本发明涉及生物分离检测技术领域，具体涉及一种蛋白质等电聚焦电泳方法及其配胶装置。
背景技术：
等电聚焦电泳(ief)是两性电解质在电泳场中(常用聚丙烯酰胺凝胶)形成一个ph梯度，由于蛋白质为两性物质，其所带电荷与介质的ph值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当迁移到达其等电点(pi)的ph处，此时，该蛋白质不再带有净的正或负的电荷，电流达到最小，不再移动，形成一个很窄的区带，从而达到检测蛋白质类和肽类供试品等电点的电泳方法。目前，常规的等电聚焦电泳方法存在以下问题：1、ief电泳常出现蛋白扩散、拖尾、烧胶等不良现象，需增加检验次数，耗时长，造成人力财力物力浪费；2、现有的ief配胶装置配胶面积大，灌胶易产生气泡，聚胶不均，胶薄易裂，操作难度大，成功率低，多次配胶造成耗材严重浪费；3、目前ief的配胶装置胶垫仅为0.3mm，配胶操作难度大，难以一次性成功，导致每次检验至少有50％的胶面积被浪费，加上配胶试剂昂贵，由此造成ief检验成本居高不下。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种蛋白质等电聚焦电泳方法及其配胶装置，通过该方法得到的蛋白质电泳条带清晰、分离度好、不扩散不拖尾，有效解决了现有技术电泳时间长、蛋白扩散拖尾等问题，大大提高了配胶成功率。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种蛋白质等电聚焦电泳方法，其包括以下步骤：
a、配胶、灌胶：将30％丙烯酰胺溶液、两性电解质溶液和纯化水混合后，用超声波脱气5～10min；灌胶前加入10％过硫酸铵和temed，混匀后向配胶装置的配胶玻璃灌胶；
b、预电泳：凝胶聚合后清除玻璃板上的残胶，将胶贴在薄玻璃片上，胶与玻璃片之间不能有气泡，将贴有凝胶的薄玻璃片放在温度为8～12℃的冷却板上，当凝胶的温度到达8～12℃时，在凝胶左边放上用负极液润湿的电极条，右边放上用正极液润湿的电极条，将电极对准电极条的中心，正极与负极分别与电泳槽的正、负极连接，盖上安全罩，将正、负极与电源连接，进行预电泳，预电泳电压为100v，预电泳时间为10min；
c、电泳：预电泳结束后，取下电极板，用微量移液器直接加供试品溶液2～3μl，标准品上样量为2～3μl，加供试品后按预电泳步骤操作，电泳电压为900～1000v，电泳时间为40min；当标准品有色条带移至电极条边时，停止电泳；
d、固定：取出凝胶，先将凝胶固定至少20min，然后滴加脱色液脱色20～30min，再滴加染色液染色40～60min，再滴加脱色液脱色直至背景无色后，将凝胶浸泡在保存液中，采用凝胶扫描仪分析等电点，做成干胶永久保存。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤b中的负极液为0.2mol/l氢氧化钠溶液，正极液为0.5mol/l磷酸溶液。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤d中的固定液为三氯醋酸、磺基水杨酸与纯化水的混合溶液，脱色液为乙醇、冰醋酸和纯化水的混合溶液，染色液为考马斯亮蓝g250与脱色液的混合溶液。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤d中的保存液是由甘油和脱色液组成混合溶液。
