一种基于石墨烯适配子水凝胶的土霉素传感检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境分析领域，涉及一种用于水溶液中土霉素的比色传感检测方法。
【背景技术】
[0002]近年来，土霉素(oxytetracycline)作为一种常见抗生素类药物，被广泛应用于人类及各种动物疾病的治疗，以及畜牧业、渔业养殖的添加剂中。相关医学研宄表明，人体及其它动物的代谢作用无法完全分解土霉素，剩余的土霉素通过动物的新陈代谢作用进入环境。更加严重的是，目前广泛应用的水污染控制技术很少对抗生素污染进行针对性的调控，因而即使经过处理的污水中各种抗生素的含量依然处于较高的水平。
[0003]针对日益严重的抗生素污染，目前已经开发出了各种基于化学和生物手段的分析检测方法，其中比较常用的是高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫法(ELISA)。上述方法主要有灵敏度高、特异性强的优点，但是普遍需要昂贵的仪器、繁琐的步骤以及样品的预处理。因此，需要开发新的检测技术，以适应更加广泛、快速、简便的检测需求。
[0004]水凝胶是以水为分散介质的凝胶，具有网状的交联结构，由疏水基团及亲水基团结合而成。广义上的水凝胶可由任何亲水性或水溶性的分子构成，由于能够吸收水分且具有一定的生物亲和性被用于生物医学领域，如手术中使用的生物粘合剂，以及“智能药物”的研宄。水凝胶的结构稳定性根据构成材料的不同有很大的差异，传统的水凝胶对环境变化如温度、PH等无明显的响应，而环境敏感型或目标敏感型水凝胶能够通过感知外界环境的微小变化或特定物质的存在产生物理和化学结构的突变。由于这种特性，水凝胶可能成为对污染物进行传感检测的理想材料。
【发明内容】
[0005]本发明的目的通过合成石墨烯-适配子水凝胶实现对溶液中土霉素的检测。本发明通过利用石墨烯层次间及石墨烯-适配子π -31共轭堆积作用生成水凝胶结构，并利用土霉素DNA适配子土霉素分子的特异性识别能力对土霉素进行传感检测。
[0006]本发明的技术方案是:
[0007]本发明提供了一种基于石墨烯适配子水凝胶的土霉素传感检测方法，包括如下步骤:
[0008](I)配制0.03-0.15g/mL的石墨浓硫酸溶液，缓慢加入KMnO4, KMnO4与石墨质量比为1.5?4:1，超声5-10小时；缓慢加入水，水与加水前溶液体积比为1.5?2:1 ;搅拌，待降温后再次加入水，水与加水前溶液体积比为2?4:1，并加入30%过氧化氢溶液，过氧化氢溶液体积为加过氧化氢溶液前体积的0.03-0.1倍，此时溶液由褐色悬浊状立即转变为金黄色悬浊状。
[0009](2)将步骤(I)得到的金黄色悬浊液进行提纯，向提纯得到的氧化石墨中加入稀盐酸，加入体积为加入前溶液体积的0.03-0.05倍。以6000-8000r/min离心并弃上层溶液，离心不少于5次，再使用水重复上述步骤不少于5次，即得到氧化石墨烯，然后对氧化石墨烯溶液进行透析处理。
[0010](3)经过步骤(2)经过透析处理得到的氧化石墨烯配制成l-8mg/mL的分散液，在50-100°C下水热1-5小时，之后加入0.l-2mg/mL 土霉素适配子溶液，加热1_20分钟，即制得石墨烯-适配子水凝胶。
[0011]DNA适配子序列:
[0012]5’ -CGTACGGAATTCGCTAGCCGAGGCACAGTCGCTGGTGCCTACCTGGTTGCCGTTGTGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’
