检测个体罹患神经退行性疾病风险的方法与流程

在阿尔茨海默病(alzheimer′sdisease)中，病理变化在临床症状出现前数年开始，从淀粉样蛋白β(aβ)沉积和tau过度磷酸化开始，然后是下游神经变性(batemanrj，xiongc，benzingertl等，clinicalandbiomarkerchangesindominantlyinheritedalzheimer′sdisease.nengljmed2012；367：795-804；villemagnevl，burnhams，bourgeatp等，amyloidβdeposition，neurodegeneration，andcognitivedeclineinsporadicalzheimer′sdisease：aprospectivecohortstudy.thelancetneurology2013；12：357-367)。测试在此有症状前的时段期间(在临床显著的神经元丢失之前)ad的潜在疾病调节治疗非常有意义(sperlingra，jackcr，jr.，aisenps.testingtherighttargetandrightdrugattherightstage.scitranslmed2011；3：111cm133)。

为了促进这一点，需要稳健和灵敏的生物标志物来鉴别有风险的个体，分期疾病和跟踪疾病进展(sperlingra，aisenps，beckettla等，towarddefiningthepreclinicalstagesofalzheimer′sdisease：recommendationsfromthenationalinstituteonaging-alzheimer′sassociationworkgroupsondiagnosticguidelinesforalzheimer′sdisease.alzheimersdement2011；7：280-292)。理想情况下，任何此类生物标志物应该是非侵入性的，廉价的，并且易于获得(工作组的共识报告：“阿尔茨海默病的分子和生化标志物(molecularandbiochemicalmarkersofalzheimer′sdisease)”.theronaldandnancyreaganresearchinstituteofthealzheimer′sassociationandthenationalinstituteonagingworkinggroup.neurobiolaging1998；19：109-116)。

到目前为止，早期ad致病性变化的检测主要依赖于脑脊液(csf)分析或神经成像技术。基于血液的早期ad疾病活动生物标志物将提供更大的便利性和更高的患者可接受性，但是由于多种原因证明比csf测量更具挑战性，包括较低浓度的目标分析物使得可靠的检测和定量更加困难。最近的一项系统评价发现，没有血液生物标志物可用于早期疾病(olssonb，lautnerr，andreassonu等，csfandbloodbiomarkersforthediagnosisofalzheimer′sdisease：asystematicreviewandmeta-analysis.lancetneurol2016；15：673-684)。

当从csf取样时，神经丝轻链(nfl)是有前景的神经变性生物标志物(zetterbergh，skillbackt，mattssonn等，associationofcerebrospinalfluidneurofilamentlightconcentrationwithalzheimerdiseaseprogression.jamaneurol2016；73：60-67)。与神经丝中链(nfm)和重链(nfh)一起，nfl形成轴突结构完整性的重要部分(leemk，xuz，wongpc，clevelanddw.neurofilamentsareobligateheteropolymersinvivo.jcellbiol1993；122：1337-1350)。

在许多神经病状中发现csfnfl浓度增加，包括ad、多发性硬化症、运动神经元疾病、额颞叶痴呆和非典型帕金森病，并且这被认为反映了轴突变性(zetterbergh.等，见上文；teunissence，dijkstrac，polmanc.biologicalmarkersincsfandbloodforaxonaldegenerationinmultiplesclerosis.lancetneurol2005；4：32-41；tortellir，ruggierim，corteser等，elevatedcerebrospinalfluidneurofilamentlightlevelsinpatientswithamyotrophiclateralsclerosis：apossiblemarkerofdiseaseseverityandprogression.eurjneurol2012；19：1561-1567；scherlingcs，hallt，berishaf等，cerebrospinalfluidneurofilamentconcentrationreflectsdiseaseseverityinfrontotemporaldegeneration.annneurol2014；75：116-126；halls，ohrfelta，constantinescur等，accuracyofapanelof5cerebrospinalfluidbiomarkersinthedifferentialdiagnosisofpatientswithdementiaand/orparkinsoniandisorders.archneurol2012；69：1445-1452)。

在阿尔茨海默病(ad)中，灵敏的早期神经变性生物标志物是非常重要的。基于血液的生物标志物将是非常有价值的，但到目前为止，尚无此类标志物被证明能够将早期ad与健康衰老区分开来。

因此，在有症状前和有症状的疾病中，对于易于获得的ad神经变性生物标志物存在强烈的医学需求。

令人惊讶地发现，血清神经丝轻链(nfl)的测量提供了早期轴突变性标志物，即，在有症状前和有症状的疾病中都是易于获得的ad神经变性生物标志物。特别地，令人惊讶地发现，血清神经丝轻链(nfl)的测量已经提供了容易获得的在阿尔茨海默病有症状前的阶段中的阿尔茨海默病生物标志物。

我们在这里报告一项研究结果，该研究测量了一组常染色体显性家族性ad(fad)突变携带者的血清nfl水平。早老素1(psen1)、早老素2(psen2)或淀粉样蛋白前体蛋白(app)基因中的fad突变携带者具有相对可预测的发作年龄(rymandc，acosta-baenan，aisenps等，symptomonsetinautosomaldominantalzheimerdisease：asystematicreviewandmeta-analysis.neurology2014；83：253-260)，其为临床ad发作前无症状个体的前瞻性研究提供了机会。fad在病理生理学和临床上与更常见的散发性疾病形式共享许多特征(batemanrj，aisenps，destrooperb等，autosomal-dominantalzheimer′sdisease：areviewandproposalforthepreventionofalzheimer′sdisease.alzheimersresther2011；3：1)。我们评估了该方法检测常染色体显性家族性ad(fad)有症状前的血清nfl升高的能力。

nfl可以使用标准免疫测定形式在血清中测量(gaiottinoj，norgrenn，dobsonr等，increasedneurofilamentlightchainbloodlevelsinneurodegenerativeneurologicaldiseases.plosone2013；8：e75091；bacioglum，maialf，preischeo等，neurofilamentlightchaininbloodandcsfasmarkerofdiseaseprogressioninmousemodelsandinneurodegenerativediseases.neuron2016)。在这里，我们使用最近开发的基于单分子阵列(simoa)技术的免疫测定法，该技术允许对低至亚飞摩尔浓度(低于1pg/ml)的分析物进行定量(rissindm，kancw，campbelltg等，single-moleculeenzyme-linkedimmunosorbentassaydetectsserumproteinsatsubfemtomolarconcentrations.natbiotechnol2010；28：595-599)。使用该方法得到的血清nfl浓度与csf浓度密切相关，并且在hiv相关性痴呆、进行性核上性麻痹和额颞叶痴呆中上升(gisslénm.等，ebiomedicine.2015年11月22日；3：135-40.doi：10.1016/j.ebiom.2015.11.036.ecollection2016；rojasj.c.等，annclintranslneurol.2016年2月1日；3(3)：216-25.doi：10.1002/acn3.290.ecollection2016.；rohrerj.d.等，neurology.2016年9月27日；87(13)：1329-36.doi：10.1212/wnl.0000000000003154)。

我们惊奇地发现，在症状发作前可以检测到升高的血清nfl，并且与所测试的研究的有症状前和有症状参与者的疾病阶段和衰退速率相关。

特别是，在测试的无症状但处于风险中的参与者中，19个是突变携带者(中位数eyo＝8.3)和11个非携带者。与非携带者相比，校正了年龄和性别后，有症状的突变携带者(p＜0.0001)和有症状前的突变携带者(p＝0.007)的血清nfl都较高。血清nfl与eyo(p＜0.0001)以及多种认知和影像学测量结果相关，包括mmse(p＝0.0001)和全脑萎缩率(p＝0.0091)。

从实施例得出结论，在症状发作前fad中血清nfl浓度上升并且与疾病阶段和严重性的测量结果相关。因此，血清nfl可能是易于获得的早期ad相关神经退化生物标志物。

特别是，我们的研究首次评估了使用新的超灵敏测定法测量血清nfl以检测早期ad相关的神经退化的效用。我们在实施例中的结果令人惊讶地显示血清nfl在临床症状发作前数年升高。我们还显示血清nfl与估计症状发作前的年数非常密切地相关。因此，血清nfl能够跟踪并因此监测和预测疾病进展。还发现血清nfl与当前经验证的ad严重性测量结果密切相关，包括针对萎缩的结构成像测量和认知测试评分。然而，在有症状前的时段，血清nfl可能比这些更成熟的测量对神经退化变化更灵敏。纵向数据显示，在常染色体显性家族性ad(fad)突变携带者的症状发作前估计年数(eyo)之前约5至10年，血清nfl浓度开始增加(图6)。

在我们在实施例中提供的研究之后，现在显而易见的是，血清nfl在有症状的疾病发作之前的10年期间逐渐升高并且与其他神经元丢失标志物相关。因此，目前的证据支持在有症状前和有症状的疾病中使用血清nfl作为易于获得的ad神经退化生物标志物。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及用于检测个体罹患神经退行性疾病风险的方法，所述方法包括：

a)测量从个体获得的样品中神经丝轻链(nfl)的量或浓度；和

b)通过比较步骤(a)中测定的量或浓度与对照中nfl的量或浓度来检测个体罹患疾病的风险，

其中相对于对照，上升的nfl的值指示疾病的未来发展。

本发明方法中的标志物是神经丝轻链或nfl，优选人神经丝轻链或人nfl。神经丝轻链蛋白是人类中由nefl基因编码的蛋白质。与神经丝中链(nfm)和重链(nfh)一起，nfl形成轴突结构完整性的重要部分。截至2016年10月8日，人nfl蛋白具有ncbi参考序列号：np_006149.2中列出的序列。截至2016年10月8日，人nflmrna具有genbank登录号：bc066952.1中列出的序列。测量神经丝轻链(nfl)蛋白的量或浓度的步骤包括测量样品中，特别是血液样品中全长蛋白质、其具有全长蛋白质的代表性和特异性的片段、nfl的修饰形式如磷酸化的nfl或nfl蛋白的聚集体如二聚体、寡聚体或更高级的聚集体的量或浓度。

本发明的方法用于检测个体罹患神经退行性疾病的风险。

处于罹患神经退行性疾病风险中的个体涵盖所述神经退行性疾病的临床阶段的个体或有症状的个体，特别是早期的个体，和所述神经退行性疾病的临床前阶段的个体或有症状前的个体。处于临床前阶段的个体不表现出所述神经退行性疾病的至少一种临床症状和/或未怀疑患有所述神经退行性疾病。临床阶段的个体表现出所述神经退行性疾病的至少一种临床症状和/或怀疑患有所述神经退行性疾病。

