一种测试活化部分凝血活酶时间的装置和方法与流程

本发明涉及一种血液样本测试的装置和方法，特别涉及一种测试活化部分凝血活酶时间(APTT)的装置和方法。

背景技术：

凝血功能检测是一项重要的临床检测项目，对于临床各科疾病诊断具有重要意义。通常测定凝血功能的测定包括4项检查内容，即凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)。其中，活化部分凝血活酶时间(APTT)可用于判断内源性凝血活性状态，是临床上主要的凝血性能测试指标之一。完成包括APTT在内的凝血功能检查一般是术前必查项目，旨在降低术中、术后风险。APTT可用于证实凝血因子VIII、IX、XI的缺陷或是否存在它们相应的抑制物。由于肝素的主要作用途径在于内源性凝血途径，所以APTT常成为监测普通肝素的首选指标。APTT延长常见于凝血因子VIII、IX、XI减低，如甲、乙血友病、血管性假血友病；严重的凝血酶原、凝血因子V、因子X和纤维蛋白原缺乏，如肝脏疾病，阻塞性黄疸，新生儿出血症，肠道灭菌综合征等。APTT缩短常见于高凝状态，如DIC的高凝血期，以及血栓性疾病，如心肌梗塞、不稳定性心绞痛、脑血管病变，糖尿病伴血管病变、肺梗死、深静脉血栓形成、妊高症和肾病综合症等。此外，APTT和其他凝血指标相互佐证，可以作为某些临床疾病的确诊依据。

活化部分凝血活酶时间测定试剂的主要组份为激活剂、磷脂和钙源。在37℃下，激活剂活化因子激活因子XII和XI，以磷脂代替血小板提供凝血的催化表面，在Ca²⁺的参与下，观察血液或血浆凝固时间。具体地，在APTT测试中，将自钙源的添加至纤维蛋白的析出所经历的时间为活化部分凝血活酶时间。

目前APTT测试方法以液体或粉末试剂为主，配套全自动或半自动血凝仪使用，需要对血液进行离心处理，提取血浆，操作繁琐；用血浆测定APTT时，需要对血浆进行一段时间的活化，再向活化的血样加入APTT试剂，分步完成，耗时、费力。而实现快速、简便检测APTT的方法并不多，因此POCT检测APTT具有重要的研究价值。POCT检测APTT，能够为急诊手术患者大大节省时间，有重要的临床意义。

本发明的创新之处在于制备了一种能够实现APTT快速检测的装置，所制备的装置为卡片形式，与小型设备配套使用，即可完成对APTT的临床即时检测。该装置特征在于，无需与大型设备配套使用，大大降低的测试成本；将活化与测试过程结合到同一装置上，操作简单，对操作者的技术水平要求也比较低；所制备的卡片可直接取用，无需复杂处理。因此，本发明制备的检测卡有望应用于POCT领域，尤其是APTT检验的临床实验，具有重要的研究和实践价值。此外，该检测卡制备方法简单、准确度高、易于接受，具有很高的的市场价值。

技术实现要素：

根据活化部分凝血活酶时间(APTT)检测方面的相关研究进展及成果，本发明的创新之处在于提供了具有独特孔道结构，能够有序、分步反应的，基于光学方法的APTT检测装置，解决在APTT检测在POCT领域的技术不足，能够简单快捷的完成对患者APTT检测。

本发明制备的装置可以分为加样区、反应区和加样控制区三部分组成。整体结构主要由基板、双面胶和亲水上盖组成。基板位于装置最底端，起支撑作用，其特定位置附着有相关参与反应的化学试剂。双面胶上具有独特的孔状结构，位于基板和亲水上盖之间。在一些示例中，未经凝血处理的新鲜指尖血或静脉血被滴加到特定区域，在毛细作用、亲水上盖的亲水作用以及加样控制区的调节下，血样依次流经各个反应区，与反应区的试剂发生反应。在反应区上方配有光源和相应检测器，反应区内发生凝血过程中检测器会检测到信号变化，最终，可以通过监控反应区内血样与试剂反应后光学信号的变化，分析计算测定APTT。

