用于样本的高压冷冻和X射线晶体衍射的模块化样本保持器的制作方法

本发明涉及用于高压冷冻和x射线晶体衍射的模块化样本保持器，还涉及使用这种模块化样本保持器的用于样本的高压冷冻和x射线晶体衍射的方法。

背景技术：

x射线晶体衍射是一种识别晶体的原子和/或分子结构的方法。样本由x射线辐射束瞄准，x射线辐射束被样本的晶体结构衍射。通过测量衍射束的角度和强度，可以产生晶体内电子密度的三维模型。根据该电子密度，可以确定晶体中原子的平均位置，以及它们的化学键、它们的无序和各种其他信息。用于x射线晶体衍射的x射线辐射可以例如由同步加速器产生。

x射线晶体衍射可以用于确定大生物分子(诸如蛋白质)的结构。为了在x射线晶体衍射期间减少x射线诱导的对蛋白质晶体的辐射损伤，可以在x射线晶体衍射之前通过高压冷冻将样本冷却至低温温度。

高压冷冻(hpf)是一种用于在高压下快速冷冻含水样本或制剂的方法。通过高压冷冻，实现样本的玻璃化(即，没有形成冰晶的冷冻)，在该过程中，水从液态转变为无定形状态而不会引起冰晶成核。因此，可以实现样本的低温固定或低温静止。样本的细胞成分可以固定而不会引入显著的结构变化。

关于蛋白质晶体的高压冷冻的详细描述，参考burkhardt,anja(伯克哈特，安雅)等人的“fasthigh-pressurefreezingofproteincrystalsintheirmotherliquor(在母液中快速高压冷冻蛋白质晶体)”actacrystallographicasectionf:structuralbiologyandcrystallizationcommunications68.pt4(2012):495-500.pmc.web，2016年8月24日。

对于样本的高压冷冻，通常使用第一样本保持器。在冷冻过程之后，样本必须与第一样本保持器分离，并且必须放置在第二样本保持器上以进行x射线晶体衍射。不同样本保持器之间的这种运输是复杂且耗时的过程，并且产生损坏和污染样本的危险。

期望最小化运输工作力度并且降低在高压冷冻和x射线晶体衍射的步骤之间损坏或污染样本的危险。

技术实现要素：

这个目的通过根据独立权利要求的特征的模块化样本保持器以及用于样本的高压冷冻和/或x射线晶体衍射的方法实现。根据从属权利要求以及根据附图的以下描述和实施例，本发明的其他优点和实施例将变得显而易见。根据本发明的模块化样本保持器和根据本发明的方法的优点和实施例以类似的方式由以下内容引起。

根据本发明的模块化样本保持器特别适用于包含生物分子或由生物分子组成的样本，特别是蛋白质晶体，其晶体结构应当在x射线晶体衍射过程中分析。用于x射线晶体衍射的x射线辐射尤其可以通过同步加速器产生。

根据本发明的第一方面，模块化样本保持器包括样本保持元件和延伸元件，它们彼此可连接，反之亦然，彼此可分离。

样本保持元件包括小管和基部元件。小管适于保持样本，特别是在小管的顶部。为此目的，小管可以包括相应的保持元件，例如环。基部元件适于保持小管，特别是在小管的底部，即在小管的不保持样本的端部。小管特别是可以牢固地附接至基部元件或者从基部元件可拆卸。基部元件特别包括用于小管的相应保持元件，其可以例如布置在基部元件的顶部。小管特别是垂直于或基本垂直于基部元件的顶表面布置。

从基部元件的底部到小管顶部的第一距离是d1。该第一距离d1的特别地被确定尺寸以配合在用于样本保持元件的高压冷冻的高压冷冻单元中。因此，样本保持元件经过专门设计和确定尺寸以用于特定类型的高压冷冻单元。为了进行样本的高压冷冻，优选地，可以仅使用样本保持元件而不连接到延伸元件。

