专利名称：利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法
技术领域：
本发明涉及可卡因的检测方法，尤其是涉及一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测 可卡因的荧光检测方法。技术背景
可卡因是从古柯叶中分离出来的一种最主要的生物碱，属中枢神经兴奋剂，也是 一种强效局部麻醉剂。可卡因属于常见毒品之一，吸食可卡因会产生强烈的心理依赖性并 对身体造成极大伤害，引发社会安全问题。因此寻找快速、简便、高灵敏度的方法来检测可 卡因当前研究的热门课题，具有重要意义。
如公开号为CN 101948907 A的“一种提高可卡因检测灵敏度的方法”，使用的是纳 米金颗粒，能观察到颜色变化，并且可以用通过光学和电化学的信号来测定可卡因的存在。 此专利的优点在于能直接通过颜色变化检测，且电化学光化学均可以，但是检测限不高，为 O.5Mmol/L0
随着科学家们对核酸的研究受到越来越多的关注，特别是关于生物遗传分子机理 以及寡核苷酸分子的识别、测序等方面的研究。目前针对于核酸的新型分析方法已经在生 命科学研究、环境检测、药物毒性筛选和疾病分子诊断等领域得到迅速发展。科学家发现核 酸中的可卡因适配体能特异性的与可卡因形成含3个茎状结构的二级结构复合物，这一特 点为可卡因的检测提供了新的途径。因此，一些具有特异性结合功能的寡核苷酸探针相继 被开发出来，并取得了较好的效果。
近年来，氧化石墨烯以其特殊的力学、量子学和电学性质，颇受物理和材料学界重 视。由于其具有优异的电学性能、导热性好、比表面积大等优点，也为生物分子的检测提供 了新的思路。目前，随着单壁碳纳米管在生物传感中的成功应用，氧化石墨烯也逐渐成为传 感领域青睐的对象。由于氧化石墨烯的特殊性质，使得检测过程操作简单、反应快速，这样 大大减少了实验的步骤，同时可以显著的提高检测的灵敏度和特异性。发明内容
本发明的目的是针对现有的可卡因检测方法存在检测仪器昂贵、灵敏度较低等的 问题，提供一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法，其具有较高特异 性和灵敏度。
本发明利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法，按以下次序的步 骤依次进行
I)将染料标记的寡核苷酸探针加入到缓冲溶液中，对溶液进行荧光检测，记录寡 核苷酸探针的荧光发射谱带；
2)将氧化石墨烯作为固相载体加入到上述溶液中，使寡核苷酸探针吸附到氧化石 墨烯的表面，形成寡核苷酸/氧化石墨烯复合物，将染料的荧光信号猝灭；
3)在寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中加入互补探针进行反应，通过互补探针与寡核苷酸探针的碱基结合作用，形成双链二级结构，使寡核苷酸探针从氧化石墨烯的表面 脱离并且游离在溶液中从而使荧光得以恢复，在激发波长480 490nm，发射波长490 650nm下进行荧光检测，所述互补探针包含一段单链核酸，与寡核苷酸探针碱基互补，无荧 光标记；
4)在双链探针/氧化石墨烯复合物中加入可卡因进行反应，通过可卡因与互补探 针的特异性作用，形成含3个茎状结构的二级结构，使寡核苷酸探针又重新结合到氧化石 墨烯的表面，从而使突光信号淬灭，在激发波长480 490nm,发射波长490 650nm下进行 荧光检测。
本发明步骤I)中，用于标记的染料为荧光素FAM，染料标记在寡核苷酸探针的5’ 端，所述寡核酸探针的碱基组成为5’ -CTGTTCCTTTTAGGAAGTTACTTCACCCAG-3 ,;所用缓冲 溶液为 O. 02mol/L Tris-HCl,O. lmol/L NaCl，O. 005mol/L KCl，0.005mol/L MgCl2 , pH =7. 4。进行荧光检测方法为以480 490nm为激发波长，发射波长扫描范围为490 650 nm0
本发明步骤2)中，所述寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯表面的温度为室温，荧光 猝灭的时间为I 3分钟。
本发明步骤3)中，所述互补探针的碱基组成为5' -GACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGT GGGTC-3'，在寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中加入互补探针进行反应的温度为室温，寡核 苷酸探针从氧化石墨烯表面脱离的时间为10 20分钟。
本发明步骤4)中，在双链探针/氧化石墨烯复合物中加入可卡因进行反应的温度 为室温，可卡因与互补探针特异性作用形成含3个茎状结构的二级结构，使寡核苷酸探针 重新结合到氧化石墨烯表面的时间为10 20分钟。
本发明先以氧化石墨烯为固相载体用来吸附荧光素标记的寡核苷酸探针，由于氧 化石墨烯表面具有能与寡核苷酸进行非共价键结合作用的化学基团，可以使荧光素标记的 寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯的表面，从而形成寡核苷酸/氧化石墨烯复合物，此时，荧 光素与氧化石墨烯之间发生高效的能量转移，荧光素的荧光被氧化石墨烯有效的猝灭。当 加入互补探针时，互补探针能够与寡核苷酸探针碱基结合形成双链结构，使寡核苷酸探针 脱离氧化石墨烯的表面，此时荧光素基团与氧化石墨烯之间的距离较远，不能发生有效的 能量转移，标记在寡核苷酸探针末端的荧光素的荧光信号得到恢复，可以检测到较强的荧 光信号恢复。当溶液中存在可卡因时，可卡因会与互补探针特异性结合形成含3个茎状结 构的二级结构，使寡核苷酸探针重新结合到氧化石墨烯表面，使荧光发生淬灭。
本发明的有益效果本发明通过检测溶液中荧光强度的变化来达到检测可卡因的 目的，检测方法简便、快速，具有较高特异性和灵敏度，在可卡因检测方面具有重要的意义。 根据本发明的荧光检测方法，最低可检测的可卡因的浓度为6nmol/L。当体系中含有茶碱、 咖啡碱等其它非靶生物碱分子时，仍然可以实现对可卡因的高灵敏度的检测。因此，本发明 有望应为实际样品中可卡因的检测提供一种简便、快速的方法。
