本发明涉及了一种重楼解毒酊制剂中重楼皂苷i、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷ⅲ及重楼皂苷ⅳ四种有效成分的含量测定方法，属于中药质量检测技术领域。
背景技术：
重楼解毒酊制剂处方由重楼、生草乌、艾叶、石菖蒲、大蒜、艾片六味中药材组成，具有清热解毒，散淤止痛。用于肝经火毒所致的带状疱疹，皮肤瘙痒，虫咬皮炎，流行性腮腺炎。经临床应用并证明，本品治疗效果明显，具有抑菌、抗病毒感染，清热解毒，消肿散瘀，疏经止痛之功效。目前已有的剂型为酊剂。
本制剂由重楼、生草乌、艾叶、石菖蒲、大蒜、艾片六味药材组成，在现行质量标准中鉴别项和含量测定项仅控制重楼、石菖蒲药材的鉴别及艾片的含量测定，质量控制体系单一，重楼为方中君药，处方中含量高。现代药理学表明，重楼中重楼皂苷i、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷ⅲ及重楼皂苷ⅳ具有抗肿瘤、抗感染、止血、抗血管生成、抗骨质疏松、抗氧化等药理作用。因此在现有质量标准的基础上，增加多指标有效成分的含量测定，有利于该制剂的质量及临床应用的稳定性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种重楼解毒酊制剂中重楼皂苷i、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷ⅲ及重楼皂苷ⅳ四种有效成分的含量测定方法，以期能够对制剂中重楼皂苷i、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷ⅲ及重楼皂苷ⅳ的含量进行快速、准确、高重现率、高回收率的测定。
本发明完成前未发现对该制剂进行重楼皂苷i、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷ⅲ及重楼皂苷ⅳ四种成分同时测定的报道。本发明所述的重楼解毒酊制剂：重楼、生草乌、艾叶、石菖蒲、大蒜、艾片六味药材，大蒜去皮，捣碎成泥，重楼、生草乌、石菖蒲、艾叶粉碎成最粗粉（过10目筛），加二倍量稀乙醇，浸渍10天，去上清液，药渣滤过，滤液和上清液合并，加入艾片，搅拌使溶解，加水和乙醇调整至1000ml,并使含醇量达45%～55%，搅匀，静置3天，滤过，即得。已获得专利2013101172316《重楼解毒酊及其制备方法》。
本发明采用如下的技术方案：
一种重楼解毒酊制剂中四种有效成分的含量测定方法，以重楼皂苷i、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷ⅲ及重楼皂苷ⅳ为对照，以乙腈（a）-水(b)/梯度洗脱0～30min30%～60%a；30～40min40%a；40～80min40%～80%a为流动相的高效液相色谱法。对制剂中重楼皂苷i、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷ⅲ及重楼皂苷ⅳ的含量测定按照如下步骤进行：
（1）色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷合硅胶为填充剂；以乙腈（a）-水(b)/梯度洗脱0～30min30%～60%a；30～40min40%a；40～80min40%～80%a为流动相；柱温20～30℃；检测波长为200～275nm；流速为0.8～1.2ml/min；理论塔板数以重楼皂苷i计不得少于4000。
(2)对照品溶液的制备：取重楼皂苷i、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷ⅲ及重楼皂苷ⅳ对照品适量，加甲醇制成浓度分别含重楼皂苷i0.64mg/ml、重楼皂苷ⅱ0.46mg/ml、重楼皂苷ⅲ0.26mg/ml、重楼皂苷ⅳ0.23mg/ml的溶液，按1:1:1:1混合，摇匀，临用前用0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
(3)供试品溶液的制备：取装量差异下的重楼解毒酊制剂5ml，蒸至无醇味，精密加入甲醇5ml，称定重量，超声或加热回流30～60min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，滤过，回收溶剂至干，用甲醇溶解残渣，定容于5ml量瓶中，滤过，取续滤液，即得。
(4)测定法：分别精密吸取对照品与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
本发明所述的重楼解毒酊制剂中重楼皂苷i含量不得少于0.15%，重楼皂苷ⅱ含量不得少于0.45%，重楼皂苷ⅲ含量不得少于0.2%，重楼皂苷ⅳ含量不得少于0.2%。
具体实施方式
实施例
1仪器与试药
1.1仪器：agilent1200高效液相色谱仪
