一种同时检测甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法与流程

本发明属于生物化学分析检测领域，涉及一种同时检测血浆/尿液中甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的超高效液相色谱串联质谱方法。

背景技术：

嗜铬细胞瘤是一种罕见的内分泌性疾病，主要发生于肾上髓质的嗜铬细胞，会引起儿茶酚胺分泌增加。由于肿瘤组织分泌大量儿茶酚胺，作用于肾上腺素能受体，嗜铬细胞瘤常以阵发性或持续性高血压和代谢紊乱为主要临床表现，其他症状包括头痛，发作性出汗，心动过速，体重下降，疲劳，直立性低血压，焦虑精神紧张和苍白，还可能伴有致死性心血管并发症。因此，进行早期诊断并合理治疗至关重要。

嗜铬细胞瘤的诊断包括生化测试、影像学检测和遗传测试，生化检测是第一步也是至关重要的一步。在过去，尿液和血浆中儿茶酚胺的测定是评价嗜铬细胞瘤的主要生化方法，由于嗜铬细胞瘤中儿茶酚胺是间断性分泌的，这种诊断方法并不准确。在嗜铬细胞瘤中儿茶酚胺不断转化成甲氧基肾上腺素（metanephrine,mn）和甲氧基去甲肾上腺素（normetanephrine,nmn）两种代谢产物，mn和nmn的分泌不依赖于体内多变的儿茶酚胺。因此，血浆或尿液中mn和nmn的测定，可作为嗜铬细胞瘤生化诊断更精准的检测指标^[1]。对于生物体液中甲氧肾上腺素的分析技术要求有高的灵敏度和特异性。因此，迫切需要一种操作简单、稳定且灵敏度高，特异性好的检测方法。

早期的放射酶免疫法、气相色谱或荧光检测已被高灵敏度和高选择性的hplc串联电化学或荧光检测所代替，后者在临床生化实验中被广泛接受。尽管如此，其色谱分离前期的纯化步骤仍非常重要，且不容忽视。近期报道的方法中大多应用多聚合填料的wcxspe，本发明通过对spe填料的筛选，首次应用国产c18cexspe对血浆/尿液进行预处理，该方法操作简单，既能有效地富集样本，又能排除杂质降低基质效应，满足甲氧肾上腺素对预处理方法的要求，具有良好的临床应用前景。

超高效液相色谱串联质谱法，以其极高的灵敏度和特异性，在对甲氧肾上腺素的测定中显现出相当的优势。本发明应用超高效液相色谱串联质谱技术首次建立一种检测血浆/尿液中甲氧肾上腺素含量的方法，该方法特异性强，灵敏，准确，高效，在临床样本检测中体现出卓越的优势。

技术实现要素：

一种同时检测血浆/尿液中甲氧基肾上腺素（mn）和甲氧基去甲肾上腺素（nmn）的超高效液相色谱串联质谱方法，属于生物化学分析检测领域。本发明通过在血浆/尿液中加入同位素内标溶液，混合均匀后过经活化平衡的96孔板，再经过淋洗、洗脱，最后收集含甲氧肾上腺素的洗脱液。采用离线spe法进行样本预处理，较在线spe法节省成本，既能有效地富集样本，又能排除杂质降低基质效应。本发明首次应用国产c18cexspe填料，建立了一种同时定量测定血浆/尿液中mn和nmn的超高效液相色谱串联质谱法。该预处理方法操作简单、且国产填料的应用打破市场垄断，超高效液相色谱串联质谱法灵敏度高、专属性强、定量准确，具有良好的临床应用前景。

本发明所采用的技术方案是：一种同时检测血浆/尿液中mn和nmn的超高效液相色谱串联质谱方法，检测方法步骤为：

a.样品的制备：取样品至ep管中，加入内标溶液后，混合均匀，过活化平衡好的96孔板，再经过3次淋洗，最后洗脱，收集含甲氧肾上腺素的洗脱液。

b.利用hplc-ms/ms法对上述洗脱液进行分析和采集。

步骤a中淋洗的具体操作为：加入500μl纯水进行第一次淋洗，完成之后加入200μl甲醇进行第二次淋洗，最后加入200μl乙腈进行第三次淋洗。

步骤a中洗脱的具体操作为：加入200μl乙腈，ep管收集洗脱液。

步骤中a中内标溶液为氘代变肾上腺素(d3-mn)，氘代去甲变肾上腺素（d3-nmn）的混合溶液。

所述色谱柱采用亲水色谱柱。

所述样本为血浆/尿液。

所述混合内标溶液浓度为：

d3-变肾上腺素：30nmol/l

d3-去甲变肾上腺素：30nmol/l

步骤b中液相色谱条件：色谱柱：watersacquityuplc@behhilic2.1×100mm，1.7μm；柱温：40℃，进样室温度：4℃，流速：0.4ml/min，进样体积：10μl，流动相a:0.2%甲酸水溶液，流动相b:乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1；

质谱条件为：离子源：esi⁺；脱溶剂气流速：800ml/h；脱溶剂温度：500℃；毛细管电压：3kv。

1)标准曲线（质控品）制备方法：取30μl标准工作液（质控品）于1.5ml离心管中，加入270μl4%bsa，涡旋15s，spe96孔板经500μl甲醇活化，500μl纯水平衡后，上样，依次用500μl的纯水，200μl甲醇，200μl甲酸乙腈淋洗，最后用200μl乙腈洗脱，收集洗脱液，取150μl至进样小瓶中，hplc-ms/ms方法进样10μl分析。

