基于氧化石墨烯和限制性内切酶的dna甲基化检测方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种DNA甲基化检测方法，包括以下步骤：1）DNA序列的选取，2）DNA双链的杂交。本发明还公开了一种DNA甲基化检测试剂盒。本发明可以直接通过DNA链的杂交，借助氧化石墨烯和DNA的相互作用，在CpG岛区通过各种甲基化过程使得胞嘧啶甲基化，利用限制性内切酶的识别特定位点并且切割CpG位置的功能，达到检测甲基化DNA的目的，此方法与现有的检测技术比较具有操作简单，快速便捷的特点，同时本发明可以检测一些对人体有害的化学试剂对DNA造成的影响是DNA的甲基化。
【专利说明】基于氧化石墨烯和限制性内切酶的DNA甲基化检测方法及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及基于氧化石墨烯和限制性内切酶的DNA甲基化检测方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA / TGG和GATC常被甲基化而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。高等真核细胞通常是对DNA分子上5’ -CpG-3’序列的胞嘧啶进行甲基化修饰，使CpG 二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达。
[0003]DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要的作用，参与了动物胚胎发育、基因印记和X染色体失活等过程。研究表明，DNA甲基化化的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及蛋白互相作用方式的改变，从而控制基因的表达。[0004]甲基化状态的改变是引起肿瘤的还包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达。因此对甲基化的研究为肿瘤早期预测，分类，分级，以及预后评估提供了新的依据。
[0005]CpG岛甲基化的检测方法众多。其原理大部分是基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法和柱层法的方法。大部分方法会与PCR技术和高通量芯片技术联用。
【发明内容】
[0006]发明目的:为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供基于氧化石墨烯和限制性内切酶的DNA甲基化检测方法。本发明还提供了该检测方法的试剂盒。
[0007]技术方案:为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现:一种DNA甲基化检测方法，包括以下步骤:
[0008]I )DNA序列的选取:含有CCGG序列的一端修饰有荧光基团的探针DNA、与探针DNA有一段互补的靶基因DNA，标准化甲基化靶基因DNA得到的序列1、甲基化转移酶造成的甲基化靶基因DNA得到的序列2以及引起DNA甲基化化学试剂造成的甲基化靶基因DNA的序列3 ；
[0009]2) DNA双链的杂交:探针DNA分别与靶基因DNA、序列1、序列2和序列3进行杂交，再加入适量的氧化石墨烯，然后加入限制性内切酶，通过观察甲基化前后双链DNA与氧化石墨烯作用后的荧光恢复程度不同来检测是否甲基化。
[0010]其中，探针DNA与靶基因DNA进行杂交，再加入适量的氧化石墨烯，由于双链形成而且尾部还有一端多出碱基的单链DNA，双链DNA不能脱离氧化石墨烯表面，因此荧光强度还是很弱。当双链DNA中加入限制性内切酶，酶会识别并切断CCGG的第二个胞嘧啶位置，从而在加入氧化石墨烯后，被切割的片段带荧光的DNA就会脱离氧化石墨烯表面，荧光恢复。探针DNA比靶基因DNA多了 10个碱基，是为了使得杂交后的双链DNA在氧化石墨烯的表面的荧光强度还是很弱的一种状态。杂交后的双链在和氧化石墨烯相互作用后仍然是荧光很弱的状态，但当在形成的双链DNA中加入限制性内切酶，识别并切割CpG位点，在氧化石墨烯表面被切割的小片段的带荧光基团的DNA会脱离氧化石墨烯表面，从而荧光恢复。