1.2试药：重楼皂苷i、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷ⅲ及重楼皂苷ⅳ对照品，均由中国药品生物制品检定研究院提供，乙腈为色谱纯，重楼解毒酊由贵州圣济堂制药有限公司提供。
2方法与结果
2.1色谱条件phenomenexc18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）,乙腈（a）-水(b)/梯度洗脱0～15min30%a；15～40min40%a；40～70min50%a为流动相，检测波长为203nm；流速为1.0ml.min-1；柱温为25℃。在选定的条件下，各色谱峰与样品中其他色谱峰达基线分离，其理论板数（n）均大于4000。
2.2对照品溶液的制备取重楼皂苷i、重楼皂苷ii、重楼皂苷vi及重楼皂苷vii对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含重楼皂苷i、ii、vi、vii分别为0.4127,0.4370,0.4288,0.4497mg的混合溶液，及得。
2.3供试品溶液的制备取装量差异下的重楼解毒酊制剂5ml，蒸至无醇味，精密加入甲醇5ml，称定重量，超声或加热回流30～60min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，滤过，回收溶剂至干，用甲醇溶解残渣，定容于5ml量瓶中，滤过，取续滤液，即得。
2.4线性关系考察精密吸取上述混合对照品溶液，分别进样2,4,6,8,10,12µl，测定各色谱峰峰面积。以对照品进样量（µg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明重楼皂苷i、ii、vi、vii分别在0.8254～4.9164，0.8740～4.9440,0.8576～4.9296,0.8994～5.4720µg范围内线性关系良好。
2.5精密度实验取同一份供试品溶液，连续进样6次，测定并记录重楼皂苷i、ii、vi、vii的峰面积。结果各成分峰面积rsd分别为0.45%，0.28%，0.31%,0.22%，表明仪器的精密度良好。
2.6重复性实验
取同一批重楼解毒酊样品6份，分别按“2.4”项方法制备，进样10µl，测定峰面积，计算含量。结果重楼皂苷i、ii、vi、vii含量rsd分别为1.12%，1.32%,1.17%,1.32%,表明该方法重复性良好。
2.7稳定性实验
取同一重楼解毒酊供试品溶液，分别于0,1,2,4,8,16,24h进样10µl，测定峰面积，计算含量。结果重楼皂苷i、ii、vi、vii的rsd分别为1.32%，1.54%，1.65%，1.96%，表明在24小时内，供试品溶液稳定。
2.8加样回收率实验
取6份同一批号已知含量的重楼解毒酊供试品约3ml,精密称定，分别加入混合对照品溶液1ml(重楼皂苷i2.317mg.ml－1、重楼皂苷ii1.231mg.ml－1、重楼皂苷vi0.435mg.ml－1、重楼皂苷vii1.334mg.ml－1)。按“2.4”项方法制备，进样10µl，测定峰面积，计算回收率，结果表明4种重楼皂苷类成分平均加样回收率分别为99.32%,99.95%,98.12%,99.04%;rsd分别为2.15%，1.32%，1.76%，1.15%，说明该方法准确度良好。
2.9相对校正因子测定及耐用性考察
2.10相对校正因子及相对保留时间测定取“2.3”项的混合对照品溶液，分别进样2,4,6,8,10,12µl，测定峰面积。以重楼皂苷vii为参照物，计算各待测成分重楼皂苷i,ii,vi相对校正因子fi/vii,fii/vii,fvi/vii,相对保留时间ti/vii,tii/vii,tvi/vii。
2.10.1仪器对相对校正因子的影响取“2.3”项的混合对照品溶液，分别进样10µl，比较三种不同型号高效液相色谱仪（agilent1200、waters2695、shimadzulc-20a）相对校正因子的影响。fi/vii,fii/vii,fvi/vii的rsd分别为1.19%，1.25%，1.73%,表明仪器对相对校正因子影响不大。
2.10.2色谱柱对相对校正因子影响取“2.3”项的混合对照品溶液，分别进样10µl，在同一台高效液相色谱仪上（shimadzulc-20a），比较phenomenexluna、agilenteclipse、diamonsil、thermo、kromasil5种型号c18色谱柱（4.6mmx250mm,5µm）。fi/vii,fii/vii,fvi/vii的rsd分别为0.46%，和0.73%，0.78%，说明色谱柱对相对校正因子无显著影响。
2.10.3样品测定取不同批号的重楼解毒酊，用本实验所确定的方法进行样品处理和定量测定，并分别采用标准曲线法计算含量，结果如下：重楼解毒酊中重楼皂苷i、重楼皂苷ⅱ、重楼皂苷ⅲ及重楼皂苷ⅳ的含量分别为0.12%,0.264%,0.109%，0.485%，说明该方法测定结果具有较高可信度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。