然而，样本保持元件本身通常不能用于x射线晶体衍射单元，因为样本保持元件不适合对应的晶体衍射单元。通常，样本保持元件对于这些单元来说太小。因此，为了进行样本的x射线晶体衍射，样本保持元件和延伸元件彼此连接。为此，延伸元件适于连接到基部元件，特别是连接到基部元件的底表面。当延伸元件和基部元件彼此连接时，从延伸元件的底部到小管顶部的第二距离是d2。第二距离d2大于第一距离d1。第二距离d2特别地被确定尺寸以配合在用于进行样本的x射线晶体衍射的x射线晶体衍射单元中。

如此组装的模块化样本保持器可以经过专门设计和确定尺寸以用于特定类型的x射线晶体衍射单元。特别地，延伸元件经过专门设计和确定尺寸，以将样本保持元件(其本身不能用于x射线晶体衍射)改造为可用在对应的x射线晶体衍射单元中的样本保持器。

根据本发明的第二方面，模块化样本保持器包括样本保持元件和筒，它们彼此可连接，反之亦然，彼此可分离。

类似于以上描述，该样本保持元件包括适于保持样本的小管和适于保持小管的基部元件。

筒在其内部包括封装元件。小管和封装元件形成为使得小管可以放置在封装元件内。该封装元件尤其可以构造为筒内的空腔，特别是管状空腔。因此，样本保持元件设计为配合到筒中。

所述封装元件的直径特别是仅略大于小管的直径。在冷冻过程之后，连接的样本保持元件和筒可以储存在储存区域中。为了x射线晶体衍射，样本保持元件与筒分离。

因此，样本保持元件经过专门设计和确定尺寸以完美地配合到筒中。样本保持元件和筒的组合专门设计用于特定类型的高压冷冻单元。为了进行样本的高压冷冻，样本保持元件和筒彼此连接。

本发明使得能够以简单的方式用相同的样本保持器来进行样本的高压冷冻和随后的x射线晶体衍射。与本发明相反，根据现有技术，首先使用第一样本保持器冷冻样本，该第一样本保持器只能用于相应的高压冷冻单元中；然后，样本必须与第一样本保持器分离并且必须放置在第二样本保持器上，该第二样本保持器只能用于相应的x射线晶体衍射单元中。该第二样本保持器可以插入晶体衍射单元，并且可以进行x射线晶体衍射。与此相反，根据本发明，样本不必在不同的样本保持器之间运输，这种运输是复杂且耗时的过程，并且产生损坏或污染样本的危险。

本发明还涉及(第一)系统，其包括根据本发明第一方面的模块化样本保持器和用于进行样本的x射线晶体衍射的x射线晶体衍射单元。本发明还涉及(第二)系统，其包括根据本发明第二方面的模块化样本保持器和用于高压冷冻样本的高压冷冻单元。最后，本发明还涉及一种包括第一系统和第二系统的组合系统。

在根据本发明的方法的过程中，保持样本的样本保持元件与筒连接。连接的筒和样本保持元件放置在相应的高压冷冻单元中。通过高压冷冻单元进行样本的高压冷冻。然后，冷冻的样本可以在晶体衍射过程中立即分析。替代地，冷冻的样本可以储存在有利的低温储存区域中，该区域例如可以用液氮冷却到低温温度。为此目的，连接的样本保持元件和筒可以运输到并储存在相应的储存区域中。从那里，收集样本保持元件并将其运输到晶体衍射单元。

为了进行x射线晶体衍射，冷冻的样本保持元件与筒分离并且与延伸元件连接。连接的样本保持元件和延伸元件形成模块化样本保持器，并且放置在相应的x射线晶体衍射单元中，通过x射线晶体衍射单元进行冷冻样本的x射线晶体衍射。

延伸元件可以直接在冷冻后与样本保持元件连接，并且组合的样本保持元件、筒和延伸元件可以储存在低温储存区域中。替代地，可以储存连接的样本保持元件和筒。替代地，只有样本保持元件可以储存在储存区域中，并且可以在从储存区域收集之后与延伸元件连接。

相应的高压冷冻单元由申请人以商标名leicaemice制造，其取代了以前的名为leicaemhpm的型号。根据本发明特别有利的实施例，从基部元件的底部到小管顶部的距离被确定尺寸，以配合在以leicaemice方式设计的高压冷冻单元中。在该leicaemice装置或类似设计的装置中，液氮有利地用作压力传递介质和冷却剂。该系统中的冷冻循环可以有利地如下进行：

