本发明属于重金属污染土壤修复技术领域，尤其涉及一种农田土壤中土著微生物对硫脲醛树脂降解性的评价方法。
背景技术：
因重金属污染土壤具有隐蔽性、长期性、很强的富集性和不可逆性等特点，严重影响土壤环境安全及人体健康，故而重金属污染的土壤修复治理工作受到广泛的关注。目前比较常用的治理技术为固化/稳定化方法，其主要原理为通过向被重金属污染的土壤中加入重金属钝化剂，使其中的重金属离子形成沉淀或转化为稳定的形态，达到降低重金属污染危害的目的。
硫脲醛树脂作为一种高效、廉价的新型重金属钝化剂，在土壤固化/稳定化修复方面具有增容小、不破坏土壤理化性质的优点，但其主要组成元素为C、H、O、N，向被污染的农田土壤介质中施用硫脲醛树脂，会被农田土壤微环境中的微生物降解利用，从而导致硫脲醛树脂被降解，已经钝化的重金属被重新释放，重金属污染问题重新出现。因此对于一种新型硫脲醛树脂钝化剂来说，确定其生物降解率是十分必要的。目前报道的关于固化/稳定化技术中新型重金属钝化剂的文献主要集中在对钝化剂固化效率的研究，缺少关于新型重金属钝化剂施加于土壤后的生物降解性的评价方法，在工程应用中也缺少简便精确的方法确定重金属钝化剂的生物降解性，来保证在修复重金属污染土壤时，不会因为钝化剂被降解而导致污染问题再次出现。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于评价硫脲醛树脂的生物降解性的方法，用于确定硫脲醛树脂用作土壤重金属钝化剂的重金属释放情况。
本发明的技术方案如下：
一种用于评价硫脲醛树脂的生物降解性的方法，配置硫脲醛树脂与重金属离子的螯合沉淀放入无碳源液体培养基，在无菌条件下，将从污染农田土壤中富集得到的微生物接种至上述灭菌培养基，以灭菌蒸馏水替代菌悬液设置空白对照，每3～5天为螯合沉淀更换新的无碳源培养基并重新接种菌悬液，同时测定被更换的旧培养基中的重金属含量，以重金属含量的变化率来反映硫脲醛树脂的生物降解性。
所述富集得到的微生物的方法是：从受污染农田中取适量土壤置于M9或LB液体培养基中，培养基所含营养物质能满足微生物生长所需即可；每2～3天更换一次培养基，每次从中弃去等量的土壤，10～15天后丢弃全部土壤完成微生物在液体培养基中的富集，用于后续步骤中的菌液接种。
所述配置硫脲醛树脂与重金属离子的螯合沉淀的方法是：向重金属储备液中加入硫脲醛树脂，震荡至不再生成沉淀，然后静置至螯合沉淀沉降完全；分离出上清液，然后将沉淀部分转移入离心管中并离心分离，分离出上清液与上步中的上清液合并；用蒸馏水洗涤沉淀，重复洗涤后将螯合沉淀进行冷冻干燥；检测上清液中未被硫脲醛树脂固定的重金属含量。
具体说明如下：
上述的富集受污染农田土壤中的土著微生物：从受污染农田中取适量土壤置于M9或LB(Luria-Bertani)液体培养基中，培养基所含营养物质能满足微生物生长所需即可；每2～3天更换一次培养基，每次从中弃去等量的土壤，约10～15天后丢弃全部土壤完成微生物在液体培养基中的富集，用于后续步骤中的菌液接种；
上述的制备硫脲醛树脂与重金属离子的螯合沉淀用于硫脲醛树脂的降解实验；向重金属储备液中加入硫脲醛树脂，震荡至不再生成沉淀，然后静置至螯合沉淀沉降完全；分离出上清液，然后将沉淀部分转移入离心管中并离心分离，分离出上清液与上步中的上清液合并；用少量蒸馏水洗涤沉淀，重复洗涤3次后将螯合沉淀进行冷冻干燥；检测上清液中未被硫脲醛树脂固定的重金属含量；由于后续的实验分析需要确定螯合沉淀中被固定的重金属的初始含量，同时考虑到过剩的未参与螯合的硫脲醛树脂溶质可能在干燥过程中转变为固体形态，所以在制备螯合沉淀时应确保过滤后的上清液中仍有未被螯合的镉，以便于后续实验中确定螯合沉淀中的重金属含量；
按照M9或LB(Luria-Bertani)土壤微生物液体培养基配方，除去葡萄糖作为微生物降解硫脲醛树脂的无碳源液体培养。将螯合沉淀放入无碳源培养基中，在紫外灯下灭菌至少20min后接种菌悬液，接种的菌悬液的OD600值为0.8±0.05，同时用等体积的灭菌蒸馏水替代菌悬液设置空白组。每3～5天为螯合沉淀更换新的无碳源培养基并重新接种菌悬液，同时测定被更换的旧培养基中的重金属含量，连续培养30天。由于硫脲醛树脂是通过官能团的配位作用来实现对重金属的螯合，故可以通过公式(1)计算出硫脲醛树脂的生物降解率。
生物降解率＝(C0-C1)/C0*100％ (1)
式中：C0—被固定的重金属的初始含量；
