛血清白蛋白偶联物结合，检测线不能捕获到胶体金颗粒而无红色色带出现，检测结果呈阳性。如果样品提取液中没有黄曲霉素b1或黄曲霉素b1的浓度低于阈值浓度，则抗黄曲霉素b1单克隆抗体-胶体金随同样品提取液运行至检测线，检测线捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，检测结果呈阴性。在试剂条上的质控线包被有羊抗兔igg，以指示试剂盒反应系统工作是否正常。质控线的出现与黄曲霉素b1的存在无关，质控线色带的出现表明：①样品加入量充足②样品在纸条上运行正常。
附图说明
图1为实施例3的判断结果显色示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
抗黄曲霉素b1单克隆抗体和羊抗兔igg均购于湖州艾维德生物技术有限公司；黄曲霉素b1-牛血清白蛋白偶联物
购于北京翰谱医药生物研究所。
本发明所述的第二种属动物蛋白为非抗体来源的蛋白质，可选自牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白、人血清白蛋白。
实施例1、一种黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒
一种黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒，包括试剂条和金标微孔；所述试剂条包括pvc底板、样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次首尾搭接并固定于pvc底板上，所述硝酸纤维素膜靠近样品垫一端设有检测线，靠近吸水垫一端设有质控线，所述检测线上包被有黄曲霉素b1-牛血清白蛋白偶联物，所述质控线上包被有羊抗兔igg，其中，质控线上包被的羊抗兔igg的浓度≥检测线上包被的黄曲霉素b1-牛血清白蛋白偶联物的浓度；所述金标微孔中包被有胶体金标记的牛血清白蛋白和抗黄曲霉素b1单克隆抗体。
实施例2、一种黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒的制备方法
制备实施例1试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
将浓度为0.01％的haucl4水溶液100ml，水浴或油浴至100℃，控制温度恒定，随后边搅拌、边按1～2滴/s的速度加入1％柠檬酸三钠水溶液1.80ml，继续搅拌加热20min，在25khz的超声频率下振荡3min后，水浴冷却至4℃，即制得颗粒大小为25～35nm的胶体金，胶体金清亮透明，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。
(2)胶体金标记物的制备：
用0.1mol/l的k2co3溶液调节步骤(1)获得的胶体金溶液至ph为8.0，加入抗黄曲霉素b1单克隆抗体，搅拌20min，加入牛血清白蛋白，搅拌15min，加入聚乙二醇20000，搅拌15min，此时，胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为0.1g/l，抗黄曲霉素b1单克隆抗体浓度为20mg/l，牛血清白蛋白浓度为1.5g/l，聚乙二醇2000浓度为1.5～2.5g/l；然后4℃、4000r/min离心15min，取上清液，然后4℃、10000r/min离心20min，取沉淀，即得胶体金标记物。
(3)金标微孔的制备
用ph为7.2的pbs缓冲液溶解步骤(2)的胶体金标记物，4℃、10000r/min离心20min，取沉淀，用含8～12g/l牛血清白蛋白浓度为的pbs缓冲液重悬，获得免疫胶体金溶液，此时胶体金标记物浓度为7.5g/l，取25μl免疫胶体金溶液点样于微孔反应板中，预冻3～5h，冻干10～18h，得到金标微孔；
(4)检测线和质控线的制备
将0.4mg/ml的黄曲霉素b1-牛血清白蛋白偶联物喷在硝酸纤维膜的检测线上，将0.4mg/ml的羊抗兔igg喷在硝酸纤维膜的质控线上，烘干，制得硝酸纤维膜，备用。
(5)试剂条的组装
将样品垫、步骤(4)获得的硝酸纤维膜、吸水垫依次首尾搭接并固定于pvc底板上，其中硝酸纤维膜上的检测线靠近样品垫一端，切裁制得试剂条。
(6)将试剂条和金标微孔装入塑料盒中，获得黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒。
实施例3、一种黄曲霉素b1的胶体金免疫检测试剂盒的的检测方法
实施例1试剂盒的检测方法：
(1)取适量待测样品于容器中，加入适量纯净水，充分震荡混匀3min，获得样品液，待检；
(2)取150μl样品液加入到金标微孔中，静置2min后，混匀，将金标微孔中的全部液体转移到试剂条的样品垫上；
(3)滴加样品液10～15min后判读结果，判断方法如下：阴性：检测线显色比质控线深或一样深，表示待测样品中无黄曲霉素b1存在或黄曲霉毒素b1浓度低于检出限；阳性：检测线显色明显比质控线浅，表示待测样品中有黄曲霉素b1存在；强阳性：检测线无显色，表示待测样品中有较多的黄曲霉素b1存在；无效：质控线不出现；任何情况下，质控线均应形成，表示加样和操作正确；质控线未出现表明测试结果是不确定的，应重测。判断结果显色示意图如图1所示。