神经退行性疾病被理解为中枢和外周神经系统疾病，其特征在于神经元的结构或功能的进行性丧失，包括神经元的死亡。神经退行性疾病包括帕金森病(parkinson′sdisease)，阿尔茨海默病(ad)，肌萎缩侧索硬化症(als)，去神经性萎缩，耳硬化症，痴呆[如血管性痴呆、路易体痴呆(dlb)、与帕金森病相关的痴呆、额颞叶痴呆、克雅氏病(creutzfeldt-jakobdisease)、正常压力脑积水痴呆]、魏尼凯氏综合征(wernicke-korsakoffsyndrome)和ad，多发性硬化症，亨廷顿氏病(huntington′sdisease)，与获得性免疫缺陷病(aids)相关的脑病，以及与神经细胞毒性和细胞死亡相关的其他疾病。在实施例中，显示血清nfl可以在有症状前和有症状的疾病中用作易于获得的ad神经退化生物标志物。因此，阿尔茨海默病或ad代表优选的神经退行性疾病。

阿尔茨海默病或ad是与进行性记忆丧失相关的中枢神经系统的慢性神经退行性疾病，导致痴呆。在尸检时ad患者中观察到两种病理特征：海马体、大脑皮层和大脑中对认知功能必不可少的其他区域的细胞外斑块和细胞内缠结。斑块主要由淀粉样蛋白β(aβ)的沉积形成，所述淀粉样蛋白β是源自淀粉样蛋白前体蛋白(app)的肽。丝状缠结由成对的螺旋丝形成，所述螺旋丝由神经丝和过度磷酸化的tau蛋白(微管相关蛋白)构成。ad有不同的阶段。为了评估阿尔茨海默病，可以组合以下一种或多种测试：脑磁共振成像(mri)、神经学检查和认知评估。这些测试在实施例中描述。此外，本领域技术人员可以根据用于评估认知障碍的cdr分类来区分临床ad阶段。cdr分类(临床痴呆评分)区分以下阶段：0＝正常；0.5＝非常轻度痴呆，对应于mci；1＝轻度痴呆，对应于轻度ad；2＝中度痴呆，对应于中度ad；3＝重度痴呆，对应于重度ad。mri可用于确定全脑或脑室容积。

ad的主要临床特征和症状是进行性认知衰退，因此是认知障碍，例如记忆丧失。阿尔茨海默病的症状包括认知障碍，包括语言障碍、视觉功能缺陷、记忆丧失、短期记忆障碍、焦虑增加、睡眠障碍、人格改变如进行性消极或明显的激动、情感表达减少、抑郁症和精神病。记忆功能障碍涉及学习新信息的障碍，其通常被表征为短期记忆丧失。在疾病的早期和中期阶段，可能会保留对遥远习得资料的回忆，但新信息无法充分纳入记忆。时间定向障碍与记忆紊乱密切相关。语言障碍也是ad的突出症状。这些通常首先表现为自发语言中的词语查找困难。ad患者的语言通常含糊不清，缺乏具体细节，并且可能会增加自动短语和陈词滥调。命名日常物品的困难通常很突出。视觉功能的复杂缺陷存在于许多ad患者中，其他局灶性认知缺陷如失用、失算和左右定向障碍也存在。经常看到判断和解决问题的障碍。非认知或行为症状在ad中也很常见，并且可能导致照顾者负担或压力的比例大于认知功能障碍。人格改变通常被报道，范围从进行性消极到明显的激动。患者可能表现出如感情表达减少等变化。抑郁症状的存在多达40％。类似比例的焦虑也已经被认识到。精神病发生率为25％。在某些情况下，人格改变可能早于认知异常。

因此，“阿尔茨海默病的症状”被理解为包括认知障碍，包括语言障碍、视觉功能缺陷、记忆丧失、短期记忆障碍、焦虑增加、睡眠障碍、人格改变如进行性消极或明显的激动、情感表达减少、抑郁症和精神病。阿尔茨海默病的早期症状是轻度认知障碍(mci)。本领域技术人员将轻度认知障碍或mci理解为完整认知功能和临床痴呆之间的灰色区域，如“精神障碍的诊断和统计手册”(dsm)中所定义，特别是如dsm-5版本中所定义。大约70％表现出轻度认知障碍(mci)的患者后来发展为阿尔茨海默病。其余患者会出现不同形式的痴呆，如血管性痴呆。

当应用本发明的方法时，相对于对照，上升的nfl的值指示疾病的未来发展。

未来发展涵盖个体在获得样品的时间点时是处于有症状前的情况。如果相对于对照确定nfl的值上升，则个体将来可能罹患神经退行性疾病，例如在约1个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年或15年内。在这些情况下，神经退行性疾病的发作在神经退行性疾病的一种或多种症状发作之前约1个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年或15年被检测到。在一个优选实施例中，确定个体可能在约一年或更长时间内罹患神经退行性疾病，优选约两年或更长时间，更优选约三年或更长时间，再更优选约四年或更长时间，最优选约五年或更长时间。在这些情况下，神经退行性疾病的发作在神经退行性疾病的一种或多种症状发作之前至少一年、优选至少两年、更优选至少三年、再更优选四年、最优选至少五年被检测到。在实施例中，有症状前的fad突变携带者的血清nfl水平上升并且进一步与症状发作前的估计年数(eyo)相关。

另外，未来发展涵盖个体在获得样品的时间点时有症状的情况。如果相对于对照确定nfl的值上升，则个体将来可能进一步罹患神经退行性疾病和/或表现疾病进展。例如，如果个体在获得样本的时间点表现出轻度认知障碍(mci)，并且相对于对照确定nfl的值上升，则个体将可能显示疾病进展，例如认知障碍的进展，和/或阿尔茨海默病或其他形式的痴呆症的一种或多种其他症状的发作。

因此，在本发明的一个优选实施方式中，个体是有症状前的或有症状的。

有症状的个体被理解为表现出神经退行性疾病的至少一种临床症状的个体。在阿尔茨海默病的情况下，有症状的个体可能例如表现出痴呆或认知障碍，例如轻度认知障碍。

有症状前的个体被理解为没有表现出神经退行性疾病的临床症状的个体。这样的个体可以是健康的个体，或患有与神经退行性疾病不同的疾病的个体，或者在家族中出现fad病例但没有表现出ad症状的个体。

在一个优选实施方式中，本发明涉及检测有症状前的人类个体罹患阿尔茨海默病风险的方法，所述方法包括

a)测量从个体获得的血液样品中神经丝轻链(nfl)蛋白的量或浓度；和

b)通过比较步骤(a)中测定的量或浓度与对照中nfl蛋白的量或浓度来检测个体罹患阿尔茨海默病的风险，其中相对于对照，上升的nfl蛋白的值指示阿尔茨海默病的未来发展。

更优选地，

-nfl蛋白的量或浓度与阿尔茨海默病的一种或多种症状的发作前的时间相关，优选其中nfl蛋白的量或浓度在临床症状发作之前升高，和/或

-所述方法能够在一种或多种症状发作之前至少一年、优选至少两年、更优选至少三年、再更优选四年、最优选至少五年检测阿尔茨海默病的发作，特别是其中nfl蛋白的量或浓度在临床症状发作之前升高，和/或

-所述方法能够在一种或多种症状发作之前至少一年、优选至少两年、更优选至少三年、再更优选四年、最优选至少五年检测阿尔茨海默病的发作，优选其中nfl蛋白的量或浓度在临床症状发作之前升高，和/或

-阿尔茨海默病是家族性阿尔茨海默病，和/或

-在不同时间重复所述方法以监测个体或预防性治疗，和/或

-对照值是从健康对照个体或健康对照组，或者在较早时间点从同一个体获得，和/或

-血液样品是血清、血浆或全血，优选血清；和/或

-相对于对照，上升的nfl蛋白值指示在约1个月至10年内罹患阿尔茨海默病。

如上所述，在实施例中令人惊讶地发现，对于有症状前的fad突变携带者，血清nfl水平上升，并且它们与这类有症状前的fad突变携带者的症状发作前的估计年数(eyo)进一步相关。特别发现，对于症状发作估计年数更长的有症状前的fad突变携带者，与症状发作前的估计年数(eyo)较短的有症状前的fad突变携带者相比，确定nfl值上升较少。

对于fad突变携带者，可以从家族史确定症状发作前估计年数(eyo)，如上所述。eyo值与预期有症状前的个体显示ad临床症状的时间有关。对于fad突变携带者，eyo值与疾病的一种或多种症状的发作前的时间相关。

因此，在本发明的另一个优选实施方式中，nfl的量或浓度与疾病的一种或多种症状的发作前的时间相关。疾病的发作前的时间涉及直到在某一研究时间点，有症状前的个体将表现出所述疾病的至少一种临床症状和/或表现出所述疾病所通过的时间段。神经退行性疾病，特别是ad的发作前的时间可以是例如1个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年或15年。因此，本发明的方法能够在神经退行性疾病，特别是ad的一种或多种症状发作之前1个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年或15年检测神经退行性疾病，特别是ad的发作。

因此，在本发明的另一个优选实施方式中，所述方法能够在一种或多种症状发作之前至少一年、优选至少两年、更优选至少三年、再更优选四年、最优选至少五年检测疾病的发作。

在本发明的另一个优选实施方式中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病，特别是家族性阿尔茨海默病。

在实施例中，在家族性阿尔茨海默病的有症状和有症状前的突变携带者中鉴定出升高的nfl水平；有症状前的个体距离预测的症状发作有平均9年。因此，本发明的方法尤其可用于检测个体患有家族性阿尔茨海默病(fad)的风险。

家族性阿尔茨海默病或fad是阿尔茨海默病的一种形式，以常染色体显性方式遗传。家族性阿尔茨海默病通常在生命中较早发作，通常发生在65岁之前，通常在50至65岁之间，但可能早在15岁。常染色体显性家族性ad(fad)突变携带者表现出罹患阿尔茨海默病的风险增加。fad突变包括早老素1(psen1)、早老素2(psen2)和淀粉样蛋白前体蛋白(app)基因的突变。

