本发明涉及微生物检测领域，具体是一种禽流感血凝抑制试验检测方法。
背景技术：
禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，可以感染人类，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。禽流感病毒属于正粘病毒科甲型流感病毒属。血凝(直接血凝)反应是利用病毒或病毒的血凝素能选择性凝集动物红细胞及病毒浓度与红细胞凝集程度呈正相关的特性，采集敏感的动物红细胞配制成1％红细胞悬液与待测血清及病毒液在微量血凝板上进行红细胞凝集实验，根据红细胞的凝集程度间接测定病毒中的病毒浓度。禽流感血凝抑制试验是进行抗体检测的重要手段，可以对鸡群的抗体水平和均匀度进行监测，及时制定补免计划。由于禽流感血凝抑制试验需要采集新鲜血液，因此对于其中涉及的试验原料及试剂的量均很小，在试剂量小的前提下能够精确测定是试验成功的关键，国家标准检测方法需要用生理盐水对待测血清进行稀释，过程中需要进行多次孵育，步骤繁琐，耗费时间，多个步骤环环相扣，误差增幅大，精确测定的风险增大。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种禽流感血凝抑制试验检测方法，本发明优化了国标禽流感血凝抑制实验的检测方法，直接用4单位的病毒液稀释血清，可以更快速地对免疫鸡群进行抗体监测。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种禽流感血凝抑制试验检测方法，包括以下步骤：
s1、取v形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μl4单位禽流感病毒抗原液；
s2、在第1孔及第12孔中分别加入50μl被检血清，混合均匀后自第1孔开始吸50μl至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去50μl；
s3、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μl体积分数为1％的鸡红细胞悬液。
优选的是，还包括：s4、将v形微量反应板置于微量振荡器上振荡1min，20-25℃静置孵育20-40min，孵育期间，当第12孔中的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时，判定其余各孔的凝集状况，并得到被检血清的血清效价。
优选的是，步骤s4中的凝集情况包括不凝集、25％凝集、50％凝集、100％凝集，其中，以不凝集时的被检血清的最大稀释度为该被检血清的hi滴度，即血清效价。
优选的是，步骤s2中的4单位禽流感病毒抗原液的制备方法具体为：
a、另取v形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μl生理盐水；
b、在第1孔加入50μl禽流感病毒液，混合均匀后，吸50μl至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，第11孔弃去50μl；
c、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μl体积分数为1％的鸡红细胞悬液；
d、将微量反应板置于微量振荡器上振荡1min，20-25℃静置孵育20-40min，孵育期间，在第1孔至第12孔中出现红细胞呈颗粒性伞状凝集并沉于孔底的性状时，以出现该性状的所有孔所对应的禽流感病毒液的最大稀释度为禽流感病毒液的血凝价，即一个凝集单位，从而计算出4个凝集单位对应的禽流感病毒液的稀释度，根据4个凝集单位对应的禽流感病毒液的稀释度配制4单位禽流感病毒抗原液。
优选的是，步骤s1中、及步骤a中的v形微量反应板均为96孔v形微量反应板。
优选的是，步骤s2中的被检血清使用前置于56℃水浴中恒温灭活30min。
