本发明属于土霉素检测技术领域，具体涉及一种快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法。
背景技术：
土霉素(oxytetracycline,otc)是龟裂链霉菌发酵过程中产生的次级代谢产物，具有广谱抑菌作用，是应用较广的广谱抗生素之一；效价检测是菌种筛选过程中费时的环节，减少效价检测时间，可以提高筛选量，更快速的筛选出高产土霉素菌种，现有效价检测方法有药典中规定的高效液相色谱法和企业内部使用的hcl-fecl3分光光度计检测法，然而高效液相色谱法虽然准确度高但费时，hcl-fecl3分光光度计检测法比高效液相色谱法检测时间短，但检测效果较差且操作也不简便，因此现有技术需要进一步的改进。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种更加高效，准确的快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法。
基于上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法，由以下步骤制备而成：
（1）称取土霉素标准品，用0.01mol/l的盐酸溶解配成1000u/ml的母液，然后再用超纯水将配成的土霉素标准品母液分别稀释成5u/ml、10u/ml、15u/ml、20u/ml、25u/ml、30u/ml、35u/ml、40u/ml；
（2）分别吸取200μl步骤（1）中各个浓度的土霉素标品至酶标板中，以超纯水为对照，用酶标仪于290-292nm波长下检测各浓度土霉素标准品溶液的吸收值，以浓度y为纵坐标、吸收值x为横坐标作图，求得x、y的函数关系式，要求相关系数r>0.999；
（3）取土霉素斜面孢子制成单孢子悬液置于深孔板内进行发酵得到土霉素发酵液，每个孔中土霉素斜面孢子制成单孢子悬液体积相同；
（4）向每个孔中的土霉素发酵液加入等体积等浓度的草酸震荡混匀，得到酸化的土霉素发酵液，将酸化后的土霉素发酵液进行离心；
（5）吸取离心后土霉素发酵液的上清液置于96孔酶标板中，所述的每个孔中土霉素发酵液的上清液体积相同，加入超纯水稀释100~200倍，混合均匀后，然后用酶标仪于290-292nm下检测吸光值；
（6）将步骤（5）中检测的吸光值x带入函数关系式中计算得浓度值y，使用浓度值计算得土霉素孔板发酵液效价，计算公式如下：浓度值×稀释倍数=孔板发酵液效价（u/ml）。
进一步的，所述的步骤（3）中，深孔板的为48孔深孔板，并且每个孔中土霉素发酵培养基的体积为1.0~1.2ml。
进一步的，所述的步骤（5）中，孔板的为96孔酶标板，并且每个孔中土霉素发酵液的上清液稀释倍数为100-200倍，体积为200ul。
进一步的，所述的草酸的摩尔浓度为0.5~1.0mol/l。
进一步的，所述的步骤（4）中离心所使用的转速为3000~4000r，离心时间为10~20min。
本发明操作简单，稳定性好，可显著缩短土霉素孔板发酵液效价检测时间，提高土霉素菌种筛选效率。
具体实施方式
实施例1：
一种快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法，由以下步骤制备而成：
（1）称取土霉素标准品，用0.01mol/l的盐酸溶解配成1000u/ml的母液，然后再用超纯水将配成的土霉素标准品母液分别稀释成5u/ml、10u/ml、15u/ml、20u/ml、25u/ml、30u/ml、35u/ml、40u/ml；
（2）分别吸取200μl步骤（1）中各个浓度的土霉素标品至酶标板中，以超纯水为对照，用酶标仪于290nm波长下检测各浓度土霉素标准品溶液的吸收值，以浓度y为纵坐标、吸收值x为横坐标作图，求得x、y的函数关系式，要求相关系数r>0.999；
（3）取土霉素斜面孢子制成单孢子悬液置于深孔板的为48孔深孔板内进行发酵得到土霉素发酵液，每个孔中土霉素发酵培养基的体积为1.0ml；
（4）向每个孔中的土霉素发酵液加入等体积摩尔浓度为0.5mol/l的草酸震荡混匀，得到酸化的土霉素发酵液，将酸化后的土霉素发酵液进行离心，所述的离心所使用的转速为3000r，离心时间为10min；
（5）吸取离心后土霉素发酵液的上清液置于96孔酶标板中，加入超纯水稀释100倍，混合均匀后，然后用酶标仪于290nm下检测吸光值；