将在个体中检测神经退行性疾病的未来发展。

本发明的个体可以是任何人或非人动物，尤其是哺乳动物、鱼类、爬行动物或鸟类。因此，本文描述的方法和组合物适用于人类疾病和兽类疾病。显然，特别感兴趣的非人哺乳动物包括实验动物，如啮齿动物，包括例如小鼠、大鼠、兔或斑马鱼，家养动物，如宠物和具有商业价值的动物，包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、龟、乌龟、蛇、蜥蜴或金鱼。

在本发明的一个优选实施方式中，个体是人。

为了检测神经退行性疾病的未来发展，从个体获得样品。

样品可以是适合于测量本发明的标志物nfl的任何样品，并且是指为了体外评价而获得的生物样品。它包含可以与个体特定相关的材料，并且可以从中确定、计算或推断出关于个体的特定信息。样品可以全部或部分由患者的生物材料(例如血液样品)构成。样品也可以是与患者接触过的材料，这一接触方式使得可以针对该样品进行测试以提供关于个体的信息。样品可以优选包含任何体液。示例性测试样品包括血液、血清、血浆、尿液、唾液、全血或在外周血中循环的颗粒，如外泌体或脑脊髓液(csf)。样品可以从个体中取出并立即使用或在测量步骤a)之前处理。处理可包括纯化(例如分离，如离心)、浓缩、稀释、细胞组分的裂解、冷冻、酸化、保存等。优选的样品是血清、血浆、全血或在外周血中循环的颗粒，如外泌体，其中血清代表最优选的样品类型。

在外周血中循环的颗粒是可以通过离心方案从外周血中分离的颗粒。在外周血中循环的特别优选的颗粒是外泌体。外泌体是直径范围为约30至约100nm的小囊泡，其是内吞起源的，并且通过几种细胞类型在细胞外环境中释放。可以通过本领域技术人员已知的方法从外周血样品中分离外来体，例如通过超速离心，特别是差异性超速离心，任选地与微过滤或梯度，或尺寸排阻色谱，或市售试剂盒，例如(sbi，paloalto，usa)组合。

因此，在本发明的另一个优选实施方式中，样品是脑脊髓液或血液样品，优选血清、血浆、全血或在外周血中循环的颗粒，例如外泌体，更优选血清。

根据本发明，确定标志物nfl的量或浓度，以便检测个体罹患神经退行性疾病的风险。物质的量是标准定义的量，其测量基本实体的集合的大小，例如原子、分子、电子和其他粒子。它有时被称为化学量。国际单位制(si)规定物质的量与存在的基本实体的数量成比例。物质的量的si单位是摩尔。它的单位符号是mol。物质的浓度是成分的量除以混合物的总体积。可以区分几种类型的数学描述：质量浓度、摩尔浓度、数量浓度和体积浓度。术语浓度可以应用于任何种类的化学混合物，但最常见的是指溶液中的溶质和溶剂。摩尔(量)浓度具有如当量浓度和渗透浓度等变体。

测量标志物nfl水平的步骤可以如下进行：可以使样品和任选的校准物和/或对照与nfl的特异性结合剂在允许该试剂与标志物nfl结合的条件下接触，所述试剂任选地固定在例如固相上。任选地，通过分离步骤(例如一个或多个洗涤步骤)去除未结合的结合剂。可加入第二试剂(例如标记的试剂)以检测结合的结合剂和/或结合的标志物nfl，以允许其结合和定量。任选地，通过分离步骤(例如一个或多个洗涤步骤)去除未结合的第二试剂。可以例如基于标记定量第二结合剂的量，其与标志物的量成比例。定量可以基于例如通过相对于每个校准物的浓度标绘测量值而针对每个测定构建的校准曲线。然后可以从校准曲线读取样品中标志物的浓度或量。

在确定标志物的量或浓度后，将获得的值与在对照(例如对照样品或对照群组或对照群体或对照组)中建立的标志物nfl的量或浓度进行比较。表述“将……的量或浓度与对照中……的量或浓度进行比较”仅用于进一步说明本领域技术人员显而易见的内容。对照样品可以是内部或外部对照。在一个实施方式中，使用内部对照，即在测试样品中以及在取自同一受试者的一种或多种其他样品中评估标志物水平，以确定所述标志物的水平是否有任何变化。因此，在一个优选实施例中，对照值是在较早时间点从同一个体获得的。对于对照，进一步优选的是，相同的个体在所述较早的时间点处于有症状前，或者在所述较早的时间点表现出很少和/或轻微的疾病症状。在另一个实施方式中，使用外部对照。对于外部对照，将来源于个体的样品中标志物的存在或量与其在已知不具有给定条件(例如神经退行性疾病或罹患神经退行性疾病的风险，如ad)的个体，即“正常个体”或个体群体中的量或浓度进行比较。因此，在一个优选实施方式中，从健康对照个体或健康对照群组获得对照值。通常，样品的标志物水平与诊断或预测直接或间接相关，并且标志物水平例如是用于确定个体是否处于罹患神经退行性疾病的风险。选择适当的对照样品/群体/群组/组以及其中建立的标志物的对照或参考值在从业者的技能范围内。本领域技术人员将理解，在一个优选实施方式中，这种对照是从年龄匹配且没有混杂疾病的参照群体获得的。如本领域技术人员也清楚的，在对照中建立的绝对标志物值将取决于所用的测定。优选地，来自适当参考群体的100个或更多个充分表征的个体的样品用于建立对照(参考)值。还优选的是，参考群体可以选择由至少20、30、50、200、500或1000个个体组成。健康个体代表用于建立参考的优选参考群体。或者，本发明的方法中可以使用多个参考群体，例如，一个由健康个体构成的群体和一个由已知具有神经退行性疾病如ad症状的个体或fad的突变携带者构成的的群体。

因此，在本发明的另一个优选实施方式中，对照值是从健康对照个体或健康对照群组，或在较早时间点从同一个体获得。

在样品中，测量标志物分子nfl的量或浓度。用于测量标志物分子nfl的各种方法是本领域已知的，并且可以使用这些方法中的任一种。

优选地，通过使用特异性结合剂从液体样品中特异性地测量标志物nfl。

特异性结合剂是例如标志物的受体或标志物的抗体或与标志物蛋白质相关的核酸互补的核酸(例如与标志物mrna或其相关部分互补的核酸)。优选地，在蛋白质水平测量标志物分子nfl。

因此，在本发明的另一个优选实施方式中，nfl是作为nfl蛋白或nflmrna进行测量。

可以通过本领域已知的任何技术检测nflmrna。这些包括rna印迹分析、逆转录酶-pcr扩增(rt-pcr)、微阵列分析和rna酶保护。

例如，样品中的nflmrna可以在rna印迹分析中测量。这里，组织rna通过电泳分级，固定在固体膜支持物如硝酸纤维素或尼龙上，并与能够与样品中的nflmrna选择性杂交的探针杂交。可以通过参考一种或多种对照管家基因来定量实际水平。管家基因是参与细胞的一般代谢或维持的基因，并且被认为以恒定水平表达，而与细胞类型、生理状态或细胞周期的阶段无关。合适的管家基因的实例是β肌动蛋白、gapdh、组蛋白h3.3或核糖体蛋白l13。

在另一个实施方式中，扩增nflmrna并定量测定。聚合酶链反应(pcr)程序可用于通过一系列重复步骤扩增特定核酸序列，包括变性、根据nflmrna序列设计的寡核苷酸引物的退火，以及用dna聚合酶延伸引物。在逆转录酶-pcr(rt-pcr)中，该程序之前是逆转录步骤，以使得可以大量扩增mrna的拷贝数。

rt-pcr产物的定量可以在反应产物以指数方式积累的同时进行，并且可以产生诊断上有用的临床数据。在一个实施方式中，通过参考一种或多种管家基因进行测量，所述管家基因也通过rt-pcr扩增。rt-pcr产物的定量可以例如通过凝胶电泳目视检查或图像分析、hplc或通过使用荧光检测方法进行。

在一个更优选的实施方式中，nfl是作为nfl蛋白进行测量。

作为标志物蛋白的结合配偶体的蛋白质的测定可以使用许多已知方法中的任何一种来进行，所述方法用于鉴定和获得与蛋白质特异性相互作用的蛋白质，例如，美国专利号5,283,173和美国专利号5,468,614中所述的酵母双杂交筛选系统，或等同物。特异性结合剂对其相应的靶分子优选具有至少10⁷1/mol的亲和力。特异性结合剂对其靶分子优选具有10⁸1/mol或甚至更优选10⁹1/mol的亲和力。如本领域技术人员将理解的，术语特异性用于表示样品中存在的其他生物分子不显著结合对标志物具有特异性的结合剂。优选地，与靶分子之外的生物分子的结合水平产生仅为对靶分子的亲和力的10％或更低，更优选仅为5％或更低的结合亲和力。优选的特异性结合剂将满足上述亲和力以及特异性的最低标准。

优选地，特异性结合剂是与标志物nfl反应的抗体。术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、此类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包含抗体结合结构域的遗传构建体。

优选地，在免疫测定中检测标志物，特别是以夹心型测定形式。在这种测定中，第一特异性结合剂(例如第一抗体)用于捕获所述标志物。任选地，第一特异性结合剂是共价或非共价地，特别是被动地，与固相结合。固相通常是玻璃、磁性或顺磁性材料或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相可以是微粒、管、珠、微板的圆盘或适于进行免疫测定的任何其他表面的形式。结合方法是本领域公知的，涵盖交联、共价结合和物理吸附结合剂，以形成第一特异性结合剂和固体支持物的复合物，例如聚合物-抗体复合物。可以实现非共价结合，例如通过生物亲和结合对，如生物素和链霉抗生物素蛋白。