[0011]甲基化的过程是通过试剂间的化学反应或者甲基化转移酶(M.SssI)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)反应产生甲基自由基从而使DNA的胞嘧啶C进行甲基化。甲基化后的DNA与探针DNA杂交形成双链DNA，在有限制性内切酶存在的条件下，不会切割已经被甲基化的DNA,双链DNA仍然在石墨烯表面，荧光无法恢复。
[0012]其中，序列I是通过标准化甲基化靶基因DNA得到的序列，所述标准化甲基化靶基因DNA是直接人工合成的胞嘧啶位置进行5’C位置甲基化得到的。选取标准化甲基化DNA与探针DNA杂交，具体检测方法和上述一样，得到结果是甲基化不影响双链DNA的形成，与氧化石墨烯作用后双链仍然在氧化石墨烯表面，荧光仍然是猝灭状态且与酶识别位点出现一个碱基错配的荧光强度是一致的，说明形成的甲基化双链DNA并没有被酶识别切割。
[0013]被处理过的DNA是被甲基化的，而不是断链的。有报道亚铁离子和双氧水在与DNA反应足够时间是导致DNA断链的，那么这时双链DNA是无法形成的，此时在氧化石墨烯表面都是单链DNA的存在形式。那么在同样氧化石墨烯量存在的条件下，虽然都是荧光猝灭的状态，但带有荧光基团的单链探针DNA更容易在氧化石墨烯表面猝灭。杂交后的双链DNA有脱离氧化石墨烯表面的趋势，所以荧光强度要比单链在氧化石墨烯表面的强。
[0014]其中，序列2是甲基化转移酶与S-腺苷甲硫氨酸作用形成甲基自由基从而使DNA碱基甲基化得到的序列。
[0015]一种常见的甲基化转移酶(M.SssI)和S腺甲硫氨酸SAM与DNA反应后会使得DNA胞嘧啶C位置甲基化。与之对比，化学常见有毒试剂二甲亚砜和乙醛在有亚铁离子和双氧水存在的条件下与DNA作用后，检测方法同上述，根据荧光数值分析，甲基化处理后的DNA不影响杂交，双链DNA未能完全脱离氧化石墨烯的表面，只是无法实现酶切过程，荧光信号与标准化的甲基化的检测结果是接近的。由此可判断DNA处理后是被甲基化的。
[0016]其中，序列3中引起DNA甲基化的化学试剂选自两种，一种是DMS0，一种是乙醛。这两种试剂都是常见的化学上具有一定毒性的化学药品，对人体有一定的危害。二价亚铁离子和双氧水反应会产生羟基自由基然后与DMSO或者乙醛之类的化学试剂反应会产生甲基自由基从而得到序列3。
[0017]所述限制性内切酶为Hpall。探针DNA中的CCGG序列中设计一个碱基的错配，第二个胞嘧啶换成腺嘌呤A。作为控制条件，在Hpa II的识别位置CCGG中设计一个碱基的错配，第二个胞嘧啶换成腺嘌呤A，当探针DNA与靶基因DNA杂交后，再加入限制性内切酶，最后发现荧光并没有完 全恢复但是比单链探针DNA的要强，说明双链DNA形成后并没有被酶识别切割。
[0018]所述引起DNA甲基化化学试剂为二甲亚砜和乙醛。
[0019]所述胞嘧啶是CpG岛区的胞嘧啶。[0020]本发明检测DNA甲基化方法中，通过酶或者化学试剂的反应产生甲基自由基使得DNA碱基甲基化。
[0021]一种DNA甲基化检测试剂盒，包括以下成分:
[0022]I) 25微克/毫升的氧化石墨烯；
[0023]2)限制性内切酶HpaII ；
[0024]3)含有CCGG序列的一端修饰有荧光基团的探针DNA ；
[0025]4)与探针DNA有一段互补的靶基因DNA ；
[0026]5) pH为7.2的33mM tris-醋酸缓冲体系。
[0027]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发明可以直接通过DNA链的杂交，借助氧化石墨烯和DNA的相互作用，在CpG岛区通过各种甲基化过程使得胞嘧啶甲基化，利用限制性内切酶的识别特定位点并且切割CpG位置的功能，达到检测甲基化DNA的目的，此方法与现有的检测技术比较具有操作简单，快速便捷的特点，同时本发明可以检测一些对人体有害的化学试剂对DNA造成的影响是DNA的甲基化；与现有检测DNA甲基化的方法比较，此方法实现了非标准化的化学试剂造成的特定的DNA的甲基化。而且检测方法简单快捷，利用双链DNA在氧化石墨烯上仍然是荧光很弱的猝灭状态，再加入限制性内切酶后荧光是否恢复的检测方法来检测DNA的甲基化。 【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是本发明检测DNA CpG岛区甲基化的示意图。
[0029]图2探针DNA和靶基因DNA杂交形成的双链DNA在随着氧化石墨烯的量从a到h:O, 1.25，2.5，5，10，25，50，100微克/毫升变化而变化的荧光强度图；可以看出当氧化石墨烯的量为25微克/毫升时，荧光减弱已经接近到最低。