优选的是，步骤s3中鸡红细胞悬液通过以下方法获得：首先采集5只spf成年公鸡的血液各0.5ml，并加入1ml抗凝剂混合均匀后，吸取2ml置于圆底离心管中，加入15ml质量分数为0.9％的生理盐水进行一次离心，其时间为12min、转速为1000r/min，弃去上清液，再加入15ml所述生理盐水进行二次离心，其时间为8min、转速为1500r/min，弃去上清液，再加入15ml所述生理盐水进行三次离心，其时间为5min、转速为1800r/min，弃去上清液，然后，加入8ml的pbs缓冲溶液离心后弃去上清液，反复进行三次，每次离心的时间为2min，转速为500r/min，最后，吸取圆底离心管底部的红细胞1ml，加入到99ml的pbs缓冲溶液中，轻微震荡摇匀，得到体积分数为1％的鸡红细胞悬液，其中，所用的pbs缓冲溶液的ph为7.0。
优选的是，步骤s1和步骤a中所用的96孔v形微量反应板在使用前均经过如下处理：将微量反应板先置于质量分数为1％的稀盐酸中浸泡12h，取出经蒸馏水冲洗后，再依次置于质量分数为50％的乙醇中浸泡6h、蒸馏水中浸泡1h，取出后置于超声波清洗机中超声清洗，同时用紫外灯进行间歇性照射，最后烘干即可，其中，超声波频率为25～30khz，时间为30min，紫外灯的波长为260nm，间歇性照射具体是照射时间为210s与停止照射时间为90s交替进行。
优选的是，所述抗凝剂为柠檬酸钠与肝素以质量比为1:2混合而成。
优选的是，烘干时的温度为110℃。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过测定被检血清的效价的高低，可以监测被检血清中的抗体水平，对鸡群的抗体水平和均匀度进行监测，及时制定补免计划，确保养殖生产的顺利进行。本发明的检测方法高效、快捷、准确度高，减少孵育次数，节约时间、材料和人力成本，适合企业对大规模鸡群的监测。
本发明通过多次不同的离心得到的鸡红细胞悬液的红细胞纯度更纯、无自拧现象，用于血凝抑制试验检测时不干扰被检血清中的抗体，与禽流感病毒抗原液反应灵敏，现象清晰，同时本发明对v形微量反应板进行彻底清洗，尤其在用超声波处理的同时用紫外灯间歇照射，超声波清洗机的震动使其内部的水跟随震动，紫外灯照射水后发生折射，使紫外线从多个方向射到v形微量反应板上，并射入v形微量反应板的微小的孔中，彻底杀菌，确保v形微量反应板的清洁无菌，避免因v形微量反应板携带杂质而影响血凝抑制试验的结果，导致监测有误，影响养殖生产。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
首先，配制4单位禽流感病毒抗原液，具体方法为：
a、取v形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μl生理盐水；
b、在第1孔加入50μl禽流感病毒液，混合均匀后，吸50μl至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，第11孔弃去50μl；
c、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μl体积分数为1％的鸡红细胞悬液，并将第12孔设为红细胞对照。
d、将微量反应板置于微量振荡器上振荡1min，20-25℃静置孵育20-40min，孵育期间，在第1孔至第12孔中出现红细胞呈颗粒性伞状凝集并沉于孔底的性状时，以出现该性状的所有孔所对应的禽流感病毒液的最大稀释度为禽流感病毒液的血凝价，即一个凝集单位，从而计算出4个凝集单位对应的禽流感病毒液的稀释度，根据4个凝集单位对应的禽流感病毒液的稀释度配制4单位禽流感病毒抗原液。
所用的v形微量反应板为96孔v形微量反应板。
在找出血凝价时，根据各个孔呈现的现象对凝集的状况进行分类，包括：不凝集、25％凝集、50％凝集、100％凝集。只要出现红细胞呈颗粒性伞状凝集并沉于孔底时均视为凝集，红细胞沉于孔底呈点状为不凝集。凝集的程度通过以下方法判断：将v形微量反应板倾斜45度角后观察红细胞在孔内沿孔壁形成的红色线的长短，不凝集时，形成一条红色线，且不凝集时形成的红色线最长，并以该红色线的长度l为标准，依次读取其余各孔红色线的长度，判断凝集程度。当孔内的红色线的长度是3/4l时，为25％凝集，当孔内的红色线的长度是1/2l时，为50％凝集，当孔内的红色线的长度是1/4l时，为75％凝集，当孔内没有红色线时，为100％凝集。如下表1示出整个试验的结果。
表1.血凝试验(ha)术式表
其中：-表示不凝集；+表示25％凝集，++表示50％凝集，+++表示75％凝集，#表示100％凝集，表中病毒稀释度就是禽流感病毒液的稀释度，病毒就是禽流感病毒液，1％红细胞就是1％鸡红细胞悬液。