冷冻过程在腔室内进行，样本放置在该腔室内。压力积聚在封闭通风口的下游进行，该通风口位于腔室前方。通过打开该通风口，将氮气注入腔室。该氮气流通过腔室出口处的喷嘴来限制。因此，压力在腔室内积聚。这种氮气流通常不具有低温温度。在压力积聚之后，即在将样本置于压力下之后，进行样本的冷冻。为此目的，具有低温温度的压缩的低温介质(例如液氮)被导入腔室。

通过该装置，可以实现在不到10ms的时间内尤其是高达2000巴的压力升高。在达到2000巴的压力之后，样本能够以通常为5000k/s或更高的冷却速率立即冷却。关于高压冷冻的更详细描述，参见文献de1806741a1，de10015773a1或de10065143a1。

高压冷冻单元leicaemice或以这种方式设计的相应单元包括装载站。为了进行冷冻过程，首先将专门构造的筒放置在该装载站中。然后，将样本保持元件放置在装载站中并插入筒中。通过关闭装载站的盖或盖子，筒和样本保持元件彼此连接，并且自动触发高压冷冻过程。在冷冻过程之后，筒和样本保持元件的组合由leicaemice或相应的单元自动弹出到低温介质(尤其是液氮)的冷却浴中，例如在杜瓦瓶中。

该筒和样本保持元件经过专门设计和确定尺寸，以适用于leicaemice或以这种方式设计的高压冷冻单元，从而实现样本的最佳冷冻。样本保持元件经过专门设计和确定尺寸以完美地配合到筒中。在冷冻过程之后，连接的样本保持元件和筒可以储存在储存区域中。为了x射线晶体衍射，样本保持元件与筒分离。

有利地，从基部元件的底部到小管的顶部的距离在15mm和19mm之间的范围内。在这种情况下，样本保持元件被设计成精确地配合到筒中并配合到leicaemice或类似的装置中。leicaemice允许相应的样本保持元件的最大高度为19mm。

然而，如前所述，样本保持元件本身通常不适用于x射线晶体衍射单元。用于x射线晶体衍射单元的样本保持器通常由各种制造商根据所谓的spine(欧洲结构蛋白质组计划)联盟的标准构造。spine的成立是为了推动针对生物医学相关目标的技术，并在生物医学上重点关注结构蛋白质组学的过程中产生泛欧一体化。有关spine的详细解释，请参阅stuart,d.i.,jones,e.y.,wilson,k.s.&daenke,s.(2006)，actacryst.d62,-2--1。

相应样本保持器的具体特征在2014年4月15日修订的“spinesampleholder&vialspecifications-l-r05(spine样本保持器和药瓶规格l-r05)”文件中给出，该文件可在主页https：//www.embl.fr/spinesampleholder/上找到。

根据该spine标准，相应的样本保持器由帽和销组成。在所述销上安装晶体支撑件，尤其是环。所述帽是销的支撑。样本保持器长度，定义为从帽的基部到晶体(或光束位置)，例如销的顶部，的距离为22mm。通过这个固定的样本保持器长度，spine联盟希望实现x射线晶体衍射单元的不同类型的样本转换器的兼容性。因此，从帽的底部到样本位置的距离总是22mm，其中，在帽的底部处，样本转换器抓住样本保持器或附接至样本保持器，在样本位置处，x射线束必须指向其以进行晶体衍射。

有利地，当延伸元件和基部元件彼此连接时，从延伸元件的底部到小管的顶部的第二距离d2在22mm±1.5mm的范围内。由于样本不一定精确地放置在小管的顶部，因此优选地具有±1.5mm的公差范围。因此，从延伸元件的底部到小管的顶部的距离优选地根据spine标准来确定尺寸。因此，模块化样本保持器可以用于根据spine标准设计的任何类型的x射线晶体衍射单元。优选地，延伸元件的底部的直径基本上或精确地为12mm。该直径也由spine标准设定。

