基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法
【专利摘要】本发明涉及基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，属于生物传感【技术领域】。首先，采用水热法一步合成了Fe3O4/rGO，利用Fe3O4/rGO的类过氧化物酶性质催化过氧化氢氧化底物TMB产生蓝色，检测TMB氧化产物位于652nm波长处特征吸收的强弱实现对过氧化氢的检测；进一步，基于Fe3O4/rGO能催化H2O2氧化无色的TMB转化成相应的蓝色产物，结合乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶同时存在下能分解产生H2O2，建立了乙酰胆碱可视化传感新方法。本发明旨在提供一种操作简便灵活，仪器设备简单，检测成本低廉、灵敏度较高的乙酰胆碱比色检测方法。
【专利说明】基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种对乙酰胆碱可视化检测方法的构建，在技术上涉及材料学、光分析化学，生物传感等领域。
【背景技术】
[0002]乙酰胆碱(Acetylcholin^Ach)是一种神经元之间或神经元与效应器之间进行信息传递的神经递质，主要存在于生物体的外周神经系统和中枢神经系统。人的脑组织中有大量的乙酰胆碱，但乙酰胆碱的含量会随着年龄的增加而出现下降。正常老人比青年时下降30%，老年痴呆患者下降更为严重，可达70%~80%。当大脑中乙酰胆碱含量低于一定水平时，就会增加患上阿尔茨海默病的几率。阿尔茨海默病是一种慢性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断退化，日常生活能力逐渐减退，并伴随有各种精神病症状和行为障碍，对病人会造成极大的困扰。同样，帕金森症和多发性硬化等疾病的发生也和乙酰胆碱含量有密切关系。研究表明，富含乙酰胆碱的食物对患有阿尔茨海默病等和乙酰胆碱失衡有关疾病的患者非常有利。因此，乙酰胆碱作为人体非常重要的一种营养物质，已经被广泛的添加到食品当中，例如牛奶和保健食品等。因此实现对乙酰胆碱的定量检测对临床分析、食品工业、饲料添加剂等领域有重要意义。
[0003]目前，定量测定乙酰胆碱含量的方法大致可分为两大类:生物测定法和物理化学测定法。生物测定法的原理是基于某些生物组织对乙酰胆碱浓度的灵敏反应实现的。如蛙腹直肌等，在较低浓度乙酰胆碱作用下可发生收缩，而组织收缩的幅度在一定范围内与乙酰胆碱的浓度呈正比例 。故可根据肌肉收缩的幅值实现对乙酰胆碱浓度的测定。但是生物测定法的灵敏度和特异性较差，如乙酰胆碱使不同标本产生的反应可被有关的酯类所干扰。因而，近几十年，乙酰胆碱的生物测定方法的发展没有明显进步。物理化学测定法的原理有很多，具体测定方法有多种。传统的色谱方法用于乙酰胆碱含量检测已被广泛研究，如气相色谱与火焰离子检测器联用法(GC-FID)和高效液相-电化学检测器联用(HLPC-ED)法以及液相色谱-带电喷雾离子源的质谱仪联用法(LC/ES1-MS/MS)等，其中GC - FID最早应用于乙酰胆碱的定量检测。GC - FID法通过检测叔胺类化合物含量来确定乙酰胆碱的含量，检测限可达0.02 nM。传统的色谱法在实际用中都存在操作复杂、样品处理费时、灵敏度与特异性不够、设备昂贵等缺点。近年来，一些对大型设备依赖性较低的方法，如荧光法和化学发光法等被用于实现乙酰胆碱检测。然而，此类传感器费用高、保质期短以及制备过程冗长等缺点，鉴于这些检测方法所存在的局限性，发展简单、快速、经济、有效的乙酰胆碱检测新方法已成为迫在眉睫的重要研究课题。比色检测是分析科学领域的一个重要方面，其关键就是把检测事件转变成颜色变化。比色检测与传统检测相比有很大的优势，尤其是在操作性、经济性和实用性等方面。比色法可以通过肉眼直接识别反应溶液颜色变化，不需要昂贵或者复杂的仪器，操作非常简便，因此可应用于现场分析和即时诊断。
[0004]纳米材料具有小尺寸效应、表面效应和量子尺寸效应，展现出特殊的光学、电学及磁性等性能，在荧光分析、催化反应及生物传感中有广泛应用。随着纳米材料的发展，能够催化底物使溶液产生颜色变化的纳米材料越来越多。例如:金纳米粒子具有独特的依赖于尺寸、形状和结构的光学性质，其聚集或再分散会导致胶体溶液颜色的变化，因此被广泛应用于比色传感；一些具有模拟酶催化活性的金属氧化物纳米颗粒，能够催化过氧化物酶底物的氧化反应而产生颜色变化。比色检测可以利用这些颜色变化应用于生物医疗诊断和环境监测。
[0005]Fe3O4具有模拟酶催化活性，能催化H2O2氧化过氧化物酶显色底物3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)，使检测体系产生一个由无色到蓝色的显色反应。同时乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的双重催化下能产生过氧化氢(H2O2),这为基于Fe3O4纳米材料仿酶性质的乙酰胆碱比色检测方法的建立提供了可能性。和过氧化物酶相比，Fe3O4具有明显的优势如稳定性高，制备简单，价格便宜等，且其本身具有磁性而易于分离回收符合绿色化学理念。但Fe3O4易团聚的特性，在一定程度上限制了其性质的应用。本发明利用二甘醇溶剂热法合成了具有更好分散性的磁性还原石墨烯(Fe304/rG0)复合物，并利用乙酰胆碱双酶体系催化乙酰胆碱产生的H2O2为氧化剂，建立Fe304/rG0催化显色底物TMB的显色特性与乙酰胆碱浓度的对应关系，实现了对乙酰胆碱的简便、经济、快速检测。