[0030]图3探针DNA与靶基因DNA形成的双链加酶后在不同的氧化石墨烯表面的荧光恢复强度。a代表氧化石墨烯浓度是25微克每毫升，b代表的是50微克每毫升，c代表的是100微克每毫升。可见只有氧化石墨烯的量在25微克每毫升的时候，酶切后的荧光恢复是最强的，有利于酶切前后荧光信号的对比，所以选取氧化石墨烯的量为25微克/毫升。
[0031]图4双链DNA (—端多出10个碱基)随着加入25微克/毫升的氧化石墨烯的时间变化的荧光强度变化图；可以看出双链荧光强度随氧化石墨烯的加入的减弱是非常迅速的。杂交的双链并未完全脱离氧化石墨烯表面。
[0032]图5实验方案原理验证图；a代表探针DNA和靶基因DNA杂交后的荧光强度，c代表双链DNA杂交后在氧化石墨烯表面的荧光强度，荧光大幅度减弱，b代表双链DNA在加入限制性内切酶后在氧化石墨烯表面的荧光强度，荧光恢复。
[0033]图6实验方案原理验证图；只有探针DNA:只有探针DNA:a代表探针DNA的荧光强度，c代表单链DNA在氧化石墨烯表面的荧光强度，荧光大幅度减弱，b代表单链DNA在加入限制性内切酶后在氧化石墨烯表面的荧光强度，荧光未恢复。
[0034]从图5和图6结果证明单链探针DNA在加入氧化石墨烯后的荧光减弱强度比杂交后形成的双链DNA的荧光减弱程度大，并且只有杂交后的双链DNA在加入限制性内切酶酶切后荧光恢复。
[0035]图7靶基因DNA的特异性控制实验图；a是完全互补的靶基因DNA，b代表的是在限制性内切酶的酶切位点的CCGG中的单个碱基错配，第二个胞嘧啶C错配成腺嘌呤A，c代表的是完全不互补的靶基因DNA。由此可知，在限制性内切酶位置出现碱基错配，是不会被酶特定识别切割的。
[0036]图8体系中不同的靶基因DNA情况导致的荧光强度的变化图。a代表的是无靶基因DNA，b代表的是完全不互补的靶基因DNA，c代表作为控制的限制性内切酶识别位点CCGG中第二个胞嘧啶被腺嘌呤A取代的荧光强度，d代表的是作为标准的甲基化DNA，与c的荧光强度应该是相似的，不会被酶切，e代表的是甲基化转移酶形成的DNA甲基化，f代表的是靶基因DNA在亚铁离子和双氧水存在条件下，造成DNA断链从而不能形成杂交双链DNA的荧光强度，g代表的是f的基础上再加入二甲亚砜的荧光强度，h代表的是f的基础上在加入乙醛的荧光强度，i代表的是完全互补的靶基因DNA。可知，由甲基化转移酶，二甲亚砜，乙醛形成的靶基因DNA甲基化在试剂量一样情况下，甲基化程度是不一样的，而且与DNA断链有明显区别。
【具体实施方式】
[0037]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0038]仪器:荧光分析仪
[0039]主要试剂:限制性内切酶Hpa II，甲基化转移酶，S-腺甲硫氨酸，二甲亚砜，乙醛，
氧化石墨烯
[0040]DNA甲基化检测方法如下:
[0041 ] UDNA序列的选取:合成的寡核苷酸链探针DNA序列:
[0042]5’-FAM ACCCGGATAAGATGCTACTTACTCAC-3’
[0043]靶基因DNA 序列:5’ -AGCATCTTATCCGGGT-3’
[0044]2、DNA双链的杂交。修饰有荧光基团的探针DNA (26个碱基)与靶基因DNA(16个碱基)，在pH为7.2的33mM tris-醋酸(IOmM Mg2+, 66mM Na+)缓冲体系中杂交，浓度为I μ M
[0045]3、取杂交后的DNA溶液25 μ L到250 μ L Hpa II的特定的缓冲溶液中，pH为7.9的 33mM 的 tris-醋酸(IOmM Mg2+, 66mM 醋酸钾，0.lmg/mL 的 BSA)。加入 HpaII 酶 0.5 μ L，37摄氏度反应2个小时。作为控制的DNA溶液中不加HpaII酶，分别在荧光分析仪测试之ill加入氧化石墨稀250 μ L50 μ g/mL震汤。
[0046]4、靶基因DNA的基因化过程。分为两种方法，一种是甲基化转移酶的甲基化过程，甲基化转移酶和S腺甲硫酸铵提供甲基自由基与DNA作用后使得DNA甲基化。另一种方法是化学试剂造成的DNA甲基化。有毒化学试剂二甲亚砜和乙醛在双氧水和亚铁离子存在条件下，会反应提供甲基自由基从而使DNA甲基化。所有甲基化过程都是控制在37摄氏度反应4个小时。化学试剂甲基化的反应环境是氮气氛围下，ImL反应体积，IOmMpH为7.3的PBS缓冲液(抗坏血酸10mM、EDTA-2Na3mM、FeS045mM、H20219mM)，二甲亚砜与乙醛浓度为100mM。检测过程与步骤2相同。只是将靶基因DNA分别用标准化的甲基化DNA，以及甲基转移酶处理的和化学试剂处理的靶基因DNA来代替。