因此，本发明特别提供了一种模块化样本保持器，其可以用于通过leicaemice或通过那样设计的单元的高压冷冻，并且与spine标准兼容并由此可用于通过根据spine标准设计的x射线晶体衍射单元的x射线晶体衍射。

优选地，筒构造为单件。因此，筒尤其是构造为不可分离的固体元件。然而，筒也可以实施为彼此可分离的两个或多个壳。

有利地，筒包括连接手段，以将筒与样本保持元件的基部元件连接。优选地，这些连接手段构造为磁性连接手段。这些磁性连接手段特别是与由金属材料制成的基部元件相互作用，从而在筒和样本保持元件之间建立压紧配合连接。

优选地，小管的至少一部分由聚酰亚胺，尤其是kapton制成。根据特别有利的实施例，小管包括由金属材料制成的销和由聚酰亚胺(尤其是kapton)制成的、适于保持样本的保持元件。蛋白质晶体尤其是溶解在特定溶液中。晶体可以放置在由kapton制成的元件中，特别是在保持元件中，作为该溶液中的样本。基部元件尤其是由钢防腐涂层或铁磁不锈钢(尤其是不锈钢430f或等同物)制成。

有利地，基部元件具有圆柱形或基本上圆柱形的形状，包括侧面区域和垂直于侧面区域的顶部。优选地，基部元件的顶部构造为平面或基本上平面的片材。这种片材尤其可以例如包括孔，小管可以插入孔中。该孔尤其是位于平面片材的中心。顶部可以优选地构造为具有阶梯式外缘的平面或基本上平面的片材，特别是为了将样本保持元件精确地放置在筒内。

基部元件在其内部优选是中空的。基部元件的底部优选地包括开口。特别地，基本上基部元件的整个底部可以形成该开口。在基部元件的中空内部中，可以布置有利的引导手段，用于将小管精确地插入筒的相应管中。特别地，机械引导元件可以附接到这些引导手段。为此目的，机械引导元件尤其是可以通过基部元件的底部中的开口插入样本保持元件中。借助于该机械引导元件，样本保持器尤其是可以插入筒中。

优选地，延伸元件包括适于与基部元件的内部，尤其是与其内表面，相互作用的连接手段，从而建立样本保持元件和延伸元件的连接。在基部元件的内部，可以布置相应的第二连接手段，其可以与延伸元件的连接手段相互作用。延伸元件的连接手段有利地适于通过基部元件的底部中的开口或者由底部形成的开口插入基部元件的内部。

相应的连接手段有利地适于建立样本保持元件和延伸元件的磁性和/或机械连接。延伸元件的连接手段例如可以构造为一个或几个夹紧元件，在样本保持元件和延伸元件之间建立压紧配合连接。在这种情况下，在基部元件的内部不一定存在第二连接手段。通过夹紧手段按压或强压或偏压抵靠基部元件的内壁，可以建立压紧配合连接。也可以通过磁性连接手段建立压紧配合连接，该磁性连接手段可以与基部元件的金属内壁元件相互作用。连接手段尤其是可以建立形状配合连接。为此目的，连接手段和/或第二连接手段可以实施为螺纹。

应当注意，在不脱离本发明的范围的情况下，前面提到的特征和下面要进一步描述的特征不仅可以在各自指示的组合中使用，而且可以在其他组合中使用或单独使用。

附图说明

现在将参考附图通过示例进一步描述本发明，其中：

图1以不同的立体图示意性地示出了根据本发明的具有样本保持元件和延伸元件的模块化样本保持器的优选实施例，

图2以不同的立体图示意性地示出了根据本发明的具有样本保持元件和延伸元件的模块化样本保持器的优选实施例，

图3以不同的立体图示意性地示出了根据本发明的具有样本保持元件、延伸元件和筒的模块化样本保持器的优选实施例，以及

图4以立体图示意性地示出了具有根据本发明的模块化样本保持器的样本保持元件和筒的高压冷冻单元的一部分。

具体实施方式

在图1中，示意性地示出了根据本发明的具有样本保持元件和延伸元件的模块化样本保持器的优选实施例，并且标记为10。模块化样本保持器10在图1a中以立体分解图示出，并且在图1b中以立体图示出为处于复合状态。附图中相同的附图标记表示相同或结构相同的元件。