2)样本的制备方法：取300μl待测样品溶液于1.5ml离心管中，加入20μl内标液、涡旋15s，spe96孔板经500μl甲醇活化，500μl纯水平衡后，上样，依次用500μl的纯水，200μl甲醇，200μl乙腈淋洗，最后用200μl乙腈洗脱，收集洗脱液，取150μl至进样小瓶中，hplc-ms/ms方法进样10μl分析。

本发明的有益效果：本发明采用将血浆/尿液加入同位素内标溶液，混合均匀，过经活化平衡的96孔板，再经过淋洗、洗脱，最后收集含甲氧肾上腺素的洗脱液。采用spe法进行样本预处理，方法通量高，有效地富集样本，又能排除杂质降低基质效应。本发明首次应用基于c18cexspe填料的预处理方法，建立了一种同时定量测定血浆/尿液中mn和nmn的超高效液相色谱串联质谱法，该方法灵敏度高、专属性强、定量准确，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例所述的含mn和nmn混合标准品及各待测物内标溶液的mrm色谱图。

图2是本发明实施例所述的血浆样本及内标溶液mrm色谱图。

具体实施方式

下面以富集效果最好的c18cex96孔板为具体实例，进一步阐述本发明。该应用实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

1.仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪：uhplc-xevowaters

高速冷冻离心机：techcomp型号ct18rt

恒温混旋仪：thermo-shaker型号as20130565138

超声波清洗器：新芝型号sb-25-12d

甲酸（色谱级），乙腈（色谱级），水（娃哈哈纯净水）

2.标准溶液的制备

分别取mn、nmn的标准品适量，精密称定，置于ep管中，乙腈将其溶解，制成含mn、nmn的混合标准品溶液，备用。用乙腈稀释上述混合标准品溶液，制成如下浓度的系列标准溶液及qc溶液，见表2。

表2mn、nmn的系列标准溶液及qc溶液

3.色谱条件：

色谱柱：watersacquityuplc@behhilic2.1×100mm，1.7μm；

流动相：0.2%甲酸水溶液（a），乙腈（b）；梯度洗脱，洗脱程序见表1；

流速：0.4ml/min；

柱温：40℃；

进样量：10μl

4.质谱条件：

离子源：esi+

源温：150℃

脱溶解气温度：500℃；

脱溶剂气流速：800l/h；

毛细管电压：3kv；

待测物mrm扫描参数见表3。

表3mn、nmn及内标的mrm扫描参数

5.前处理方法：

5.1标准工作液/质控品前处理方法：

取30μl标准工作液（质控品）于1.5ml离心管中，加入270μl4%bsa，涡旋15s，spe96孔板经500μl甲醇活化，500μl纯水平衡后，上样，依次用500μl的纯水，200μl甲醇，200μl乙腈淋洗，最后用200μl乙腈洗脱，收集洗脱液，取150μl至进样小瓶中，hplc-ms/ms方法进样10μl分析。

5.2血浆样本前处理方法：

取300μl样本溶液于1.5ml离心管中，加入20μl内标液、涡旋15s，spe96孔板经500μl甲醇活化，500μl纯水平衡后，上样，依次用500μl的纯水，200μl甲醇，200μl乙腈淋洗，最后用200μl乙腈洗脱，收集洗脱液，取150μl至进样小瓶中，hplc-ms/ms方法进样10μl分析。

6.线性方程

按照“标准工作液前处理方法”制备样本，进行hplc-ms/ms分析。分别以mn、nmn的浓度为横坐标，以mn、nmn与内标的峰面积比为纵坐标，用加权（w=1/c²）最小二乘法进行回归计算，最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。典型的回归方程及线性范围见表4。

表4mn、nmn的保留时间，线性方程及线性相关系数

7.精密度试验

按照“质控前处理方法”制备样本，每个浓度（qc低，qc中，qc高）分别制备6个样本，连续测定3天，并与标准曲线同批测定，以当日的标准曲线计算质控样品的浓度，求得方法的精密度（rsd），结果见表5。

表5精密度试验结果

8.回收率试验

精密量取4%bsa水溶液270μl，加入30μl含各待测物的系列标准溶液，制备mn和nmn的低、中、高三个浓度的qc样品（每浓度五样本分析），所得峰面积代入当天的随行标准曲线，得浓度c，用测得的浓度与加入浓度进行比较，计算加样回收率。结果见表6。

表6回收率试验结果

9.基质效应

精密量取4%bsa水溶液270μl，加入30μl含各待测物的系列标准溶液，制备mn和nmn的低、中、高三个浓度的qc样品（每浓度五样本分析），测得的峰面积记为a1；另精密量取纯水270μl，加入30μl，按“血浆样本前处理”项下同法试验，进行lc-ms/ms分析，获得相应的峰面积（五次测定的平均值），记为a2，以每一浓度两种处理方法的峰面积比值a1/a2×100%计算基质效应。结果见表7。

表7基质效应试验结果

10.分析结果的计算

读出待测样品的峰面积，根据步骤6所建立的mn和nmn的标准曲线，计算得到样品的mn和nmn的含量分别为0.4μmol/l和0.7μmol/l如图1所示出峰时间mn为1.57min，nmn为1.59min。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。