从表1得出，第1孔到第7孔均为100％凝集，这七个孔对应七个禽流感病毒液的稀释度，其中，第7孔对应的禽流感病毒液的稀释度最大，故第7孔对应的禽流感病毒液的稀释度为禽流感病毒液的血凝价，即本发明中所用的禽流感病毒液的血凝价为1:128，即1:128为一个凝集单位，则将初始的禽流感病毒液稀释32倍为4个凝集单位，得到4单位禽流感病毒抗原液。
然后，进行禽流感血凝抑制试验的检测，包括以下步骤：
s1、另取v形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μl4单位禽流感病毒抗原液；
s2、在第1孔及第12孔中分别加入50μl被检血清，混合均匀后自第1孔开始吸50μl至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去50μl；并将第11孔设为病毒对照，第12孔设为红细胞对照；
s3、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μl体积分数为1％的鸡红细胞悬液。
s4、将v形微量反应板置于微量振荡器上振荡1min，20-25℃静置孵育20-40min，孵育期间，当第12孔中的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时，判定其余各孔的凝集状况，并得到被检血清的血清效价。
所用的v形微量反应板为96孔v形微量反应板。
步骤s4中的凝集情况包括不凝集、25％凝集、50％凝集、100％凝集，其中，以不凝集时的被检血清的最大稀释度为该被检血清的hi滴度，即血清效价。第12孔中的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时为不凝集，不凝集时，形成一条红色线，且不凝集时形成的红色线最长，并以该红色线的长度l为标准，依次读取其余各孔红色线的长度，判断凝集程度。当孔内的红色线的长度是3/4l时，为25％凝集，当孔内的红色线的长度是1/2l时，为50％凝集，当孔内的红色线的长度是1/4l时，为75％凝集，当孔内没有红色线时，为100％凝集。如下表2示出整个试验的结果。
表2血凝抑制试验(hi)术式表
其中，-表示不凝集；+表示25％凝集，++表示50％凝集，#表示100％凝集，血清稀释度就是被检血清的稀释度，病毒液就是4单位禽流感病毒抗原液，1％红细胞就是1％鸡红细胞悬液。
从表2看出，第1孔到第6孔均为不凝集，这六个孔对应六个被检血清的稀释度，其中，第6孔对应的被检血清的稀释度最大，故第6孔对应的被检血清的稀释度为被检血清的hi效价，即本发明中所用的被检血清的hi效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，得被检血清的效价为6。通过测定被检血清的效价的高低，可以监测被检血清中的抗体水平，对鸡群的抗体水平和均匀度进行监测，及时制定补免计划，确保养殖生产的顺利进行。
本实施例中所用的鸡红细胞悬液的制备以及对v形微量反应板的清洗处理均根据国标检测方法进行。
<实施例2>
首先，配制4单位禽流感病毒抗原液，具体方法同实施例1。为节省时间，沿用实施例1得到的4单位禽流感病毒抗原液，即将初始的禽流感病毒液稀释32倍。
然后，进行禽流感血凝抑制试验的检测，包括以下步骤：
s1、另取v形微量反应板，顺序编号第1孔至第12孔，用微量移液器从第1孔至第11孔依次向各孔加入50μl4单位禽流感病毒抗原液；
s2、将被检血清置于56℃水浴中恒温灭活30min，在第1孔及第12孔中分别加入50μl被检血清，混合均匀后自第1孔开始吸50μl至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔弃去50μl；并将第11孔设为病毒对照，第12孔设为红细胞对照；