【发明内容】
[0006]技术问题:本发明的目的是针对上述技术问题，提供了一种基于Fe3O4/石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法。首先，采用二甘醇溶剂热法合成了具有更好分散性的Fe304/rG0,进一步验证H2O2浓度对基于Fe304/rG0催化H2O2氧化TMB显色性质的比色检测的影响；然后，将乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶能催化乙酰胆碱分解产生的H2O2与Fe3CVrGO比色检测H2O2相结合，建立乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系；最终实现对乙酰胆碱的浓度测定。
[0007]技术方案:一种基于Fe304/rG0仿酶性质的乙酰胆碱比色检测方法:首先，以氧化石墨烯、FeCl2 ? 4H20和 FeCl3 ? 6H20为前驱体，采用用二甘醇溶剂热法合成了具有更好分散性的Fe304/rG0，进一步探究Fe304/rG0催化的显色反应与H2O2浓度的对应关系；然后，在乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的双酶体系催化下，乙酰胆碱分解产生H2O2 ;最后，在酶催化反应后的溶液中直接加入Fe304/rG0，催化乙酰胆碱分解的H2O2氧化TMB产生显色反应，建立乙酰胆碱浓度和溶液颜色吸光度的线性关系，实现乙酰胆碱的比色检测。具体步骤为:
(I) Fe304/rG0的制备:首先将FeCl2 ? 4H20和FeCl3 ? 6H20加入到含有氧化石墨烯(GO)的二甘醇(DEG)溶液中，其中FeCl2 ? 4H20、FeCl3 ? 6H20和二甘醇(DEG)溶液的加入量比为:0.5:1:10 mmol/ mmol/mL,氧化石墨烯(GO)与二甘醇(DEG)的用量比为5:10 mg/mL ;并在90 °C下搅拌30 min ;然后逐滴加入含0.8 M NaAc的DEG溶液，其中含有氧化石墨烯(GO)的二甘醇(DEG)溶液与含NaAc的二甘醇(DEG)的体积比为1:1 ;搅拌10 min后，将混合液转移到反应釜中，200°C下加热6 h;最后将产品冷却到室温，用乙醇洗涤数次后置于50°C真空烘箱中烘干。
[0008](2)H202浓度与反应体系吸光度的对应关系:首先将965 u L含有0.5 mg TMB的醋酸缓冲溶液(ABS，0.2 M, pH 4.0)分别和 10 y L 不同浓度(0、0.01、0.02、0.1、0.2、1、10、20、40 mM)的H2O2混合均匀；然后分别加入25 y L 2 mg ? ml/1的Fe304/rG0，混合均匀后在室温下温育15 min。最后，通过外加磁场(磁铁)去除反应体系中的Fe304/rG0，拍照观察颜色变化，并在652 nm波长下分别测量并记录含不同浓度H2O2反应溶液的吸光度，绘制标准曲线。
[0009](3)乙酰胆碱的酶催化反应:将200 ii L含有0.5单位的乙酰胆碱酯酶(AchE)和
0.5单位的胆碱氧化酶(ChOx)的磷酸缓冲溶液(PBS，10 mM, pH 7.4)分别与不同量(O、5X 10_5、10_4、5X 10_4、10_3、10_2、10_1、1、10 iimol)的乙酰胆碱混合均匀，于 37°C下温育反应30 min。
[0010](4)乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系:800 i! L含0.5 mg TMB和50 u g Fe3O4/rGO的ABS，分别加入到步骤(3)温育后的溶液中混合均匀，在室温下温育30 min。然后，通过外加磁场(磁铁)去除反应体系中的Fe304/rG0，拍照观察颜色变化，并在652 nm波长下测量反应溶液的吸光度。最后，建立乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系并绘制标准曲线。
[0011]所述的含GO的DEG溶液是在连续超声2 h条件下制备的均一溶液。
[0012]所述的Fe304/rG0磁性纳米颗粒平均粒径为10 nm。
[0013]所述的建立H2O2浓度与吸光度的对应关系是指H2O2在复合材料的催化下氧化底物TMB产生蓝色，其特征吸收波长在652 nm,在该波长下测量吸光度，获得不同浓度的H2O2与吸光度之间的关系，通过数据处理绘制标准曲线。