本发明还提供了一种蛋白质等电聚焦电泳的配胶装置，其包括固定架、配胶支架、配胶玻璃、防漏垫和两个垫片；所述配胶支架包括连接板、第一固定块和第二固定块，所述第一固定块和第二固定块分别设置在所述连接板的左侧和右侧，所述第一固定块和第二固定块在同一侧上分别设置有用于所述配胶玻璃的卡槽；所述配胶玻璃插接在所述卡槽内，所述配胶玻璃包括第一玻璃片和第二玻璃片，所述第一玻璃片与第二玻璃片相互叠合，两个所述垫片设置在所述第一玻璃片与第二玻璃片之间，使得第一玻璃片与第二玻璃片之间形成用于灌胶的间隙；所述固定架上设置有至少一个与所述配胶支架相匹配的卡位，所述配胶支架卡接于所述卡位上；所述卡位上设置有凹槽，所述防漏垫设置在所述凹槽上。
优选地，所述第一玻璃片的长度等于第二玻璃片的长度；所述第一玻璃片的宽度小于所述第二玻璃片的宽度。
进一步优选地，所述第一玻璃片的长度为8～12cm、宽度为4.5～7.5cm；所述第二玻璃片的长度为8～12cm、长度为5～8.5cm。
优选地，所述垫片的厚度为0.1～0.6mm。
优选地，所述垫片由软质材料制成的；所述软质材料选自硅胶、聚氨酯、聚氯乙烯、聚四氯乙烯、聚偏氯乙烯中的一种。
优选地，所述固定架包括底座和基座，所述基座固定设置在所述底座的中间位置上，所述基座的左右两侧分别向外延伸有固定片，所述基座的前后两侧上设置有倾斜凸片；所述卡位设置在底座上且位于所述基座的前侧或后侧上。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明所述的蛋白质等电聚焦电泳方法通过改变现有技术中样品的上样方式，将采用滤纸的上样方式改为由微量移液器直接点样，同时改变了预电泳与电泳的电压和电泳时间，使得得到的蛋白质电泳条带清晰、分离度好、不扩散不拖尾；有效解决了现有技术电泳时间长、蛋白扩散拖尾等问题，大大提高了配胶成功率。
本发明的配胶装置结构简单，操作简易，不仅使得试剂消耗量降低，而且灌胶方便、迅速且不产生气泡，聚胶均匀，大大提高了配胶成功率的同时还降低了检验成本。
附图说明
图1为本发明所述的方法的工艺流程图；
图2为本发明所述的配胶装置的正视图；
图3为本发明所述的配胶装置的左侧视图；
图4为本发明所述的配胶装置的俯视图；
图5为本发明所述的配胶玻璃的结构示意图；
图6为本发明所述的配胶玻璃的剖面示意图；
图7为采用现有技术的配胶装置和检验方法所制得的蛋白质电泳条带图谱；
图8为采用本发明的配胶装置和检验方法所制得的蛋白质电泳条带图谱；
附图标号说明：1、固定架；11、底座；12、基座；13、固定片；14、倾斜凸片；2、配胶支架；21、连接板；22、第一固定块；23、第二固定块；3、配胶玻璃；31、第一玻璃片；32、第二玻璃片；4、防漏垫；5、垫片。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
参照图1，为本发明所述的一种蛋白质等电聚焦电泳方法的工艺流程图，该方法包括以下步骤：
a、配胶、灌胶：将30％丙烯酰胺溶液、两性电解质溶液和纯化水混合后，用超声波脱气5～10min；灌胶前加入10％过硫酸铵和temed(n,n,n’,n’-四甲基乙二胺)，混匀后向配胶装置的配胶玻璃灌胶；
b、预电泳：凝胶聚合后清除玻璃板上的残胶，将凝胶贴在薄玻璃片上，凝胶与玻璃片之间不能有气泡，将贴有凝胶的薄玻璃片放在温度为8～12℃的冷却板上，当凝胶的温度到达8～12℃时，在凝胶左边放上用负极液润湿的电极条，右边放上用正极液润湿的电极条，将电极对准电极条的中心，正极与负极分别与电泳槽的正、负极连接，盖上安全罩，将正、负极与电源连接，进行预电泳，预电泳电压为100v，预电泳时间为10min；
c、电泳：预电泳结束后，取下电极板，用微量移液器直接加供试品溶液2～3μl，标准品上样量为2～3μl，加供试品后按预电泳步骤操作，电泳电压为900～1000v，电泳时间为40min；当标准品有色条带移至电极条边时，停止电泳；