在与标志物一起培育一段适当时间之后，即在合适的条件下足以使标志物和第一特异性结合剂形成复合物的一段时间，并且在任选的洗涤步骤之后，使用被标记进而可直接或间接检测到的第二特异性结合剂(例如第二抗体)，以捕获所述标志物，或第一特异性结合剂，或所形成的包含标志物和第一特异性结合剂的复合物。第二特异性结合剂可含有可检测的报道分子部分或标记，例如酶、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团或生物素等。可以将任何报道分子或标记与本文公开的方法一起使用，只要其信号与结合剂的量直接相关或成比例即可。可以洗掉任何未反应的物质。然后使用适合于特定可检测报道分子部分或标记的方法测定第二结合剂的量，所述第二结合剂保持与所述标志物结合，或与第一特异性结合剂结合，或与包含标志物和第一特异性结合剂的形成的复合物结合。对于放射性基团，闪烁计数或放射自显影方法通常是合适的。可以使用多种偶联技术制备抗体-酶缀合物(综述参见例如scouten，w.h.，methodsinenzymology135：30-65，1987)。光谱方法可用于检测染料(包括例如酶反应的比色产物)、发光基团和荧光基团。可以使用与不同的报道基团(通常是放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白检测生物素。通常可以通过添加底物(通常持续特定的时间段)，然后对反应产物进行光谱、分光光度或其他分析来检测酶报道基团。使用众所周知的技术，标准品和标准添加物可用于测定样品中的抗原水平。

术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、其抗原结合片段，以及任何天然存在的或重组产生的结合配偶体，它们是特异性结合nfl蛋白的分子。术语抗体的“抗原结合片段”是指具有以与抗体相似的方式结合抗原的能力但是其尺寸小于完整抗体分子的分子。例如，通过木瓜蛋白酶消化获得抗体的两个“抗原结合片段”，其产生三个片段，即两个相同的片段，称为“fab片段”(也称为“fab部分”或“fab区”)，每个片段具有单个抗原结合位点，和残留的“fc片段”(也称为“fc部分”或“fc区”)，其名称反映了其易于结晶的能力。其他抗原结合片段包括“fab′片段”，其指fab片段另外包含ig分子的铰链区，和“f(ab′)2片段”，其被理解为包含两个化学连接或通过二硫键连接的fab′片段。同时“单结构域抗体(sdab)”(desmyter等(1996)nat.structurebiol.3：803-811)。进一步涵盖“纳米抗体”，其仅包含单个vh结构域，“单链fv(scfv)”片段包含通过短接头肽与轻链可变结构域连接的重链可变结构域(huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85,5879-5883)，二价单链可变片段(di-scfv)，其可以通过连接两个scfv(scfva-scfvb)来改造。这可以通过产生具有两个vh和两个vl区的单个肽链来完成，从而产生“串联scfv”(vha-vla-vhb-vlb)。另一种可能性是产生具有接头的scfv，所述接头对于两个可变区而言太短而不能折叠在一起，从而迫使scfv二聚化。通常使用长度为5个残基的接头来产生这些二聚体。这种类型被称为“双抗体”。vh和vl结构域之间的更短接头(一个或两个氨基酸)导致单特异性三聚体的形成，即所谓的“三抗体”或“三体”。通过分别用排列vha-vlb和vhb-vla或vla-vhb和vlb-vha表达两条链而形成双特异性双抗体。单链双抗体(scdb)包含vha-vlb和vhb-vla片段，其通过12-20个氨基酸，优选14个氨基酸的连接肽(p)连接(vha-vlb-p-vhb-vla)。双亲和重靶向分子(“dart”分子)是通过c端二硫桥进一步稳定的双抗体。

通过现有技术程序产生抗体，例如，如tijssen(tijssen，p.，practiceandtheoryofenzymeimmunoassays，elseviersciencepublishersb.v.，amsterdam(1990)，整本书，尤其是第43-78页)中所述。此外，本领域技术人员充分了解可用于特异性分离抗体的基于免疫吸附剂的方法。通过这些手段，可以增强多克隆抗体的质量，从而提高它们在免疫测定中的性能(tiissen，p.，见上文，第108-115页)。

对于本发明公开的成就，可以使用例如山羊中产生的多克隆抗体。然而，显然也可以使用来自不同物种，例如大鼠、兔或豚鼠的多克隆抗体，以及单克隆抗体。由于单克隆抗体能够以稳定的特性以任何量生产，因此它们代表开发临床常规测定的理想工具。

为了测量，在适于形成结合剂标志物复合物的条件下，将从个体获得的样品与所述标志物的特异性结合剂一起培育。由于本领域技术人员不需要任何创造性努力就可以容易地确定这种适当的培育条件，所以这样的条件不需要具体说明。测量结合剂标志物复合物的量并将其用于本发明的方法和用途中。如本领域技术人员将理解的，有许多方法来测量特异性结合剂标志物复合物的量，所有这些都在相关教科书中详细描述(参见例如，tijssenp.，见上文或diamandis，e.p.和christopoulos，t.k.(编)，immunoassay，academicpress，boston(1996))。在实例中，来自umandiagnostics(umandiagnostics，sweden)的nf轻链测定中包含的单克隆抗体mab47：3和mab2：1成功地用于测量样品中nfl蛋白的量和浓度。

特别地，针对标志物nfl蛋白的单克隆抗体用于定量(确定标志物的量或浓度)免疫测定。

可用于本发明的优选免疫测定包括酶联免疫吸附测定(elisa)、电化学测定(ecl)、电化学发光免疫测定(eclia)、放射免疫测定(ria)或超灵敏单分子阵列测定(simoa)。

如上所述，存在多种测量nfl蛋白的方法。用于测量nfl的市售产品包括nflelisa(来自umandiagnostics(umandiagnostics，sweden)的nf轻链测定法)。此外，现有技术中描述的电化学发光测定法可用于测量nfl蛋白(kuhlej，barroc，andreassonu等，comparisonofthreeanalyticalplatformsforquantificationoftheneurofilamentlightchaininbloodsamples：elisa，electrochemiluminescenceimmunoassayandsimoa.clinchemlabmed2016)。

在测量样品中nfl的量或浓度的具体实施方式中，将第一和第二特异性结合剂(优选第一和第二抗体)与包含待分析标志物的样品混合。

在一个优选实施方式中，将第一特异性结合剂(优选抗体)包被在微粒或珠子上，更优选在顺磁性微粒或珠子上。此外，第二特异性结合剂(优选抗体)被标记为可直接或间接检测。

在一个优选实施方式中，可以通过生物亲和结合对(例如生物素和链霉抗生物素蛋白)实现对微粒或珠子的包被。在这样的实施方式中，微粒或珠子在一个优选实施方式中是磁性或顺磁性微粒或珠子。

在一个优选实施方式中，其中免疫测定在没有洗涤步骤的情况下进行，这种混合和培育在单个反应容器中进行。添加和混合三种成分(例如，分别是：包被有第一特异性结合剂(如抗体)的微粒、包含标志物的样品、第二可检测标记的抗体)的顺序并不重要。将该混合物培育一段时间，该时间足以使第一特异性结合剂(特别是包被在微粒或珠子上的第一抗体)和可检测标记的第二特异性结合剂(特别是第二抗体)与nfl结合。

在另一个优选实施方式中，其中免疫测定包含洗涤步骤时。添加和混合第一特异性试剂(特别是包被在微粒或珠子上的第一抗体)、样品和可检测标记的第二特异性结合剂(例如抗体)依次在单个反应容器中进行。在第一步骤(分析物捕获步骤)中，将用第一抗体包被的微粒或珠子与待分析的样品一起培育一段时间，该时间足以使分析物即nfl结合。洗涤步骤后，加入可检测标记的第二抗体并培育一段时间，该时间足以使第二抗体与分析物即nfl结合。在一个优选实施方式中，所述方法以竞争性测定形式实施。

在一个优选实施方式中，将包含第一特异性试剂(特别是包被在微粒或珠子上的第一抗体)、样品和可检测标记的第二特异性结合剂(例如抗体)的混合物培育少于60分钟，即少于60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5分钟。在更优选的实施方式中，将混合物培育4分钟至1小时(即4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟)。在甚至更优选的实施方式中，将混合物培育5分钟至45分钟，即5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或45分钟。在进一步更优选的实施方式中，将混合物培育5分钟至30分钟，即5、6、7、8、9、10、15、20、25或30分钟。在特别优选的实施方式中，将混合物培育9或18分钟。在另一个优选实施方式中，将混合物培育1-12小时(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时)。在更优选的实施方式中，将混合物培育1-4小时或8-12小时。

在进一步优选的实施方式中，将混合物在3-40℃(即3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40℃)的温度下培育。在一个优选实施方式中，将混合物在3℃至8℃(即3、4、5、6、7或8℃)的温度下，更优选在4-5℃下，或在20℃至25℃(即20、21、22、23、24或25℃)的温度下，特别是在20-22℃的温度下或在35-37℃的温度下培育。

本领域技术人员众所周知的是，培育温度和培育时间彼此依赖。因此，在优选的实施方式中，将混合物在20-25℃下培育10分钟至1小时，即将混合物在20、21、22、23、24或25℃下培育10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟。在其他优选的实施方式中，将混合物在22℃下培育少于10分钟或少于20分钟。在其他优选的实施方式中，将混合物在3-8℃下培育1-12小时。特别地，将混合物在3-8℃，特别是4-5℃下培育1-4小时或8-12小时。

将第一特异性试剂和/或第二特异性结合剂，优选第一和/或第二抗体培育一段时间，该时间足以使包被在微粒或珠子上的第一抗体和可检测标记的第二抗体与样品中的nfl结合。

在一个优选实施方式中，第一特异性试剂和/或第二特异性结合剂，优选第一和/或第二抗体，包含在生理溶液中，特别是在生理缓冲液中，和/或在其中培育。在一个优选实施方式中，缓冲液选自下组：taps、bicine、tris、tricine、tapso、hepes、tes、mops、pipes、cacodylate和mes。在一个更优选的实施方式中，缓冲液是mes缓冲液。在一个甚至更优选的实施方式中，mes缓冲液包含以下组分：50mmmes、150mmnacl、2mmedta-na2(二水合物)、0.1％n-甲基异噻唑啉-hcl、0.1％oxypyrion、0.1％聚多卡醇(thesit)、1.0％白蛋白rpla4测定质量、0.2％pak<->r-igg(det)、millipore-water，用2nnaoh将ph调节至6.30。

在一个优选实施方式中，形成的第一特异性结合剂-标志物-第二特异性结合剂复合物，优选第一抗体-抗原(标志物)-第二抗体复合物，特别是形成的包含第一抗体-nfl-第二抗体的复合物，通过本领域熟知的任何方法检测。在特定实施例中，通过电化学发光、化学发光或荧光检测形成的复合物。