（6）将步骤（5）中检测的吸光值x带入函数关系式中计算得浓度值y，使用浓度值计算得土霉素孔板发酵液效价，计算公式如下：浓度值×稀释倍数=孔板发酵液效价（u/ml）。
实施例2：
一种快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法，由以下步骤制备而成：
（1）称取土霉素标准品，用0.01mol/l的盐酸溶解配成1000u/ml的母液，然后再用超纯水将配成的土霉素标准品母液分别稀释成5u/ml、10u/ml、15u/ml、20u/ml、25u/ml、30u/ml、35u/ml、40u/ml；
（2）分别吸取200μl步骤（1）中各个浓度的土霉素标品至酶标板中，以超纯水为对照，用酶标仪于291nm波长下检测各浓度土霉素标准品溶液的吸收值，以浓度y为纵坐标、吸收值x为横坐标作图，求得x、y的函数关系式，要求相关系数r>0.999；
（3）取土霉素斜面孢子制成单孢子悬液置于深孔板的为48孔深孔板内进行发酵得到土霉素发酵液，每个孔中土霉素发酵培养基的体积为1.1ml；
（4）向每个孔中的土霉素发酵液加入等体积摩尔浓度为0.8mol/l的草酸震荡混匀，得到酸化的土霉素发酵液，将酸化后的土霉素发酵液进行离心，所述的离心所使用的转速为3500r，离心时间为15min；
（5）吸取离心后土霉素发酵液的上清液置于96孔酶标板中，加入超纯水稀释150倍，混合均匀后，然后用酶标仪于291nm下检测吸光值；
（6）将步骤（5）中检测的吸光值x带入函数关系式中计算得浓度值y，使用浓度值计算得土霉素孔板发酵液效价，计算公式如下：浓度值×稀释倍数=孔板发酵液效价（u/ml）。
实施例3：
一种快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法，由以下步骤制备而成：
（1）称取土霉素标准品，用0.01mol/l的盐酸溶解配成1000u/ml的母液，然后再用超纯水将配成的土霉素标准品母液分别稀释成5u/ml、10u/ml、15u/ml、20u/ml、25u/ml、30u/ml、35u/ml、40u/ml；
（2）分别吸取200μl步骤（1）中各个浓度的土霉素标品至酶标板中，以超纯水为对照，用酶标仪于292nm波长下检测各浓度土霉素标准品溶液的吸收值，以浓度y为纵坐标、吸收值x为横坐标作图，求得x、y的函数关系式，要求相关系数r>0.999；
（3）取土霉素斜面孢子制成单孢子悬液置于深孔板的为48孔深孔板内进行发酵得到土霉素发酵液，每个孔中土霉素发酵培养基的体积为1.2ml。（4）向每个孔中的土霉素发酵液加入等体积摩尔浓度为1.0mol/l的草酸震荡混匀，得到酸化的土霉素发酵液，将酸化后的土霉素发酵液进行离心，所述的离心所使用的转速为4000r，离心时间为20min；
（5）吸取离心后土霉素发酵液的上清液置于96孔酶标板中，加入超纯水稀释200倍，混合均匀后，然后用酶标仪于292nm下检测吸光值；
（6）将步骤（5）中检测的吸光值x带入函数关系式中计算得浓度值y，使用浓度值计算得土霉素孔板发酵液效价，计算公式如下：浓度值×稀释倍数=孔板发酵液效价（u/ml）。
试验例1：
将土霉素斜面孢子制成单孢子悬液，然后进行梯度稀释涂布在平皿培养基上，待孢子生长成熟后，用灭过菌的牙签将平皿上的单菌落逐一挑取至装有200μl种子培养基的48孔深孔板培养27h，然后按9%的接种量转接至装有1.0ml发酵培养基的48孔深孔板培养6天，发酵的培养温度为30℃，培养湿度为40%，培养转速为230r/min，发酵后按照实施例3中的方法，求得x、y的函数关系式，并将实施例3中步骤（5）中加入超纯水稀释，计算效价，所述的a1-a6分别有五个试验样，为平行试验，所述的48孔深孔板内培养基（g/l）：玉米淀粉40g，淀粉酶0.25g，黄豆饼粉3.0g，硫酸铵5g，碳酸钙5.5g，氯化钠4g，磷酸二氢钾0.2g，检测结果如下表1所示：
表1：本发明土霉素孔板发酵液效价的检测结果
由上表1可知，本发明检测检测土霉素孔板发酵液效价，操作简便，结果重现性好。
试验例2：
根据2015版兽药典所记载的高效液相色谱仪测定方法检测a1-a6的土霉素孔板发酵液效价的平均值，将其结果与本发明试验例1中检测土霉素孔板发酵液效价的平均值结果相对比，结果如下表2所示：
表2：高效液相色谱仪和本发明中试验例1的土霉素孔板发酵液效价平均值
由上表2可知，虽然本发明检测方法液相色谱法相比其数值更加准确，且本发明方法检测的效价不会影响优势菌株的选择。