d、固定：取出凝胶，先将凝胶固定至少20min，然后滴加脱色液脱色20～30min，再滴加染色液染色40～60min，再滴加脱色液脱色直至背景无色后，将凝胶浸泡在保存液中，采用凝胶扫描仪分析等电点，做成干胶永久保存。
以上步骤中，负极液为0.2mol/l氢氧化钠溶液，正极液为0.5mol/l磷酸溶液；固定液为三氯醋酸、磺基水杨酸与纯化水的混合溶液，脱色液为乙醇、冰醋酸和纯化水的混合溶液，染色液为考马斯亮蓝g250与脱色液的混合溶液。保存液是由甘油和脱色液组成混合溶液。
如图2～6所示，为本发明所述的一种蛋白质等电聚焦电泳的配胶装置，其包括用于固定架1、配胶支架2、配胶玻璃3、防漏垫4和两个垫片5。
固定架1包括底座11和基座12，基座12固定设置在底座11的中间位置上，基座12的左右两侧分别向外延伸有固定片13，通过设置基座12和固定片13可以使得整个配胶装置更加稳固可靠，有效防止配胶装置左右倾倒从而提高配胶过程的稳定性。基座12的前后两侧上设置有倾斜凸片14，一方面在灌胶时可将整个配胶支架2斜靠在倾斜凸片14的倾斜面上，使得胶溶液迅速灌满配胶玻璃3的间隙且不会产生气泡；另一方面，也可提高固定架1在前后侧的稳定性防止固定架1向前后两侧倾倒。固定架1上设置有至少一个与配胶支架2相匹配的卡位，卡位设置在底座11上且位于基座12的前侧或后侧上，配胶支架2卡接于卡位上。也可在底座11上设置两个卡位，这样使得一个配胶装置可以同时进行两次灌胶。进一步地，卡位上设置有凹槽，防漏垫4设置在凹槽上，该防漏垫4用于堵住配胶玻璃3下方的间隙防止漏胶，从而在一定程度上提高配胶成功率。
配胶玻璃3设置在配胶支架2中。具体地，配胶支架2包括连接板21、第一固定块22和第二固定块23。第一固定块22和第二固定块23均呈“冂”字形，第一固定块22和第二固定块23分别设置在连接板21的左侧和右侧。作为优选，连接板21与第一固定块22和第二固定块23之间可拆卸连接，如图2～图4所示，连接板21与第一固定块22和第二固定块23之间分别通过螺栓实现可拆卸连接，具体地，螺栓分别穿过第一固定块22和第二固定块23并与连接板21螺接，这就要求连接板21具有一定的厚度，优选为0.5～1.0cm。在这种连接方式中，随着螺栓对连接板21的旋紧力的递增，连接板21抵接于配胶玻璃3的作用力越强，也即配胶玻璃3在配胶支架2上越紧固，大大提高了配胶的稳定性。由于连接板21在第一固定块22和第二固定块23内的位置可调，因此这样结构的配胶支架2能够适用于不同厚度的凝胶制作。当然，连接板21与第一固定块22和第二固定块23之间也可以是固定连接，此时连接板21仅起到连接第一固定块22和第二固定块23的作用，为了固定放置配胶玻璃3，第一固定块22和第二固定块23在同一侧上分别设置有用于配胶玻璃3的卡槽，配胶玻璃3插接在卡槽内，因此这种结构的配胶支架2适用于生产固定厚度的凝胶。
具体地，配胶玻璃3包括第一玻璃片31和第二玻璃片32，第一玻璃片31与第二玻璃片32相互叠合，两个垫片5设置在第一玻璃片31与第二玻璃片32之间且位于配胶玻璃3的左右两侧，使得第一玻璃片31与第二玻璃片32之间形成用于灌胶的间隙。进一步地，第一玻璃片31的宽度等于第二玻璃片32的宽度，第一玻璃片31的长度小于第二玻璃片32的长度，使得第一玻璃片31在长度方向上与第二玻璃片32形成落差，便于将凝胶溶液灌入第一玻璃片31与第二玻璃片32之间的间隙内，而且不会产生气泡。优选地，第一玻璃片31的长度为8～12cm、宽度为4.5～7.5cm；第二玻璃片32的长度为8～12cm、宽度为5～8.5cm。垫片5的质地和厚度是决定凝胶的厚薄和灌胶成功率的关键因素，优选地，垫片5的厚度为0.1～0.6mm；垫片5由软质材料制成的；软质材料选自硅胶、聚氨酯、聚氯乙烯、聚四氯乙烯、聚偏氯乙烯中的一种。