在电化学(ecl)或电化学发光(eclia)测定中，通过与检测剂连接的标记检测结合的分析物分子。电极电化学地引发与检测剂连接的化学标记的发光。标记发出的光由光电探测器测量，并指示结合的分析物分子/靶分子复合物的存在或数量。eclia方法描述于例如美国专利号5,543,112；5,935,779；和6,316,607中。对于不同的分析物分子浓度，可以最大化信号调制，以进行精确和灵敏的测量。例如，标记可以是钌标记。

在另外的实施方式中，进行超灵敏单分子阵列(simoa)夹心免疫测定。在现有技术中描述了可以使用标准免疫测定形式在血清中测量nfl，但是对照样品和来自疾病组的许多样品将具有低于方法的分析灵敏度的nfl浓度。在实施例中，成功地使用了最近开发的基于单分子阵列(simoa)技术的免疫测定法，其允许定量低至亚飞摩尔浓度(低于1pg/ml)的分析物，并且其灵敏度为以前基于电化学发光的nfl方法的25倍。在实施例中，成功使用了rissind.m.等(naturebiotechnology(doi：10.1038/nbt.1641))中所述的simoa测定法。

在超灵敏单分子阵列(simoa)夹心免疫测定期间，荧光显著的顺磁珠与捕获抗体偶联，所述顺磁珠可以直径为2.7μm。应用常规的基于珠子的夹心免疫测定方法，其中在珠子表面上形成用酶，特别是链霉抗生物素蛋白-β-半乳糖苷酶标记的单一免疫复合物。当测试含有极低浓度分析物的样品时，分析物分子以及所得免疫复合物与珠子的比例很小(＜1)，含有标记免疫复合物的珠子的百分比遵循泊松分布。因此，珠子携带单个免疫复合物或不携带。珠子表面上极低浓度的酶标记可以通过将珠子加载到有大量孔的阵列中来检测，例如有＞10⁴或＞10⁵个孔，例如，216，000个孔，并将由各个酶产生的荧光团限制在极小的体积中，例如约50飞升。珠子用油密封，以确保每孔中只有一个珠子。携带单个酶标记的免疫复合物的珠子在受限孔中产生高局部浓度的荧光团。通过使用标准显微镜光学系统获取阵列的时间间隔荧光图像，可以区分与单个酶分子结合的珠子(“开”孔)和不与酶分子结合的珠子(“关”孔)。在低浓度的蛋白质中，当酶标记与珠子的比率小于约1.2时，珠子携带零或低数量的酶，并且通过计数“开”或“关”珠子的存在来定量蛋白质浓度(即数字方案)。在较高的蛋白质浓度下，每个珠子通常携带多个酶标记，并且每个珠子上存在的酶标记的平均数量由平均荧光强度的量度(即模拟方案)定量。数字和模拟浓度范围均由共同单位量化，即每个珠子的酶标记的平均数量(aeb)。联合数字和模拟模式对单个化珠子的荧光测量，可以实现跨越6个数量级的酶标记的线性动态范围。

根据本发明，相对于对照，上升的标志物的量或浓度的值指示神经退行性疾病的未来发展。如果该值上升，则将在未来罹患神经退行性疾病。由此鉴定的个体可以进行进一步的诊断或治疗方法，包括进一步的血液或csf测试、成像方法、认知测试或治疗，特别是预防性治疗。本领域技术人员将能够根据现行国家的医疗实践选择合适的手段。

在一个实施方式中，相对于对照值，如果值量上升至少110％、更优选至少120％、更优选至少130％、更优选至少140％、更优选至少150％、更优选至少160％、更优选至少170％、更优选至少180％、甚至更优选至少190％，则该值上升。

或者，在对照组或对照群体中测量的nfl值例如用于建立临界值或参考范围。高于这种临界值，或在参考范围外部且在较高端以外的值被认为是上升的。在一个实施方式中，建立固定的临界值，该临界值的选取匹配诊断或预测的目标问题。在一个实施方式中，在对照组或对照群体中测量的nfl值用于建立参考范围。在一个优选实施方式中，如果测量的值高于参考范围的90％百分位，则认为nfl浓度增加。在进一步优选的实施方式中，如果测量的值高于参考范围的95％百分位、96％百分位、97％百分位或97.5％百分位，则认为nfl的值上升。临界值可以代表区分具有罹患神经退行性疾病风险的个体与不具有罹患神经退行性疾病风险的个体的适当值。

可根据所需的灵敏度和特异性选择合适的临界值。灵敏度和特异性是二分类检验性能的统计量度，在统计学中也称为分类函数：

灵敏度(也称为真阳性率)测量正确鉴定的阳性的比例(例如，具有罹患神经退行性疾病的风险的人被正确鉴定为具有风险的百分比)。

特异性(也称为真阴性率)测量正确鉴定的阴性的比例(例如，没有罹患神经退行性疾病的风险的人被正确鉴定为没有风险的百分比)。

对于任何检验，通常在上述量度之间进行权衡。例如，在机场安全设置中，人们正在测试潜在的安全威胁，扫描仪可能会设置为触发低风险项目，如皮带扣和钥匙(低特异性)，以减少遗漏对飞机和登机的人构成威胁的物体的风险(高灵敏度)。这种权衡可以图形表示为接收器操作特性曲线。完美的预测因素会被描述为100％灵敏(例如，所有处于风险中的个体被鉴定为处于风险中的个体)并且100％特异(例如，所有健康个体未被鉴定为处于风险中的个体)；然而，理论上任何预测因素都将具有称为贝叶斯错误率的最小误差界限。可以设置临界值以增加灵敏度或特异性。

在统计学中，接收者操作特性(roc)或roc曲线是显示二分类器系统的性能随着辨别阈值变化的图表。通过在各种阈值设置下绘制真阳性率(tpr)与假阳性率(fpr)来创建曲线。如上所述，真阳性率也称为灵敏度或灵敏度指数d′，在信号检测和生物医学信息学中被称为“d-prime”，或在机器学习中被称为召回率。假阳性率也称为误诊率，可以计算为(1-特异性)。roc曲线比较了一系列值的灵敏度与特异性，以显示其预测二分类结果的能力。曲线下面积(auc表示比较测试性能的总体准确度(florkowskicm，2008，clinbiochemrev29(增刊1)：s83-s87)。灵敏度是指测试将个体正确分类为患病的能力。测试将个体正确分类为无疾病或无风险的能力称为特异性。

roc分析提供了用于选择可能的最优模型并且摒弃次优模型的工具，这种选择独立于(并且先于指定)成本因素或类别的分布情况。roc分析以直接和自然的方式与进行诊断决策的成本/效益分析相关。

在本发明的另一个优选实施方式中，在不同时间重复该方法以监测个体或预防性治疗。

该方法可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同时间重复。由此，可以建立时间进程，其使得可以监测个体。时间间隔可以不同，例如，可以是1天至20年之间的时间间隔，例如1个月至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年之间的时间间隔。此外，在2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同时间重复该方法的情况下，时间间隔可以不同。例如，对照可以是健康对照个体或健康对照群组，或者可以在相应的较早时间点来自同一个体，例如在第一时间点来自同一个体。如果随着时间的推移确定nfl的值上升，则罹患神经退行性疾病的风险进一步增加；而如果在后时间点的值恒定或降低则指示罹患神经退行性疾病的风险不会进一步增加，或会降低。

因此，在另一个实施方式中，本发明涉及用于检测个体罹患神经退行性疾病风险的方法，所述方法包括：

a)使(i)从个体获得的样品，和(ii)nfl的第一特异性结合剂接触，由此形成包含nfl和第一特异性结合剂的复合物，

b)任选地将剩余样品与包含nfl和nfl的第一特异性结合剂的复合物分离，

c)使包含nfl和nfl的第一特异性结合剂的复合物与nfl的第二特异性结合剂接触，由此形成包含nfl和nfl的第二特异性结合剂，和/或nfl的第一特异性结合剂的复合物，

d)测量包含nfl和第一特异性结合剂和/或第二特异性结合剂的复合物的量或浓度；和

e)通过比较步骤(d)中测定的量或浓度与对照中包含nfl和第二特异性结合剂和/或第一特异性结合剂的复合物的量或浓度，检测个体罹患疾病的风险，其中相对于对照，上升的包含nfl和第二特异性结合剂和/或第一特异性结合剂的复合物的值指示疾病的未来发展。

如上关于本发明的第一实施方式所述，定量夹心免疫测定可用于测定nfl蛋白的量或浓度。例如，作为优选的特异性结合剂的第一特异性nfl抗体可以在步骤(a)中与从个体获得的样品一起培育。由此，形成包含nfl和第一nfl抗体的复合物。第一特异性nfl抗体优选与固体支持物结合或能够与固体支持物结合。这种固体支持物可以是例如孔，例如多孔板，阵列，例如微阵列或纳米阵列，或珠子或微粒，例如磁珠或微粒或顺磁珠或微粒。与支持物的结合，例如通过共价或非共价连接，以使得可以根据步骤(b)从剩余样品中分离包含nfl和nfl的第一特异性结合剂的复合物。可替代地或另外地，可以包括一个或多个洗涤步骤用于与剩余样品分离。可以通过生物亲和结合对的成员实现非共价连接，例如生物素和链霉抗生物素蛋白，或受体和配体。随后，将所述复合物与nfl的第二特异性结合剂(例如第二nfl抗体)一起培育。由此，形成包含nfl和nfl的第二特异性结合剂和/或nfl的第一特异性结合剂的复合物。形成的复合物还取决于特异性结合剂分别结合的表位。在一个优选实施方式中，nfl的第二特异性结合剂和nfl的第一特异性结合剂结合nfl蛋白的不同的，更优选非重叠的表位，从而使得可以形成包含两种特异性结合剂的复合物和以夹心免疫分析格式进行检测。在一个优选实施方式中，如上所述，将nfl的第二特异性结合剂标记为可直接或间接检测，从而使得可以检测包含nfl和nfl的第二特异性结合剂和/或第一特异性结合剂的复合物的量或浓度。如上所述，相对于对照，上升的包含nfl和nfl的第二特异性结合剂和/或第一特异性结合剂的复合物的值指示神经退行性疾病的未来发展。