[0013](4)将步骤(4)得到的石墨烯-适配子水凝胶进行真空冷冻干燥，称取1mg-1OOmg水凝胶干燥物，加入土霉素(Oxytetracycline dehydrate, 95% , MW = 469.46)溶液中，轻微振荡，静置，观察到部分水凝胶重新分散在溶液中，在680-720nm下测定可见光吸光度。
[0014]步骤⑴和步骤⑵中，体系需在0°C冰水浴中进行反应。对石墨烯氧化物溶液的透析操作需在8000-12000道尔顿的透析袋中进行，时间为I至2周。
[0015]本发明具有如下效果:
[0016](I)灵敏度高，对50ppb-lppm的土霉素溶液均具有检出效果
[0017](2)选择性高，抗干扰性强。
[0018](3)操作简单，不需要复杂昂贵的大型设备。
【附图说明】
[0019]图1是本发明所述的石墨烯-适配子水凝胶的三维结构示意图。
[0020]图2是本发明所述的石墨烯-适配子水凝胶的扫描电子显微照片。
【具体实施方式】
[0021]以下结合附图和技术方案进一步说明本发明的【具体实施方式】。
[0022]探索合成石墨烯-适配子水凝胶的合成条件，检验并优化水凝胶的检测限，实现对土霉素的高效检测。材料的合成主要分为石墨烯氧化物的合成以及石墨烯-适配子水凝胶的水热合成两个步骤。石墨烯氧化物的合成基于改进的Hummers方法，可简要概括为以下步骤:准确称取l_3g鳞片状石墨粉，加入20-30ml浓硫酸中并在冰水浴中搅拌。放置一夜过后，在冰水浴中缓慢加入3-5g KMnO4,并超声8h。之后缓慢加入30_60ml水，搅拌，待降温后加入150-200ml水，并加入10_20ml 30 %过氧化氢溶液，此时体系由褐色立即转变为金黄色，即表示合成完毕。对合成的GO进行纯化，首先加入l-2mol/L稀盐酸，6000-8000r/min离心并弃上层溶液，重复两次，再使用高纯水重复上述步骤5-10次。最后放入8000-12000D的透析袋中，透析1-2周。
[0023]石墨稀溶液浓度为l_8mg/ml,适配子浓度采用0.l_2mg/ml。由于本方法水热合成法需要较长时间，出于保护DNA结构的目的对石墨烯氧化物溶液进行预加热l_5h，温度为50-100摄氏度，可观察到石墨烯溶液颜色开始加深并且出现凝聚的趋势。此时立即向其中加入同体积的适配子溶液，持续加热l-20min，即合成黑褐色、具有显著固液分解面的石墨烯-适配子水凝胶。
[0024]下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
[0025]实施例1:一种基于石墨烯适配子水凝胶的土霉素传感检测方法。
[0026]准确称取2g石墨粉，加入20ml浓硫酸中搅拌，静置12h。缓慢加入5g KMnO4，并超声8h。之后缓慢加入30ml水，搅拌，待降温后加入150ml水，并加入20ml 30%过氧化氢溶液，此时体系由褐色立即转变为金黄色，即表示合成完毕。对合成的GO进行纯化，首先加入2mol/L稀盐酸，7000r/min离心并弃上层溶液，重复两次，再使用高纯水重复上述步骤5次。最后放入10000道尔顿的透析袋中，透析1-2周。
[0027]石墨稀溶液浓度为lmg/ml,适配子浓度采用0.5mg/ml。由于本方法水热合成法需要较长时间，出于保护DNA结构的目的对石墨烯氧化物溶液进行预加热4h，温度为70摄氏度，可观察到石墨烯溶液颜色开始加深并且出现凝聚的趋势。此时立即向其中加入同体积的适配子溶液，持续加热15min，即合成黑褐色、具有显著固液分解面的石墨烯-适配子水凝胶。
[0028]取1mg干燥过后的水凝胶加入200ppb 土霉素溶液中，在200ppb浓度的土霉素溶液中水凝胶发生显著分散，达到了检测土霉素的目标。