具体步骤包括：

(1)50mM HEPES缓冲溶液中制备终浓度为：50ug/mL鞣花酸，100ug/mL磷脂酰丝氨酸，80ug/mL磷脂酰乙醇胺，350ug/mL氯化钠，150ug/mL PEG 6000，20ug/mL硫柳汞，配制溶液，标定pH 7.0，作为反应区1溶液备用；

(2)200ug/mL CaCl2溶液，作为反应区3溶液备用；

(3)将步骤(1)得到的溶液中加入重组凝血因子VIIa，作为反应区2溶液备用；

(4)将具有经设计的特定通道结构的双面胶贴合在基板上；

(5)分别将步骤(1)、(2)和(3)制备的溶液以涂覆或滴加的方式加入在基板的特定区域内，烘干成膜；

(6)在双面胶上层贴合一层亲水上盖，制备得到APTT测试装置。

(7)其中，步骤(1)所选择鞣花酸为激活剂，能起到相同作用的激活剂也应视为被保护内容。

其中，步骤(1)可选用的缓冲溶液可以为HEPES、TES、PBS等，浓度范围20-300mM且pH范围为5.0-8.0。但优选为HEPES缓冲溶液(pH为7.0-7.5，50mM)。能够在所需pH范围内起到缓冲左右的缓冲体系，也应视为被保护内容。

其中，步骤(1)所选择的磷脂为磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺，此外，用所选磷脂能够起到相同作用的磷脂也应视为被保护内容。

其中，步骤(1)所选择的无机盐为氯化钠。此外，能够与其起到相同作用的无机盐也应视为被保护内容。

其中，步骤(1)所选择的聚合物为PEG 6000。此外，能够与其起到相同作用的聚合物例如PEG 4000、PEG 8000等，也应视为被保护内容。

其中，步骤(2)所选择的钙源可以为氯化钙、硝酸钙等易溶性钙盐的至少一种。未列举的其他含有Ca²⁺的相关试剂也应视为被保护内容。

其中，步骤(2)所选择的硫柳汞，其他能够起到相似作用的防腐剂或抑菌剂也应视为被保护内容。

其中，步骤(5)所选择的将试剂加到基板的反应区的方法可以是吸附法、交联法、粘合剂法等中的至少一种；由于吸附法操作简单，本发明选择吸附法，即直接将试剂滴加或涂抹于基板的反应区内，进行烘干。其他将试剂固定在导电基板上的方法也应视为被保护内容。

其中，步骤(5)所选择烘干条件为40-80℃，烘干时间为5-30min，优选为70℃条件下，烘干10min。具体条件因所选原料的不同而有所不同，也应视为被保护内容。

本发明的优势在于：基于光学方法，提供了一种APTT测试装置，能够完成对指尖血和未做抗凝处理新鲜血样的APTT检测；无需大型仪器即可对患者的凝血酶原时间予以检测，操作简单；制备方法简单，便于大规模应用。基于以上优点，该APTT检测装置可应用于POCT领域，在临床检验等方面具有广阔前景。

附图说明

图1为装置整体外观图

图2为装置结构图

图3为测试原理图

具体实施方式

关于本专利的具体实施过程将在以下实施例中详细描述，具体实施过程包括但不限于下述实施例。

实施例1

反应区1包含试剂可以分为激活剂和APTT测定试剂两部分。当血样流经反应区1后，血样与其充分接触并活化。APTT测定试剂中，主要发挥活性作用的是磷脂和激活剂，其中激活剂起到活化血液的作用，而且磷脂的来源、种类对最终测试结果十分重要。具体地，在本实施例中，向10mL 50mM HEPES缓冲溶液中分别加入：0.5mg鞣花酸，1mg磷脂酰丝氨酸，0.8mg磷脂酰乙醇胺，3.5mg氯化钠，1.5mg PEG 6000，0.2mg硫柳汞，充分溶解后，标定pH＝7.0，作为反应区1滴加的试剂。