优选地，本发明涉及检测有症状前的人类个体罹患阿尔茨海默病风险的体外方法，所述方法包括

a)使(i)从个体获得的血液样品，和(ii)nfl蛋白的第一特异性结合剂接触，由此形成包含nfl蛋白和第一特异性结合剂的复合物，

b)任选地将剩余样品与包含nfl和nfl的第一特异性结合剂的复合物分离，

c)使包含nfl蛋白和nfl蛋白的第一特异性结合剂的复合物与nfl蛋白的第二特异性结合剂接触，由此形成包含nfl蛋白和nfl蛋白的第二特异性结合剂，和/或nfl蛋白的第一特异性结合剂的复合物，

d)测量包含nfl蛋白和第一特异性结合剂和/或第二特异性结合剂的复合物的量或浓度；和

e)通过比较步骤(d)中测定的量或浓度与对照中包含nfl和第二特异性结合剂和/或第一特异性结合剂的复合物的量或浓度，检测个体罹患阿尔茨海默病的风险，其中相对于对照，上升的包含nfl蛋白和第二特异性结合剂和/或第一特异性结合剂的复合物的值指示阿尔茨海默病的未来发展。

在本发明的另一个优选实施方式中，nfl是作为nflmrna进行测量。

可以通过本领域已知的任何技术检测nflmrna。这些包括rna印迹分析、逆转录酶-pcr扩增(rt-pcr)、微阵列分析和rna酶防护。

例如，样品中的nflmrna可以在rna印迹分析中测量。这里，组织rna通过电泳分级，固定在固体膜支持物如硝酸纤维素或尼龙上，并与能够与样品中的nflmrna选择性杂交的探针杂交。可以通过参考一种或多种对照管家基因来定量实际水平。管家基因是参与细胞的一般代谢或维持的基因，并且被认为以恒定水平表达，而与细胞类型、生理状态或细胞周期的阶段无关。合适的管家基因的实例是β肌动蛋白、gapdh、组蛋白h3.3或核糖体蛋白l13。

在另一个实施方式中，扩增nflmrna并定量测定。聚合酶链反应(pcr)程序可用于通过一系列重复步骤扩增特定核酸序列，包括变性、根据nflmrna序列设计的寡核苷酸引物的退火，以及用dna聚合酶延伸引物。在逆转录酶-pcr(rt-pcr)中，该程序之前是逆转录步骤，以使得可以大量扩增mrna的拷贝数。

rt-pcr产物的定量可以在反应产物以指数方式积累的同时进行，并且可以产生诊断上有用的临床数据。在一个实施例中，通过参考一种或多种管家基因进行测量，所述管家基因也通过rt-pcr扩增。rt-pcr产物的定量可以例如通过凝胶电泳目视检查或图像分析、hplc或通过使用荧光检测方法进行。

根据本发明，相对于对照，上升的标志物的量或浓度的值指示神经退行性疾病的未来发展。如果该值上升，则将在未来罹患神经退行性疾病。由此鉴定的个体可以进行进一步的诊断或治疗方法，包括进一步的血液或csf测试、成像方法、认知测试或治疗，特别是预防性治疗。本领域技术人员将能够根据现行国家的医疗实践选择合适的手段。

在一个实施例中，如果相对于对照值，值量上升至少110％、更优选至少120％、更优选至少130％、更优选至少140％、更优选至少150％、更优选至少160％、更优选至少170％、更优选至少180％、甚至更优选至少190％，则该值上升。

或者，在对照组或对照群体中测量的nfl值例如用于建立临界值或参考范围。高于这种临界值或在参考范围外部及其较高端以外的值被认为是上升的。在一个实施例中，建立固定的临界值。该临界值的选取匹配诊断或预测的目标问题。在一个实施例中，在对照组或对照群体中测量的nfl值用于建立参考范围。在一个优选实施方式中，如果测量的值高于参考范围的90％百分位，则认为nfl浓度增加。在进一步优选的实施方式中，如果测量的值高于参考范围的95％百分位、96％百分位、97％百分位或97.5％百分位，则认为nfl的值上升。临界值可以代表区分具有罹患神经退行性疾病风险的个体与不具有罹患神经退行性疾病风险的个体的适当值。

可根据所需的灵敏度和特异性选择合适的临界值。灵敏度和特异性是二分类检验性能的统计量度，在统计学中也称为分类函数：

灵敏度(也称为真阳性率)测量正确鉴定的阳性的比例(例如，具有罹患神经退行性疾病的风险的人被正确鉴定为具有风险的百分比)。

特异性(也称为真阴性率)测量正确鉴定的阴性的比例(例如，没有罹患神经退行性疾病的风险的人被正确鉴定为没有风险的百分比)。

对于任何检验，通常在上述量度之间进行权衡。例如，在机场安全设置中，人们正在测试潜在的安全威胁，扫描仪可能会设置为触发低风险项目，如皮带扣和钥匙(低特异性)，以减少遗漏对飞机和登机的人构成威胁的物体的风险(高灵敏度)。这种权衡可以图形表示为接收器操作特性曲线。完美的预测因素会被描述为100％灵敏(例如，所有处于风险中的个体被鉴定为处于风险中的个体)并且100％特异性(例如，所有健康个体未被鉴定为处于风险中的个体)；然而，理论上任何预测因素都将具有称为贝叶斯错误率的最小误差界限。可以设置临界值以增加灵敏度或特异性。

在统计学中，接收者操作特性(roc)或roc曲线是显示二分类器系统的性能的图形图，因为其辨别阈值是变化的。通过在各种阈值设置下绘制真阳性率(tpr)与假阳性率(fpr)来创建曲线。如上所述，真阳性率也称为灵敏度或灵敏度指数d′，在信号检测和生物医学信息学中被称为“d-prime”，或在机器学习中被称为召回率。假阳性率也称为误诊率，可以计算为(1-特异性)。roc曲线比较了一系列值的灵敏度与特异性，以显示其预测二分类结果的能力。曲线下面积(auc表示比较测试性能的总体准确度(florkowskicm，2008，clinbiochemrev29(增刊1)：s83-s87)。灵敏度是指测试将个体正确分类为患病的能力。测试将个体正确分类为无疾病或无风险的能力称为特异性。

roc分析提供了用于选择可能的最优模型并且摒弃次优模型的工具，这种选择独立于(并且先于指定)成本因素或类别的分布情况。roc分析以直接和自然的方式与进行诊断决策的成本/效益分析相关。

在本发明的另一个优选实施例中，在不同时间重复该方法以监测个体或预防性治疗。

该方法可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同时间重复。由此，可以建立时间进程，其使得可以监测个体。时间间隔可以不同，例如，可以是1天至20年之间的时间间隔，例如1个月至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年之间的时间间隔。此外，在2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同时间重复该方法的情况下，时间间隔可以不同。例如，对照可以是健康对照个体或健康对照群组，或者可以在相应的较早时间点来自同一个体，例如在第一时间点来自同一个体。如果随着时间的推移确定nfl的值上升，则罹患神经退行性疾病的风险进一步增加；而如果在后时间点的值恒定或降低则指示罹患神经退行性疾病的风险不会进一步增加，或会降低。

在患者接受预防性治疗的情况下，例如用治疗有效量的抗aβ寡聚体抗体(例如aducanumab)或认知增强剂(例如美金刚)治疗，该方法可用于监测预防性治疗。如果随着时间的推移确定nfl的值上升，则罹患神经退行性疾病的风险进一步增加，表明预防性治疗不成功，而如果值恒定或降低则表明罹患神经退行性疾病的风险不会进一步增加，或会减少，表明预防性治疗是成功的。

如实施例中所示，nfl可意外地用于检测个体罹患神经退行性疾病的风险。特别地，相对于对照，从个体获得的样品中nfl的值上升指示该疾病的未来发展。

因此，在另一个实施方式中，本发明涉及nfl用于检测个体罹患神经退行性疾病风险的用途，其中相对于对照，从个体获得的样品中上升的nfl值指示该疾病的未来发展。该用途优选为体外用途。

在一个优选实施方式中，用途如本发明方法所述进一步定义。因此，本文关于本发明方法所公开的实施方式也适用于本发明的用途。特别是，阿尔茨海默病是一种优选的神经退行性疾病。

优选地，本发明涉及nfl蛋白用于检测有症状前的人类个体罹患阿尔茨海默病风险的用途，其中相对于对照，从个体获得的血液样品中上升的nfl蛋白的值指示阿尔茨海默病的未来发展，特别是其中该用途如上文在本发明方法的上下文中所述进一步定义。

标志物nfl可以进一步帮助医师检测个体罹患神经退行性疾病的风险。

因此，在又一个实施例中，本发明涉及帮助检测个体罹患阿尔茨海默病的风险的方法，其包括

a)接收样品，

b)测量所述样品中神经丝轻链(nfl)的量或浓度；和

c)向医师提供关于步骤(b)中测定的nfl的量或浓度的信息，从而帮助检测个体罹患阿尔茨海默病的风险。

特别地，生化实验室、医师、经培训的实验室人员或自动分析系统可以接收步骤a)中待测试的个体样品，例如脑脊液或血液样品，优选血清、血浆、全血或在外周血中循环的颗粒，例如外泌体，更优选血清。可以通过递送给实验室、医师、经培训的实验室人员或自动分析系统来接收这样的样品，例如通过手动或自动转移、快递或邮递。通常，样品处于合适的容器中被接收，例如任选密封的容器或注射器。在步骤a)中接收的样品可以是未处理的或处理过的。处理过的样品包括纯化(例如离心分离)、浓缩、稀释、细胞成分溶解、冷冻、酸化、保存等后可获得的样品。优选的样品是血清、血浆、全血或在外周血中循环的颗粒，例如外泌体，其中血清代表最优选的样品类型。例如，可以在步骤b)之前冷却和/或冷冻所接收的样品。

随后，如上详述，在所述样品中测量神经丝轻链(nfl)的量或浓度。

随后将关于步骤(b)中测定的nfl的量或浓度的信息提供给医师。提供信息可以通过适合于此目的的任何手段来实现，例如通过电子、书面、视觉和/或口头手段。例如，关于量或浓度的信息可以电子方式提供，例如，通过电子邮件或通过传送包含存储在其上的信息的电子存储介质。此外，可以传递包含所述信息的书面报告或视觉上提所述供信息的展示。此外，可以口头提供信息，例如在电话中。因此，所提供的信息有助于医师检测个体罹患神经退行性疾病的风险。例如，在医师发现nfl的量或浓度相对于对照上升的情况下，医师将鉴定患者罹患疾病的风险指示疾病的未来发展。如上所述，医师可以适当地选择适当的对照。例如，关于对照值的信息可以从健康对照个体或健康对照群组获得，或者在较早时间点从同一个体获得。由于nfl的量或浓度与疾病的一种或多种症状的发作前的时间相关，所以医师可以在获得步骤c)中的信息时确定疾病的一种或多种症状的发作前的时间。特别地，所述方法能够在一种或多种症状发作之前至少一年，优选至少两年，更优选至少三年，再更优选四年，最优选至少五年检测疾病的发作。在一个优选实施例中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病，特别是家族性阿尔茨海默病。