[0014]所述的PBS(10 mM,pH 7.4)及37°C温育30 min是模拟人体条件下的pH值(7.4)和体温(37° C)，使乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶达到最佳活性并且使催化反应达到平衡状态。
[0015]所述的乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系的建立及标准曲线绘制是指已知浓度的乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶和胆碱`氧化酶催化下产生胆碱，胆碱又在胆碱氧化酶的催化下产生的H2O2,利用复合材料催化H2O2氧化TMB产生蓝色，在其特征吸收波长652 nm处测量吸光度，获得不同浓度的乙酰胆碱与吸光度之间的关系并绘制标准曲线。
[0016]有益效果:本发明利用一步水热法合成了 Fe304/rG0，结合酶催化和比色检测的策略，建立了一种乙酰胆碱的比色检测方法，其特色和优点表述如下:
(I)在Fe304/rG0的制备中采用二缩乙二醇作为溶剂，获得的Fe3O4粒径极小且均匀分布在rGO表面。
[0017](2)将石墨烯与FeA/rGO复合，Fe3O4纳米颗粒的分散性得到很大提升，催化效果显著增强，H2O2的响应浓度低至0.1 u Mo
[0018](3)该方法使用了显色更灵敏且无致癌性的显色底物TMB，使用的Fe304/rG0纳米复合材料具有磁性，能够通过物理方法很简便地分离回收利用，符合绿色化学理念。
[0019](4)该方法利用乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶双酶体系催化分解乙酰胆碱产生H2O2与H2O2比色检测相结合，实现了对乙酰胆碱的比色检测。
[0020](5)通过两步法既保证了乙酰胆碱酯酶的活性，又通过对H2O2的检测实现了对乙酰胆碱的灵敏检测。
[0021 ] (6)与传统检测方法相比，所构建的乙酰胆碱的比色法检测方法具有操作更简便灵活，仪器设备更简单，检测成本低廉等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1 为 Fe3O4 (A)和 Fe304/rG0 (B)的 TEM 图;图2为H2O2浓度与吸光度的对应关系(内嵌图为标准曲线)；
图3为乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系(内嵌图为标准曲线)。
【具体实施方式】
[0023]实施例一:Fe304/rG0的制备及对H2O2的比色检测
(I) Fe304/rG0 的制备:首先将 0.5 mmol FeCl2.4H20 和 I mmol FeCl3 ? 6H20 加入到 10mL含有5 mg GO的DEG溶液中，并在90 ° C下搅拌30 min ;然后逐滴加入含0.8 M NaAc的DEG溶液10 mL，搅拌10 min后，将混合液转移到反应釜中，200 °C下加热6 h ;最后将产品冷却到室温，用乙醇洗涤数次后置于50°C真空烘箱中烘干，得到Fe3O4MX)如图1所示。
[0024](2)H202浓度与吸光度的响应关系:首先将965 y L含有0.5 mg TMB的ABS分别和10 ii L不同浓度(0、0.01、0.02、0.1、0.2、1、10、20、40 mM)的H2O2混合均匀；然后分别加A 25 u L 2 mg ? ml/1的Fe304/rG0,混合均匀后在室温下温育15 min。最后,通过外加磁场(磁铁)去除反应体系中的Fe304/rG0，拍照观察颜色变化，并在652 nm波长下分别测量并记录不同浓度反应溶液的吸光度，绘制标准曲线如图2所示。
[0025]实施例二:乙酰胆碱的检测及标准曲线绘制
(I)乙酰胆碱的酶催化反应:将200 u L含有0.5单位的乙酰胆碱酯酶(AchE)和0.5单位的胆碱氧化酶(ChOx)的PBS分别与不同量(o、5x1-5Uo-4Jxio-4Uo-3Uo-2Uo'
1、10 Ii mol)的乙酰胆碱混合均匀,在37°C下,温育反应30 min。
[0026](2)乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系:800 ii L含0.5 mg TMB和50 U g Fe3O4/rGO的ABS，分别加入到步骤(3)温育后的溶液中，混合均匀，在室温下温育30 min。然后，通过外加磁场(磁铁)去除反应体系中的Fe304/rG0，拍照观察颜色变化，并在652 nm波长下测量反应溶液的吸光度。最后，建立乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系，并绘制标准曲线如图3所示。
【权利要求】