[0047]5、证明上述过程是造成DNA甲基化的因素。在只有亚铁离子和双氧水没有二甲亚砜和乙醛存在的条件下，DNA发生的是Fenton反应，造成的是DNA的断链，在靶基因DNA发生断链的情况下在37摄氏度的反应温度下是不能和修饰有荧光基团的探针DNA杂交形成DNA双链的。其他反应条件和步骤3—样。检测结果与甲基化的荧光强度比有很明显的下降。
[0048]实施例2采用检测试剂盒进行DNA甲基化检测的过程
[0049]DNA甲基化检测试剂盒:
[0050]I) 25微克/毫升的氧化石墨烯；
[0051]2)限制性内切酶HpaII ；
[0052]3)含有CCGG序列的一端修饰有荧光基团的探针DNA ；
[0053]4)与探针DNA有一段互补的靶基因DNA。
[0054]1、甲基化转移酶的DNA甲基化的检测:
[0055]在pH为7.2的33mM tris-醋酸(IOmM Mg2+,66mM Na+)缓冲体系中杂交，浓度为I μ Μ，将甲基化转移酶造成的甲基化靶基因DNA序列与含有CCGG序列的一端修饰有荧光基团的探针DNA进行杂交；逐渐加入25微克/毫升的氧化石墨烯，然后加入限制性内切酶HpaII，观察双链DNA与氧化石墨烯作用后的荧光恢复程度。
[0056]2、化学试剂造成的DNA甲基化的检测:
[0057]在pH为7.2的33mM tris-醋酸(IOmM Mg2+, 66mM Na+)缓冲体系中杂交，浓度为
Iμ Μ，将化学试剂造成的DNA甲基化靶基因DNA序列与含有CCGG序列的一端修饰有荧光基团的探针DNA进行杂交；逐渐加入25微克/毫升的氧化石墨烯，然后加入限制性内切酶，观察双链DNA与氧化石墨烯作用后的荧光恢复程度。
[0058]通过双链DNA在酶切后荧光恢复的强弱来判断DNA的甲基化程度，加酶后，荧光恢复越强，甲基化程度越低，反之，甲基化程度越高。
【权利要求】
1.一种DNA甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)DNA序列的选取:含有CCGG序列的一端修饰有荧光基团的探针DNA、与探针DNA有一段互补的靶基因DNA，标准化甲基化靶基因DNA得到的序列1、甲基化转移酶造成的甲基化靶基因DNA得到的序列2以及引起DNA甲基化化学试剂造成的甲基化靶基因DNA的序列3 ； 2)DNA双链的杂交:探针DNA分别与靶基因DNA、序列1、序列2和序列3进行杂交，再加入适量的氧化石墨烯，然后加入限制性内切酶，通过观察甲基化前后双链DNA与氧化石墨烯作用后的荧光恢复程度不同来检测是否甲基化。
2.根据权利要求1所述的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述标准化甲基化靶基因DNA是直接人工合成的胞嘧啶位置进行5’ C位置甲基化。
3.根据权利要求1所述的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶为HpaI10
4.根据权利要求1所述的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述探针DNA中的CCGG序列中设计一个碱基的错配，第二个胞嘧啶换成腺嘌呤A。
5.根据权利要求1所述的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述引起DNA甲基化化学试剂为二甲亚砜和乙醛。
6.根据权利要求4所述的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述胞嘧啶是CpG岛区的胞嘧啶。
7.—种DNA甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分: . 1)25微克/毫升的氧化石墨烯； .2)限制性内切酶HpaII； . 3)含有CCGG序列的一端修饰有荧光基团的探针DNA； .4)与探针DNA有一段互补的靶基因DNA； . 5)pH为7.2的33mM tris-醋酸缓冲体系。
【文档编号】C12Q1/44GK103509872SQ201310472714
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】卫伟, 熊艳翔, 刘松琴 申请人:东南大学