在一个优选实施方式中，所述方法如本发明的检测个体罹患神经退行性疾病风险的方法中所述进一步定义。

因此，本文关于本发明的检测个体罹患神经退行性疾病风险的方法所公开的实施方式也适用于本发明的帮助检测个体罹患神经退行性疾病风险的方法。

优选地，本发明涉及帮助检测有症状前的人类个体罹患阿尔茨海默病的风险的方法，其包括

a)接收血液样品，

b)测量所述样品中神经丝轻链(nfl)蛋白的量或浓度；和

c)向医师提供关于步骤b)中测定的nfl蛋白的量或浓度的信息，从而帮助检测个体罹患阿尔茨海默病的风险，

特别是其中所述方法如上文在本发明方法的上下文中所述进一步定义。

在又一个实施方式中，本发明涉及预防和/或治疗个体的神经退行性病症的方法，所述方法包括

i)检测个体罹患神经退行性疾病的风险，包括以下步骤：

a)测量从个体获得的样品中神经丝轻链(nfl)的量或浓度；和

b)通过比较步骤(a)中测定的量或浓度与对照中nfl的量或浓度来检测个体罹患疾病的风险，

其中相对于对照，上升的nfl的值指示疾病的未来发展，

ii)如果在步骤i)中个体被鉴定为具有罹患疾病的风险，则向个体实施治疗和/或预防性治疗。

例如，可以向患者施用治疗有效量的适于预防或治疗疾病的药剂。例如，治疗或预防有效量的抗aβ寡聚体抗体(例如aducanumab)或认知增强剂(例如美金刚)可以施用于通过本发明方法被鉴定为具有罹患ad风险的个体。本领域技术人员知道治疗有效剂量和剂量方案以及这些药剂的制剂。例如，美金刚可以配制成片剂或滴剂。此外，可以每天施用约1mg至50mg，例如20mg美金刚。此外，适用于预防或治疗其他神经退行性疾病的药剂是本领域技术人员已知的。

在一个优选实施方式中，所述方法如本发明的其他方法所述进一步定义。因此，本文关于本发明的检测个体罹患神经退行性疾病的风险的方法所公开的实施方式也适用于本发明的预防和/或治疗神经退行性病症的方法。特别是，阿尔茨海默病是一种优选的神经退行性疾病。

总的来说，本公开不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。此外，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制本公开的范围。如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。类似地，词语“包含”、“含有”和“涵盖”将应作开放性地解释而不是封闭性地解释。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩略词具有与本公开领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料都可用于本文所述的实践中，但本文描述了具体的方法和材料。

在关于值的上下文中，术语“约”是指值±10％，优选值±5％。

图和表

图1：三组血清nfl的箱须图。

图2：相对于eyo的血清nfl的散点图。突变携带者由点表示，非携带者由叉表示。图中拟合了未调整的回归线。任何可能鉴定并因此确定其突变状态的个体参与者已从图中去除以确保维持遗传盲法(但回归线考虑所有参与者，包括未显示的那些参与者)。·：突变携带者。x：非携带者。

图3：相对于认知和成像测量的血清nfl的散点图。图中拟合了未调整的回归线。

图4：表1：参与者人口统计学、认知测试分数、成像测量和血清nfl浓度。所有值都是组均值(带sd)。量度未根据任何协变量修正。

图5：表2：生物标志物与eyo之间的症状前相关性。相对于eyo的血清nfl、认知测试评分和成像测量的spearman相关系数，仅在有症状前参与者中。为了允许在不同量度之间进行直接比较，仅包括可获得成像测量的13个有症状前的突变携带者。

图6：来自表1中描述的32名受试者的纵向数据。在两个时间点对这些受试者(由虚线表示的突变携带者和由实线表示的非突变携带者)进行取样。两个采样时间点之间的时间由线的长度表示。在常染色体显性家族性ad(fad)突变携带者的症状发作前估计年数(eyo)之前约5至10年，血清nfl浓度开始增加。

实施例

方法

招募了来自受psen1或app中基因突变影响的家系的48个个体。18名参与者患有有症状的家族性ad，30名参与者无症状，但未来患有有症状的疾病的风险为50％。对于每个参与者，使用单分子阵列(simoa)平台上的超灵敏免疫测定法测量血清nfl。还进行了结构mri和许多认知测量。33个个体进行了第二次mri扫描(平均间隔±sd＝1.33±0.46年)，可以计算萎缩率。进行基因测试以推断是否存在突变。使用广义最小二乘回归模型来比较有症状的突变携带者、有症状前的突变携带者和非携带者之间的血清nfl。spearman相关系数评估血清nfl与1)症状发作前估计年数(eyo)，2)认知测量和3)脑萎缩的成像测量之间的关联。

研究设计和参与者

我们在2010年至2015年期间从fad家系招募了48名参与者，参加了伦敦大学学院痴呆研究中心的fad生物标志物研究。18名参与者患有有症状的fad，其在psen1或app基因中有致病突变；30个个体无症状，但由于具有患病父母，未来罹患有症状的疾病的风险为50％。对于所有参与者，进行基因测试以确定是否存在突变。遗传数据仅提供给进行统计分析的指定个体，从而确保参与者、评估他们的临床医师和进行实验室分析的人仍然不清楚其遗传状态。

每位参与者都接受了血液采样、脑磁共振成像(mri)、神经系统检查和认知评估，所有评估都在血样采集后的四个月内完成。认知评估包括wechsler智力缩简量表(wasi)(wechslerd.wasi：wechslerabbreviatedscaleofintelligence.hove：psychologicalcorporation，1999)、国家成人阅读测试(nart)(预测的病前iq的量度)、面部和单词的识别记忆测试(rmt)、迷你精神状态检查(mmse)。所有个体都确定了一位密切的信息提供者，对其单独会谈以获得附带病史(collateralhistory)。临床痴呆评定量表(cdr)用于提供临床严重性的进一步的估计，其并入了来自参与者和信息提供者的信息。计算了整体cdr和cdr总和分数(sob)。如果整体cdr＞0并且参与者和/或其信息提供者报告了一致的认知衰退症状，则将个体定义为有症状的。通过从患病父母首次出现进行性认知症状的年龄减去参与者的当前年龄来计算突变携带者的症状发作前估计年数(eyo)。

血清nfl浓度的测量

从每个参与者收集血清样品，然后根据标准化程序处理，等分并在-80℃冷冻。使用来自umandiagnostics(umandiagnostics，sweden)的nf轻链测定法测量血清nfl浓度，使用自制试剂盒(quanterixcorp，boston，ma，usa)转移到simoa平台上，并且可以在simoa自制测定法开发指南(quanterix)中找到详细说明。简而言之，通过向具有1·4×10⁶个珠子/微升的磁珠溶液中添加5％(v/v)10mg/ml1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(edac，目录号：100022，quanterix)来活化顺磁性羧化珠(目录号：100451，quanterix)。在室温(rt)下培育30分钟后，使用磁力分离器洗涤珠子并添加初始体积(即先前步骤中的edac+珠溶液体积)的0·3mg/ml冰冷的捕获抗体溶液(ud1，umandiagnostics)。在室温下在混合器(2000rpm，multi-tubevortexer，allsheng，china)上培育2小时后，洗涤珠子并加入初始反应体积的封闭溶液。洗涤三次后，将缀合的珠子悬浮并在4℃下储存待分析。在分析之前，将珠子在珠子稀释剂中稀释至2500个珠子/微升。通过添加3％(v/v)3.4mmez-link^tmnhs-peg4-生物素(quanterix)，然后在室温下孵育30分钟，将检测抗体(1mg/ml，ud2，umandiagnostics)生物素化。使用旋转过滤(ultra-2，50kd，sigma)去除游离生物素，并将生物素化抗体储存在4℃待分析。在simoahd-1仪器(quanterix)上使用2步测定稀释方案测定两份实验重复血清样品：首先，从100μl缀合的珠子(2500个珠子/微升)中吸出珠子稀释剂，然后将20μl生物素化抗体(0.1μg/ml)和100μl4倍稀释样品(或未稀释的校准品)加入到珠粒中。对于样品和校准品，使用相同的稀释剂[pbs；0.1％tween-20；2％bsa；10μg/mltrublock(meridianlifescience，inc.，memphis，tn，usa)]。在培育47个步调(1个步调＝45秒)后，洗涤珠子，然后加入100μl链霉抗生物素蛋白缀合的β-半乳糖苷酶(150pm，目录号：100439，quanterix)。然后进行7个步调的培育和洗涤。在读取之前，加入25μl试卤灵β-d-吡喃半乳糖苷(目录号：100017，quanterix)。使用来自nflelisa(umandiagnostics)的标准品以三份实验重复构建校准曲线。由空白样品(样品稀释剂)+3和10个标准偏差信号得到的浓度界定的检测和定量下限分别为0.97和2.93pg/ml。对于浓度为13.0pg/ml的qc样品，重复性为14.0％，中间精度为15.7％。对于浓度为131.8pg/ml的qc样品，重复性为13.3％，中间精度为13.3％。所有测量均在同一轮实验中完成，采用同一批试剂，并由经过委员会认证的实验室技术人员进行，他们对临床数据不知情。

mri采集和分析

在48名参与者中的33名获得了连续mri扫描，首先是在血液样本采集时扫描，然后在大约1年后再次扫描(平均间隔±sd＝1.33±0.46年)。所有扫描均使用32通道相控阵头部线圈在相同的3tsiemenstimtrio扫描仪上进行。获得矢状3dmp-raget1加权体积mri(回波时间/重复时间/反转时间＝2.9/2200/900ms，尺寸为256×256×208，体素尺寸为1.1×1.1×1.1mm)。目视检查图像的伪影。使用半自动方法计算全脑和脑室容积(freeboroughpa，foxnc，kitneyri.interactivealgorithmsforthesegmentationandquantitationof3-dmribrainscans.computmethodsprogramsbiomed1997；53：15-25)。针对总颅内容积(tiv)校正所有容积。使用边界移位间隔(bsi)计算扫描间隔期间的全脑和脑室容积变化的年化率，bsi是一种基于配准的主体容积变化的方法(freeboroughpa，foxnc.theboundaryshiftintegral：anaccurateandrobustmeasureofcerebralvolumechangesfromregisteredrepeatmri.ieeetransmedimaging1997；16：623-629)。