反应区2可以作为质控区，只有当质控区的测试结果经分析后满足实验要求时，最终检测结果才被认为是真是可信的。具体地，向反应区1试剂中，加入0.2％重组凝血因子VIIa，充分混匀，作为反应区2试剂。

反应区3可以作为测试区，制备200ug/mL CaCl2溶液，作为反应区3溶液。当质控区的测试结果合格后，反应区3的测试结果会被最终反映在外部显示器(附图3所示350部分)。

实施例2

本发明制备的APTT测试装置与APTT检测试剂盒具有很多不同之处，例如二者有效成分与待测血样反应时的存在状态。对于前者，有效成分以固态薄膜形式均匀分散在基板的反应区内；对于后者，参与反应时反应试剂则以液体形式存在。前者试剂为在基板上制备试剂均匀分散的固态薄膜，制备具体实施方法是：将反应区1试剂、反应区2试剂和反应区3试剂，滴加到基板的特定区域内(分别为附图2中所示231、232和233)，并在70℃条件下干燥10min，即得到带有附着试剂的基板。

实施例3

将实施例2制备的附着试剂的基板(230)上，依次贴合双面胶(220)和亲水上盖(210)(如图2所示)。装置图结构示意图如附图1和2所示。加样区的110为加样孔，110上方装有240滤血膜，其作用是将血浆与血细胞进行分离。反应区内112、113和114分别为反应区1、2和3，由于双面胶的支撑作用，反应区1、2和3具有一定体积。最顶端为加样控制区，其中115为停止结，116为气囊。特别注意的是，在210或230层，112和116对应位置上的材料为弹性材料，可以在对应位置人为或者设备自动对该位置进行施按压，在压力的作用下，可以对管道内的液体流动进行调控。

实施例4

图3为与本发明所涉及装置具体原理图。当装置插入检测设备时，设备内部的按钮310和340会迅速下压，其对应位置为112和116。同时，350提示滴加血样，装置使用者在110处迅速滴加血样，设备会在设定时间内迅速释放310，血样在压力的作用下由110流至112，此处设定的时间尽量短，能够完成血样滴加过程即可。在112内，血样与此处的激活剂和APTT试剂充分混合。设备会在设定时间内迅速释放340，经激活的血样在压力的作用下由112流至115，与CaCl2反应，血样发生凝集。光源330和光源检测器340用于捕捉凝集过程中变化，经转换在350处显示最终测试结果。装置360为加热恒温装置，保证整个反应过程均在37℃下完成。

实施例5

材料220的厚度需满足一定条件。当通道过窄时，血样流通可能受阻，在通道内流速过慢甚至阻塞，最终影响测量结果；当通道过宽，同样会有通道内血样流动占用过多时间、所需血样过大等不足。经实验验证材料22厚度为0.09-0.225mm，并以0.15mm为最佳。110、112、114、115、116和117之间的连接是通过22层上具有一定宽度的毛细通道完成的。毛细通道的宽度应为1-5mm，为保证通道体积，应与厚度相对应，并以3mm为最佳。

此外，区域110、112、113、114、116以及连接各个区域的通道体积应合理设计，以为便于血样流动。

实施例6

本发明提供的装置可以用于测定APTT，但不限于此。其他应用本设备测试需要分步完成反应的测试，能够对液体流通需要进行控制的操作，也应视为被保护内容。

例如该装置可用于测定CRP。在112区可滴加经处理的抗人CRP抗体，115处滴加PBS缓冲溶液和相应试剂。滴加血样后在112处反应，在115处根据荧光信号变化检测CRP浓度，114同样可作为质控区。

以上实施例对本发明进行了详尽的描述，旨在让本领域或相关技术人员认识、了解本发明的内容并能够加以实施，但本发明的内容并不限于此。凡以本发明为基础，进行相关的延伸、等效变换或修饰，都应包括在本发明的保护范围内。