图1为本发明利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法的工作原 理图。
图2为检测过程中不同反应体系荧光强度结果对比图。其中，a为染料标记寡核苷酸探针；b为寡核苷酸+氧化石墨烯复合物；c为双链探针+氧化石墨烯复合物；d为双链探针+氧化石墨烯复合物+可卡因；e为双链探针+氧化石墨烯复合物+水作空白对照。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明。以下实施例仅是用于对本发明的进一步具体描述，而不是用于对本发明要求保护范围的限定。
下述实施例中，荧光检测所用仪器为荧光分光度计(RF-5301，日本)。荧光光谱测量条件氙灯激发，激发和发射狭缝宽度为5. O nm和10. O nm,电压为950V，响应时间2 S， 激发波长为480 490nm，发射波长扫描范围490 650 nm ;用3 mL石英比色皿进行测量， 样品体积1. 60 mL ;室温。
所用氧化石墨烯是根据文献(W.S. Hummers, R. E. Offeman, J. Am. Chem. Soc. 1958，80，1339-1339)中 Hummers 的方法合成的。
所用Tris-HCl 缓冲溶液的组成为 O. 02mol/L Tris-HCl,O. lmol/L NaCl， O. 005mol/L KCl ,0. 005mol/L MgCl2 , pH =7.4。
所用寡核苷酸探针和互补探针购自上海生物工程技术有限公司，
权利要求
1.一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法，按以下次序的步骤依次进行1)将染料标记的寡核苷酸探针加入到缓冲溶液中，对溶液进行荧光检测，记录寡核苷酸探针的荧光发射谱带；2)将氧化石墨烯作为固相载体加入到上述溶液中，使寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯的表面，形成寡核苷酸/氧化石墨烯复合物，将染料的荧光信号猝灭；3)在寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中加入互补探针进行反应，通过互补探针与寡核苷酸探针的碱基结合作用，形成双链二级结构，使寡核苷酸探针从氧化石墨烯的表面脱离并且游离在溶液中从而使荧光得以恢复，在激发波长480 490nm，发射波长490 650nm下进行荧光检测，所述互补探针包含一段单链核酸，与寡核苷酸探针碱基互补，无荧光标记；4)在双链探针/氧化石墨烯复合物中加入可卡因进行反应，通过可卡因与互补探针的特异性作用，形成含3个茎状结构的二级结构，使寡核苷酸探针又重新结合到氧化石墨烯的表面，从而使突光信号淬灭，在激发波长480 490nm,发射波长490 650nm下进行突光检测。
2.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法，其特征在于步骤I)中，用于标记的染料为荧光素FAM，染料标记在寡核苷酸探针的5’端，所述寡核酸探针的碱基组成为5’ -CTGTTCCTTTTAGGAAGTTACTTCACCCAG-3,;所用缓冲溶液为 O. 02mol/L Tris-HCl,O. lmol/L NaCl,0. 005mol/L KCl ,0. 005mol/L MgCl2 , pH =7.4。
3.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法，其特征在于步骤I)中进行荧光检测方法为以480 490nm为激发波长，发射波长扫描范围为 490 650 nm。
4.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法，其特征在于步骤2)中，所述寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯表面的温度为室温，荧光猝灭的时间为I 3分钟。
5.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法，其特征在于步骤3)中，所述互补探针的碱基组成为5' -GACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTC -3^，在寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中加入互补探针进行反应的温度为室温，寡核苷酸探针从氧化石墨烯表面脱离的时间为10 20分钟。
6.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法，其特征在于步骤4)中，在双链探针/氧化石墨烯复合物中加入可卡因进行反应的温度为室温，可卡因与互补探针特异性作用形成含3个茎状结构的二级结构，使寡核苷酸探针重新结合到氧化石墨烯表面的时间为10 20分钟。
全文摘要
本发明公开了一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测可卡因的荧光检测方法，先将染料标记的寡核苷酸探针加入到缓冲溶液中；再加入氧化石墨烯作为固相载体，使寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯的表面，形成寡核苷酸/氧化石墨烯复合物，将染料的荧光信号猝灭；然后加入互补探针进行反应，通过互补探针与寡核苷酸探针的碱基结合作用，形成双链二级结构，使荧光得以恢复；最后加入可卡因进行反应，通过可卡因与互补探针的特异性作用，形成含３个茎状结构的二级结构，使寡核苷酸探针又重新结合到氧化石墨烯的表面，使荧光信号淬灭。本发明通过检测溶液中荧光强度的变化来达到检测可卡因的目的，检测方法简便、快速，具有较高特异性和灵敏度。
文档编号G01N21/64GK102998292SQ20121054562
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者苗立坤, 喻世涛, 黄龙, 朱巍 申请人:湖北中烟工业有限责任公司, 武汉市黄鹤楼科技园有限公司