统计分析

该研究的主要目的是比较有症状的突变携带者、有症状前的突变携带者和健康对照(即基因阴性家族成员)之间的血清nfl。使用广义最小二乘线性回归模型，其不假设残差的恒定方差，用于比较组间的nfl，调整年龄和性别(t-检验/anova模型的扩展，允许每组中有不同方差)。平均值的成对差异用于检查每对组之间nfl差异的证据。没有对多个测试进行调整。

计算spearman相关系数以评估eyo和nfl之间的关系，首先是在所有突变携带者之间，然后仅在有症状前的携带者中。这种方法也用于nfl和认知测量，包括估计的iq变化(通过从wasi测量的实际iq中减去nart测量的预测的病前iq)、识别记忆(rmt面部和rmt词语的平均分数)、mmse和cdrsob。最后，我们评估了nfl与结构神经成像测量之间是否存在任何相关性。

我们计算了针对eyo的每种成像测量的spearman相关系数，仅包括有症状前的参与者。为了使结果可以与血清nfl进行对比，我们还重复了针对eyo的血清nfl的分析，但这次仅包括也已进行成像的有症状前的个体。

结果

参与者的人口统计学详细信息、认知测试分数、神经成像测量和血清nfl值显示在图4的表1和图1中。

有症状前的突变携带者的平均eyo为9.6年。调整年龄和性别，有症状的突变携带者的血清nfl浓度显著高于有症状前的突变携带者(p＜0.0001)和非携带者对照(p＜0.0001)。有症状前的突变携带者的nfl水平显著高于对照(16.7pg/ml对比12.7pg/ml，p＝0.007)。

如图2所示，在所有突变携带者中，eyo与血清nfl相关。(spearman的r＝0.81，p＜0.0001)。图3显示了针对不同认知和成像测量的血清nfl的散点图。血清nfl与认知测量值之间存在显著相关性，包括mmse(r＝-0.62，p＝0.0001)、cdr总和分数(r＝0.79，p＜0.0001)和估计的iq变化(r＝-0.48，p＝0.005)，与识别记忆得分仅有趋势(r＝-0.34，p＝0.056)。在突变携带者中，突变携带者的nfl与神经成像测量之间存在显著相关性，包括基线全脑容积(r＝-0.66，p＝0.0005)、基线脑室容积(r＝0.57，p＝0.005)，随后的全脑容积变化率(r＝0.54，p＝0.0091)，以及随后的脑室容积变化率(r＝0.58，p＝0.005)。

当仅包括有症状前的参与者时，nfl和eyo之间仍然存在显著相关性(r＝0.55，p＝0.014)。nfl与基线脑室容量之间也存在显著相关性，但与其他任何神经成像或认知测量无相关性。

当仅包括也已进行系列成像的13个有症状前的个体时，血清nfl和eyo之间仍然存在显著相关性(r＝0.73，p＝0.005)。然而，当在相同的13个有症状前的个体中评估四种成像测量值中的每一种和eyo之间的相关性时，它们中没有一个是统计学上显著的(图5中的表2)。

来自上述32名受试者采集的两个时间点的样品的纵向数据显示，在突变携带者的eyo之前约5至10年，血清nfl浓度开始增加(图6)。

讨论

使用最近开发的超灵敏免疫测定法，我们发现在fad中血清nfl浓度升高，并在症状发作前升高。在有症状和有症状前的突变携带者中都发现了升高的nfl水平；有症状前的个体距预测的症状发作平均九年。血清nfl与疾病分期(eyo)的替代量度cdrsob和各种认知测量显著相关。在横断面容积和随后的萎缩率方面，血清nfl和ad相关神经退化的神经成像标志物之间也存在相关性。这表明血清nfl浓度不仅反映了疾病的存在与否，还可以提供与疾病严重程度和/或损失程度有关的信息。

我们在有症状的fad中测量的血清nfl浓度似乎与先前散发性ad的研究中测量的那些相似(gaiottinoj等，见上文；bacioglum.等，见上文)。然而，在这里我们意外地展示了血清nfl的增加在有症状的疾病发作之前数年开始，并且与症状发作前的时间相关。我们观察到的有症状前的渐进性上升，与所提出的有症状前的ad神经退化模型一致(jackcr，jr.，knopmands，jagustwj等，hypotheticalmodelofdynamicbiomarkersofthealzheimer′spathologicalcascade.lancetneurol2010；9：119-128)，nfl升高可能反映早期轴突破坏(sjogrenm，blombergm，jonssonm等，neurofilamentproteinincerebrospinalfluid：amarkerofwhitematterchanges.jneuroscires2001；66：510-516)。

血清nfl与已知对ad相关衰退敏感的认知测量相关这一发现支持nfl的临床相关性。虽然fad的早期认知变化是相对集中的，最常涉及情景记忆(foxnc，warringtonek，seifferal，agnewsk，rossormn.pre-symptomaticcognitivedeficitsinindividualsatriskoffamilialalzheimer′sdisease.alongitudinalprospectivestudy.brain1998；121(pt9)：1631-1639)，但我们发现血清nfl与整体认知测量的相关性高于记忆得分。这可能与nfl在整个大脑中作为轴突稳定性的重要组成部分有关，最初的上升可能反映出神经网络的细微而普遍的损坏(warrenjd，rohrerjd，schottjm，foxnc，hardyj，rossormn.molecularnexopathies：anewparadigmofneurodegenerativedisease.trendsneurosci2013；36：561-569)，而不是局灶性萎缩。

血清nfl水平升高反映整体而非局灶性神经退化的可能性也得到其与全脑和脑室萎缩的相关性的支持，其测量整体神经退化。

虽然血清nfl与疾病阶段(即eyo)即使在仅包括症状前组的情况下也相关，但成像和认知测量并不相关。这表明，与所使用的成像和认知测量不同，血清nfl足够灵敏以在该症状前的阶段显示出显著的进行性变化。因此，血清nfl可能比目前广泛使用的成像和认知测量对早期神经退化更灵敏。

当在具有轻度认知障碍的个体的csf中测量时，已发现nfl能预测随后向ad痴呆的进展(zetterbergh等，见上文)，最近的荟萃分析显示其具有与完善的csfad生物标志物aβ1-42、总tau和磷酸化tau相当的辨别力(olssonb等，见上文)。最近的研究比较了csf和血清中的血清nfl测量结果，表明它们密切相关，这意味着血清nfl可能同样具有预测随后进展的能力。

敲除nfl基因的fad小鼠模型研究发现，nfl缺陷显著增加ad相关的神经退化，从而突出了nfl在维持ad神经元结构中的核心作用(fernandez-martoscm，kingae，atkinsonra，woodhousea，vickersjc.neurofilamentlightgenedeletionexacerbatesamyloid，dystrophicneurite，andsynapticpathologyintheapp/ps1transgenicmodelofalzheimer′sdisease.neurobiolaging2015；36：2757-2767)。在app/ps1小鼠中，血液中的血清nfl水平已显示在疾病早期升高，并且与潜在的ad病理学的进展密切相关(bacioglum等，见上文)。此外，同一项研究显示，血清nfl浓度响应于抗aβ免疫治疗而下降；作者提出血清nfl可能是治疗反应的标志物。

鉴定可以在血液中测量的生物标志物具有明显的益处(consensusreportoftheworkinggroupon：″molecularandbiochemicalmarkersofalzheimer′sdisease″，见上文)。因此，近年来寻找灵敏的基于血液的ad生物标志物一直是一个备受关注的研究领域，已提出许多候选物(listas，o′bryantse，blennowk等，biomarkersinsporadicandfamilialalzheimer′sdisease.jalzheimersdis2015；47：291-317)。然而，最近对基于血液的标志物的全面荟萃分析显示，只有总tau能够可靠地将ad与健康对照区分开(olssonb.等，见上文；zetterbergh，wilsond，andreassonu等，plasmataulevelsinalzheimer′sdisease.alzheimersresther2013；5：9)；此外，血液tau仅被证明可用于鉴定已确定的痴呆病例中的ad，并且患者和对照组之间经常存在重叠(olssonb.等，见上文；listas等，见上文)。试图测量ad病理学的另一个核心分子标志物aβ水平的研究到目前为止产生了相互矛盾的结果，没有强有力的总体证据表明ad和对照之间存在差异(olssonb.等，见上文；listas等，见上文)。此外，由于脑aβ沉积被认为在有症状的疾病发作前一段时间处于稳定水平(villemagnevl等，见上文；batemanrj等，见上文)，所以它可能无法有效追踪疾病进展，除非在疾病的非常早期。因此，更接近地反映正在进行的(和整体)疾病活动的下游神经退化的标志物，例如nfl，作为临床试验结果量度可能更有用。

总之，在这里，我们首次使用新的超灵敏测定法显示了，即使在有症状的疾病之前，在fad中血清nfl浓度也增加，并且与预测症状发作前的年数相关。血清nfl还与疾病严重程度的神经成像和认知标志物相关。我们的研究结果支持使用血清nfl作为易于获得的早期ad相关神经退化生物标志物。

我们的研究首次评估了使用新的超灵敏测定法测量血清nfl以检测早期ad相关的神经退化的效用。我们的研究结果表明，血清nfl在临床症状发作前许多年升高。我们还展示了血清nfl与估计症状发作前的年数密切相关，表明它能够跟踪疾病进展。还发现血清nfl与当前经验证的ad严重性量度密切相关，包括萎缩的结构成像测量和认知测试评分。然而，在有症状前的时段，血清nfl可能比这些更成熟的量度对神经退化变化更灵敏。

在我们的研究之后，现在显而易见的是，血清nfl在有症状的疾病发作之前的10年期间逐渐升高并且与神经元丢失的其他标志物相关。因此，目前的证据支持在有症状前和有症状的疾病中使用血清nfl作为易于获得的ad神经退化生物标志物。