[0029]实施例2:—种基于石墨烯适配子水凝胶的土霉素传感检测方法
[0030]准确称取1.5g石墨粉，加入28ml浓硫酸中搅拌，静置12h。缓慢加入4.5g KMnO4,并超声8h。之后缓慢加入40ml水，搅拌，待降温后加入130ml水，并加入18ml 30%过氧化氢溶液，此时体系由褐色立即转变为金黄色，即表示合成完毕。对合成的GO进行纯化，首先加入1.5mol/L稀盐酸，7500r/min离心并弃上层溶液，重复两次，再使用高纯水重复上述步骤5次。最后放入8000道尔顿的透析袋中，透析2周。
[0031]石墨稀溶液浓度为1.5mg/ml，适配子浓度采用0.8mg/ml。由于本方法水热合成法需要较长时间，出于保护DNA结构的目的对石墨烯氧化物溶液进行预加热3h，温度为90摄氏度，可观察到石墨烯溶液颜色开始加深并且出现凝聚的趋势。此时立即向其中加入同体积的适配子溶液，持续加热5min，即合成黑褐色、具有显著固液分解面的石墨烯-适配子水凝胶。
[0032]取1mg干燥过后的水凝胶加入500ppb 土霉素溶液中，体系中水凝胶发生显著分散，达到了检测土霉素的目标。
[0033]实施例3:—种基于石墨烯适配子水凝胶的土霉素传感检测方法。
[0034]准确称取1.25g石墨粉，加入23ml浓硫酸中搅拌，静置10h。缓慢加入4.5g KMnO4,并超声8h。之后缓慢加入35ml水，搅拌，待降温后加入145ml水，并加入18ml 30%过氧化氢溶液，此时体系由褐色立即转变为金黄色，即表示合成完毕。对合成的GO进行纯化，首先加入1.5mol/L稀盐酸，7500r/min离心并弃上层溶液，重复两次，再使用高纯水重复上述步骤5次。最后放入10000道尔顿的透析袋中，透析2周。
[0035]石墨稀溶液浓度为0.9mg/ml,适配子浓度采用0.4mg/ml。由于本方法水热合成法需要较长时间，出于保护DNA结构的目的对石墨烯氧化物溶液进行预加热3h，温度为80摄氏度，可观察到石墨烯溶液颜色开始加深并且出现凝聚的趋势。此时立即向其中加入同体积的适配子溶液，持续加热12min，即合成黑褐色、具有显著固液分解面的石墨烯-适配子水凝胶。
[0036]取1mg干燥过后的水凝胶加入400ppb 土霉素溶液中，在200ppb浓度的土霉素溶液中水凝胶发生显著分散，达到了检测土霉素的目标。
[0037]实施例4:一种基于石墨烯适配子水凝胶的土霉素传感检测方法。
[0038]准确称取1.3g石墨粉，加入25ml浓硫酸中搅拌，静置10h。缓慢加入4g KMnO4,并超声8h。之后缓慢加入40ml水，搅拌，待降温后加入150ml水，并加入19ml 30%过氧化氢溶液，此时体系由褐色立即转变为金黄色，即表示合成完毕。对合成的GO进行纯化，首先加入1.4mol/L稀盐酸，6000r/min离心并弃上层溶液，重复两次，再使用高纯水重复上述步骤7次。最后放入10000道尔顿的透析袋中，透析I周。
[0039]石墨稀溶液浓度为0.8mg/ml,适配子浓度采用0.3mg/ml。由于本方法水热合成法需要较长时间，出于保护DNA结构的目的对石墨烯氧化物溶液进行预加热3h，温度为80摄氏度，可观察到石墨烯溶液颜色开始加深并且出现凝聚的趋势。此时立即向其中加入同体积的适配子溶液，持续加热12min，即合成黑褐色、具有显著固液分解面的石墨烯-适配子水凝胶。
[0040]取50mg干燥过后的水凝胶加入450ppb 土霉素溶液中，在450ppb浓度的土霉素溶液中水凝胶发生显著分散，达到了检测土霉素的目标。
[0041]实施例5:—种基于石墨烯适配子水凝胶的土霉素传感检测方法。
[0042]准