1.基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，按照下述步骤进行:首先，以氧化石墨烯、FeCl2 ? 4H20和FeCl3 ? 6H20为前驱体，采用用二甘醇溶剂热法合成了具有更好分散性的Fe304/rG0，进一步探究Fe304/rG0催化的显色反应与H2O2浓度的对应关系；然后，在乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶的双酶体系催化下，乙酰胆碱分解产生H2O2 ;最后，在酶催化反应后的溶液中直接加入Fe304/rG0，催化乙酰胆碱分解的H2O2氧化TMB产生显色反应，建立乙酰胆碱浓度和溶液颜色吸光度的线性关系，实现乙酰胆碱的比色检测。
2.根据权利要求1所述的基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，具体制备步骤如下: (1)Fe304/rG0的制备:首先将FeCl2? 4H20和FeCl3 ? 6H20加入到含有氧化石墨烯的二甘醇溶液中，其中FeCl2 ? 4H20、FeCl3 ? 6H20和二甘醇溶液的加入量比为:0.5:1:10 mmol/mmol/mL,氧化石墨烯与二甘醇的用量比为5:10 mg/mL;并在90 °C下搅拌30 min ;然后逐滴加入含0.8 M NaAc的二甘醇溶液，其中含有氧化石墨烯的二甘醇溶液与含NaAc的二甘醇的体积比为1:1 ;搅拌10 min后，将混合液转移到反应釜中，200°C下加热6 h ;最后将产品冷却到室温，用乙醇洗涤数次后置于50°C真空烘箱中烘干； (2)H202浓度与反应体系吸光度的对应关系:首先将965ii L含有0.5 mg TMB的醋酸缓冲溶液 ABS, 0.2 M, pH 4.0，分别和 10 y L 不同浓度 0、0.01、0.02、0.1、0.2、1、10、20、40mM的H2O2混合均匀；然后分别加入25 U L 2 mg ? ml/1的Fe304/rG0,混合均匀后在室温下温育15 min ;最后，通过外加磁场(磁铁)去除反应体系中的Fe304/rG0，拍照观察颜色变化，并在652 nm波长下分别测量并记录含不同浓度H2O2反应溶液的吸光度，绘制标准曲线； (3)乙酰胆碱的酶催化反应:将200L含有0.5单位的乙酰胆碱酯酶和0.5单位的胆碱氧化酶的磷酸缓冲溶液PBS，10 mM, pH 7.4分别与不同量0、5Xl(r5、l(T4、5Xl(r4、103UO 2UO 1UUO ymol的乙酰胆碱混合均匀，于37°C下温育反应30 min ； (4)乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系:800ii L含0.5 mg TMB和50 u g Fe304/rG0的ABS，分别加入到步骤(3)温育后的溶液中混合均匀，在室温下温育30 min ;然后，通过外加磁场(磁铁)去除反应体系中的Fe304/rG0，拍照观察颜色变化，并在652 nm波长下测量反应溶液的吸光度；最后，建立乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系并绘制标准曲线。
3.根据权利要求2所述的基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，其特征在于:步骤(1)中含GO的DEG溶液是在连续超声2 h条件下制备的均一溶液。
4.根据权利要求2所述的基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，其特征在于:所述的Fe304/rG0磁性纳米颗粒平均粒径为10 nm。
5.根据权利要求2所述的基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，其特征在于:所述的建立H2O2浓度与吸光度的对应关系是指H2O2在复合材料的催化下氧化底物TMB产生蓝色，其特征吸收波长在652 nm,在该波长下测量吸光度，获得不同浓度的H2O2与吸光度之间的关系，通过数据处理绘制标准曲线。
6.根据权利要求2所述的基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，其特征在于:步骤(3)所述的PBS 10 mM, pH 7.4及37°C温育30 min是模拟人体条件下的pH值7.4和体温37° C，使乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶达到最佳活性并且使催化反应达到平衡状态。
7.根据权利要求2所述的基于磁性石墨烯仿酶性质的乙酰胆碱可视化检测方法，其特征在于:所述的乙酰胆碱浓度与吸光度的对应关系的建立及标准曲线绘制是指已知浓度的乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶催化下产生胆碱，胆碱又在胆碱氧化酶的催化下产生的H2O2，利用复合材料催化H2O2氧化TMB产生蓝色，在其特征吸收波长652 nm处测量吸光度，获得不同浓度的乙酰胆碱与`吸光度之间的关系并绘制标准曲线。
【文档编号】G01N21/78GK103712983SQ201310718874
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】王坤, 杨兴旺, 钱静 申请人:江苏大学