在图1a中，样本保持器10的两个模块，即样本保持元件100和延伸元件200被示出为彼此分离。

样本保持元件100包括基部元件110和小管120。小管120包括由金属材料制成的销121，在该销121上安装有由聚酰亚胺，优选kapton制成的保持元件122。样本可以放置在该保持元件122中。保持元件122特别地构造为小的kapton管，蛋白质晶体可以放置在其中，作为特定溶液中的样本，它们在该特定溶液中溶解。

例如，保持元件122也可以构造成环。小管120尤其是可以构造为所谓的汉普顿(hampton)销。

基部元件110适于保持小管120，并且具有圆柱形或基本上圆柱形的形状，包括侧面区域111和垂直于侧面区域111的顶部112。基部元件110的内部特别是中空的。引导手段可以设置在侧面区域111的内壁上，以便将样本保持元件100插入筒中，如将参考图3和图4所解释的。

顶部112可以构造成平面或基本上平面的片材，该片材特别是具有阶梯式外缘115。该阶梯式外缘115尤其是设置用于使得样本保持元件100能够在筒内居中定位，如将参考图3所解释的。

在基部元件110的底部处没有片材。因此，基部元件110的底部形成开口。基部元件110，即侧向区域111和顶部112，由金属制成，例如铁磁不锈钢。

基部元件110特别是包括用于小管120的保持元件，其形式为在片材113的中心处的钻孔113，小管120可以插入该钻孔。因此，小管120垂直于或基本上垂直于基部元件的顶部112而布置。

在片材112的中心周围有多个钻孔114，用于在高压冷冻过程中传导液氮。

延伸元件200包括基部201，连接手段202布置在基部201上。这些连接手段202适于将样本保持元件100与延伸元件200连接。

连接手段202可以通过基部元件110的底部中的开口插入基部元件110的中空内部。在该具体示例中，连接手段202被实施为夹紧元件，从而通过按压或强压抵靠基部元件110的内壁而在样本保持元件100和延伸元件200之间建立压紧配合连接。

模块化样本保持器10在图1b中以其复合状态示出，即样本保持元件100和延伸元件200彼此连接。在图1b中，从延伸元件200的底部到小管120的顶部的距离是d2。该距离d2为22mm±1.5mm，因此根据spine标准确定尺寸。具体地，spine标准的22mm的设定距离是指从延伸元件200的底部到样本的距离。因此，如果样本没有精确地放置在保持元件122的边缘处，则距离d2会略大于22mm。

因此，距离d2被确定尺寸以配合在根据spine标准构造的x射线晶体衍射单元中，用于进行样本的x射线晶体衍射。此外，延伸元件200的底部的直径d3基本上或精确地为12mm，因此也根据spine标准确定尺寸。

在其复合状态下，模块化样本保持器10因此满足spine标准的要求。然而，复合的模块化样本保持器10不能用于特定类型的高压冷冻单元，特别是leicaemice或类似设计。

然而，当彼此分离时，样本保持器可以用在leicaemice或以这种方式设计的装置中。该装置允许相应的样本保持元件的最大高度为19mm。因此，从基部元件110的底部到小管120的顶部的距离d1最多为19mm，特别是在15mm和19mm之间的范围内，并且因此确定尺寸以配合在leicaemice形式的高压冷冻单元中。

在图2中，示意性地示出了根据本发明的模块化样本保持器的另一个优选实施例，并且标记为10’，其具有样本保持元件100’和延伸元件200’。

图2a以立体剖视图示出了模块化样本保持器10’，其中样本保持元件100’和延伸元件200’彼此分离。图2b是彼此连接的样本保持元件100’和延伸元件200’的立体剖视图。图2c是类似于图2b的立体图。

类似于图1的模块化样本保持器10，图2的模块化样本保持器10’也包括基部元件110’，其适于保持包括金属销121’和kapton保持元件122’的小管120’。用于小管120’的保持元件113’构造为圆柱体。