实施例：
一、仪器与试剂：
1、所用试剂：以下试剂除特殊说明外均采用分析纯、超纯水(电阻率应不低于18mω.cm)进行配制。
30％丙烯酰胺溶液、两性电解质(ph3-10)溶液(bio-rad公司购买)、10％过硫酸铵溶液、n,n,n’,n’-四甲基乙二胺(temed)；
正极液(0.5mol/l磷酸溶液)：取磷酸3.41ml，加水稀释至100ml混匀即得；
负极液(0.2mol/l氢氧化钠溶液)：称取氢氧化钠0.8g，加水溶解至100ml混匀即得；
固定液：34.5g三氯醋酸，10.4g磺基水杨酸，加水溶解至300ml。
脱色液：500ml95％乙醇与160ml冰醋酸混合，加水稀释至2000ml；
染色液：0.35g考马斯亮蓝g250(r250)，加300ml脱色液，在60～70℃水浴中加热溶解，即得；
保存液：30ml甘油与300ml脱色液混合即得。
供试品溶液：供试品需脱盐处理(如对水透析)，要求蛋白浓度为0.5mg/ml以上，如供试品溶液浓度太低，可采用适当方法浓缩。
2、仪器：等电聚焦仪(平板电泳仪)，厂家:pharmaciabiotech，型号:multiphorⅱ。
3、配胶工具：本发明所提供的配胶装置。
二、本发明的蛋白质等电聚焦电泳检验过程
1、配制凝胶溶液，如下表所示：
2、灌胶：向本发明所提供的配胶装置灌胶，静置15min，使凝胶聚合。
3、电泳：
预电泳：凝胶聚合后清除配胶玻璃3上的残胶，将凝胶贴在薄玻璃片上，凝胶与薄玻璃片之间不能有气泡，将贴有凝胶的薄玻璃片放在温度为8～12℃的冷却板上，当凝胶的温度到达8～12℃时，在凝胶左边放上用负极液润湿的电极条、右边放上用正极液润湿的电极条，将电极对准电极条的中心，正极与负极分别与电泳槽的正、负极连接，盖上安全罩，将正、负极与电源连接，进行预电泳，预电泳电压为100v，预电泳时间为10min；
加供试品后电泳：预电泳结束后，取下电极板，用微量移液器直接加供试品溶液2～3μl，标准品上样量为2～3μl，加供试品后按预电泳步骤操作，电泳电压为900～1000v，电泳时间为40min；当标准品有色条带移至电极条边时，停止电泳，蛋白质电泳条带图谱见图7；
4、固定：取出凝胶，先将凝胶固定至少20min，然后滴加脱色液脱色20～30min，再滴加染色液染色40～60min，再滴加脱色液脱色直至背景无色后，将凝胶浸泡在保存液中，采用凝胶扫描仪分析等电点，做成干胶永久保存。
5、计算结果：用excel软件，根据标准品等电点(pi)对其相应的迁移距离做直线回归，将供试品的迁移距离代入直线回归方程，求出待检供试品的等电点。
三、现有技术的蛋白质等电聚焦电泳检验过程
以现有技术的配胶板作为配胶工具采用常规蛋白质等电聚焦电泳方法进行同样的实验过程，作为比较例，蛋白质电泳条带图谱见图8。
四、结果分析：
如图7和图8所示，通过本发明的方法和配胶装置所制得的蛋白电泳条带清晰、分离度好、不扩散、不拖尾，说明本发明采用微量移液器直接点样的上样方式取得了十分突出的效果，解决了现有技术电泳时间长、蛋白扩散拖尾的问题，实验成功率达到100％。本发明的配胶装置面积小，使试剂消耗量降低了80％的同时，可直接灌胶且灌胶迅速且不产生气泡，聚胶均匀，操作简易，配胶成功率达100％，说明本发明改良后的配胶装置取得了较佳的效果，不但提高了配胶成功率，还大大降低了检验成本。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。