s3、从第12孔至第1孔依次向各孔加入50μl体积分数为1％的鸡红细胞悬液，其中，鸡红细胞悬液通过以下方法获得：首先采集5只spf成年公鸡只(spf成年公鸡是指无特定病原菌的鸡)的血液各0.5ml，并加入1ml抗凝剂混合均匀后，吸取2ml置于圆底离心管中，加入15ml质量分数为0.9％的生理盐水进行一次离心，其时间为12min、转速为1000r/min，弃去上清液，再加入15ml所述生理盐水进行二次离心，其时间为8min、转速为1500r/min，弃去上清液，再加入15ml所述生理盐水进行三次离心，其时间为5min、转速为1800r/min，弃去上清液，然后，加入8ml的pbs缓冲溶液离心后弃去上清液，反复进行三次，每次离心的时间为2min，转速为500r/min，最后，吸取圆底离心管底部的红细胞1ml，加入到99ml的pbs缓冲溶液中，轻微震荡摇匀，得到体积分数为1％的鸡红细胞悬液，其中，所用的pbs缓冲溶液的ph为7.0，抗凝剂为柠檬酸钠与肝素以质量比为1:2混合而成。
s4、将v形微量反应板置于微量振荡器上振荡1min，20-25℃静置孵育20-40min，孵育期间，当第12孔中的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时，判定其余各孔的凝集状况，并得到被检血清的血清效价。
所用的v形微量反应板为96孔v形微量反应板，在使用前均经过如下处理：将微量反应板先置于质量分数为1％的稀盐酸中浸泡12h，取出经蒸馏水冲洗后，再依次置于质量分数为50％的乙醇中浸泡6h、蒸馏水中浸泡1h，取出后置于超声波清洗机中超声清洗，同时用紫外灯进行间歇性照射，最后110℃烘干即可，其中，超声波频率为25～30khz，时间为30min，紫外灯的波长为260nm，间歇性照射具体是照射时间为210s与停止照射时间为90s交替进行。
步骤s4中的凝集情况包括不凝集、25％凝集、50％凝集、100％凝集，其中，以不凝集时的被检血清的最大稀释度为该被检血清的hi滴度，即血清效价。第12孔中的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时为不凝集，不凝集时，形成一条红色线，且不凝集时形成的红色线最长，并以该红色线的长度l为标准，依次读取其余各孔红色线的长度，判断凝集程度。当孔内的红色线的长度是3/4l时，为25％凝集，当孔内的红色线的长度是1/2l时，为50％凝集，当孔内的红色线的长度是1/4l时，为75％凝集，当孔内没有红色线时，为100％凝集。如下表3示出整个试验的结果。
表3血凝抑制试验(hi)术式表
其中，-表示不凝集；+表示25％凝集，++表示50％凝集，#表示100％凝集，血清稀释度就是被检血清的稀释度，病毒液就是4单位禽流感病毒抗原液，1％红细胞就是1％鸡红细胞悬液。
从表3看出，第1孔到第7孔均为不凝集，这七个孔对应七个被检血清的稀释度，其中，第7孔对应的被检血清的稀释度最大，故第7孔对应的被检血清的稀释度为被检血清的hi效价，即本发明中所用的被检血清的hi效价为1:128，用以2为底的负对数(-log2)表示，得被检血清的效价为7。通过测定被检血清的效价的高低，可以监测被检血清中的抗体水平，对鸡群的抗体水平和均匀度进行监测，及时制定补免计划，确保养殖生产的顺利进行。此外，通过实施例2中的制备方法得到的鸡红细胞悬液其红细胞的纯度更纯、无自凝现象，用于血凝抑制试验检测时不干扰被检血清中的抗体，与禽流感病毒抗原液反应灵敏，现象清晰，同时对v形微量反应板进行彻底清洗，尤其在用超声波处理的同时用紫外灯间歇照射，超声波清洗机的震动使其内部的水跟随震动，紫外灯照射水后发生折射，使紫外线从多个方向射到v形微量反应板上，并射入v形微量反应板的微小的孔中，彻底杀菌，确保v形微量反应板的清洁无菌，避免因v形微量反应板携带杂质而影响血凝抑制试验的结果，导致监测有误，影响养殖生产。
血清效价在一定范围内越高越好，该一定范围是养殖企业根据鸡群的免疫的时间和次数，血清效价整体离散分布区域等因素确定的范围。本发明的所有实施例中，血清效价达到6、7时为较佳水平，血清效价达到5及5以下为较差水平。
对比例：与实施例2的各个步骤相同，但其制备鸡红细胞悬液时用质量分数为0.9％的生理盐水离心时，只在转速1500r/min的条件下离心10min，并且，对v形微量反应板只进行了稀盐酸浸泡12h、蒸馏水冲洗。最终进行血凝抑制试验测定后的结果是第1孔到第5孔均为不凝集，第5孔对应的被检血清的稀释度最大，故第5孔对应的被检血清的hi效价为1:32，用以2为底的负对数(-log2)表示，得被检血清的效价为5。鸡群的抗体水平较低，需采取相关措施，避免鸡群感染禽流感病毒。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。