基部元件110’具有圆柱形或基本上圆柱形的形状。与图1的基部元件110形成对比的是，该基部元件110’在其内部不是中空的，而是具有侧向区域111’和顶部112’的基本上实心的圆柱体。基部元件110’内的钻孔114’被设置用于在高压冷冻过程中传导液氮。在这种情况下，圆柱形基部元件110’可以具有从底部到顶部表面112’的高度，其范围在例如1mm和3mm之间。

延伸元件200’包括基部201’和连接手段202’。在该示例中，连接手段202被构造为磁性连接手段，以便在样本保持元件100’和延伸元件200’之间建立压紧配合连接。为此目的，提供一个或多个磁体202’，磁体可以与由金属制成的基部元件110’相互作用。

类似于图1b，从基部元件110’的底部到小管120’的顶部的第一距离d1在15mm和19mm之间的范围内，并且因此被确定尺寸以配合在leicaemice形式的高压冷冻单元中。

从延伸元件200’的底部到小管120’的顶部的第二距离是d2，并且在22mm±1.5mm的范围内，因此根据spine标准来确定尺寸。

此外，延伸元件200’的底部的直径d3基本上或精确地为12mm，因此也根据spine标准来确定尺寸。

根据本发明，样本保持元件也与用于高压冷冻的筒可连接，现在将参考图3进行解释。

图3示出了图2的样本保持元件100’和延伸元件200’以及相应的筒300。

图3a以立体剖视图示出了彼此分离的三个模块100’、200’和300。这些模块100’、200’和300在图3b的立体剖视图和在图3c的立体图中示出为彼此连接。

筒300在其内部具有管状空腔形式的封装元件320。该管状空腔320位于筒300的外壳310内。小管120’适于放置在该管状空腔320内。所述管状空腔320的直径特别是仅略大于小管120’的直径。

此外，连接手段330设置在外壳310内，以便将筒300与样本保持元件100’连接。这些连接手段330优选构造为磁性连接手段330，例如，一个或几个磁体。这些磁体330可以与基部元件110’相互作用，以便在筒300和金属基部元件110’之间建立压紧配合连接。

在图4中，以立体图示意性地示出了leicaemice形式的高压冷冻单元的一部分。具体地，示出了leicaemice的装载站400，样本被装载到其中用于高压冷冻。

装载站400包括腔室401，筒300首先通过机械引导元件402(例如，杆)装载到腔室401中。然后，样本保持元件100’通过机械引导元件402定位在腔室中，并且因此插入到筒300中。

为了将样本保持元件100’装载到腔室401中，机械引导元件402在样本保持元件100’的基部元件110’的内部与引导手段连接。机械引导元件402使得样本保持元件100’能够精确地插入筒300中而不会损坏样本。

还可以设置两个不同的机械引导元件；第一个用于将筒装载到腔室401中，第二个用于样本保持器。

当筒300和样本保持元件100’都装载到腔室401中时，带有把手404的盖子404关闭。关闭盖子403会触发样本的高压冷冻。为此目的，筒300和样本保持元件100’彼此连接并且通过导管405运输到leicaemice的内部，在那里进行高压冷冻过程。

在冷冻过程之后，筒300和样本保持元件100’的组合由leicaemice自动地喷射到低温介质(尤其是液氮)的冷却浴中，例如在杜瓦瓶中。

参考标记

10模块化样本保持器

100样本保持元件

110基部元件

111基部元件的侧面区域

112基部元件的顶部、片材

113用于小管120的保持元件、钻孔

114钻孔

120小管

121销

122保持元件

200延伸元件

201基部

202连接手段、夹紧元件

10’模块化样本保持器

100’样本保持元件

110’基部元件

111’基部元件的侧面区域

112’基部元件的顶部、片材

113’用于小管120’的保持元件

114’钻孔

120’小管

121’销

122’保持元件

200’延伸元件

201’基部

202’连接手段、磁体

300筒

310筒的外壳

320封装元件、管状空腔

330连接手段、磁体

400高压冷冻单元的装载站

401腔室

402机械引导元件、杆

403盖子

404把手

405导管