C1—因微生物降解而释放的重金属量。
生物降解率的大小即可以体现出硫脲醛树脂的生物降解性。
本发明的优点在于：
1、本发明适用于硫脲醛树脂作为新型重金属钝化剂施用于环境前的生物降解性评估，对污染农田土壤的土著微生物进行富集作为实验用菌，测定结果的针对性更强。
2、通常情况下，钝化剂的生物降解性只是在土壤中应用时测定，即需要消解测定重金属释放量。而本发明方法采用螯合沉淀分离，并与微生物一起在液体培养基中培养，达到了微生物降解螯合沉淀目的，相比于土壤条件，液体条件更适于重金属的测定，故在液体条件下测定硫脲醛树脂的生物降解性更为方便可靠。
附图说明
图1是本方法测定某种硫脲醛树脂的生物降解性的结果。
具体实施方式
测定硫脲醛树脂生物降解性的方法实施实例，以下实施方式和实施例旨在进一步说明本发明，而不是对本发明的限定。
具体步骤如下：
1)富集受污染农田土壤中的土著微生物：从受污染农田中取适量土壤置于M9或LB(Luria-Bertani)液体培养基中，培养基所含营养物质能满足微生物生长所需即可；每2～3天更换一次培养基，每次从中弃去等量的土壤，约10～15天后丢弃全部土壤完成微生物在液体培养基中的富集，用于后续步骤中的菌液接种；
2)制备硫脲醛树脂与重金属离子的螯合沉淀用于硫脲醛树脂的降解实验。向重金属储备液中加入硫脲醛树脂，震荡至不再生成沉淀，然后静置至螯合沉淀沉降完全；分离出上清液，然后将沉淀部分转移入离心管中并离心分离，分离出上清液与上步中的上清液合并；用少量蒸馏水洗涤沉淀，重复洗涤3次后将螯合沉淀进行冷冻干燥；检测上清液中未被硫脲醛树脂固定的重金属含量；由于后续的实验分析需要确定螯合沉淀中被固定的重金属的初始含量，同时考虑到过剩的未参与螯合的硫脲醛树脂溶质可能在干燥过程中转变为固体形态，所以在制备螯合沉淀时应确保过滤后的上清液中仍有未被螯合的镉，以便于后续实验中确定螯合沉淀中的重金属含量；
3)按照M9或LB(Luria-Bertani)土壤微生物液体培养基配方，除去葡萄糖作为微生物降解硫脲醛树脂的无碳源液体培养。将螯合沉淀放入无碳源培养基中，在紫外灯下灭菌至少20min后接种菌悬液，接种的菌悬液的OD600值为0.8±0.05，同时用等体积的灭菌蒸馏水替代菌悬液设置空白组。每3～5天为螯合沉淀更换新的无碳源培养基并重新接种菌悬液，同时测定被更换的旧培养基中的重金属含量，连续培养30天。由于硫脲醛树脂是通过官能团的配位作用来实现对重金属的螯合，故可以通过公式(1)计算出硫脲醛树脂的生物降解率。
生物降解率＝(C0-C1)/C0*100％ (1)
式中：C0—被固定的重金属的初始含量；
C1—因微生物降解而释放的重金属量。
生物降解率的大小即可以体现出硫脲醛树脂的生物降解性。
实施例1：
1)富集受污染农田中的土著微生物，取100g受污染农田土壤置于液体培养基中，富集培养使用M9液体培养基，每3天更换一次培养基并丢弃20g土壤，15天后丢弃全部土壤完成微生物在液体培养基中的富集，以备用于接种。
2)向50mL1mg/L的镉储备液中加入1mL硫脲醛树脂，震荡至不再生成沉淀，然后静置至螯合沉淀沉降完全。过滤并将螯合沉淀转移入20mL离心管中，用10mL蒸馏水洗涤螯合沉淀并在3000r/min下离心分离15min，重复洗涤3次后将螯合沉淀进行冷冻干燥。合并滤液和洗涤后离心分离得到的上清液，用双硫腙分光光度发检测未被硫脲醛树脂螯合的Cd含量。
3)按照土壤微生物液体培养基配方，除去葡萄糖作为好氧和厌氧微生物降解硫脲醛树脂的无碳源培养液。将螯合沉淀放入100mL M9液体无碳源培养基中，在紫外灯下灭菌20min后接种5mL菌悬液，接种的菌悬液的OD600值为0.8±0.05。同时用等体积的灭菌蒸馏水替代菌悬液设置空白组。每3天为螯合沉淀更换新的无碳源培养基并重新接种菌悬液，同时测定被更换的旧培养基中的Cd含量，共培养30天。通过计算硫脲醛树脂的生物降解率为16.14％，即可以认为硫脲醛的生物降解性不会造成重金属的二次释放污染。
实施例2：
1)富集受污染农田中的土著微生物，取200g受污染农田土壤置于液体培养基中，富集培养使用LB(Luria-Bertani)液体培养基，每2天更换一次培养基并丢弃40g土壤，10天后丢弃全部土壤完成微生物在液体培养基中的富集，以备用于接种。
2)向100mL 1mg/L的镉储备液中加入2mL硫脲醛树脂，震荡至不再生成沉淀，然后静置至螯合沉淀沉降完全。过滤并将螯合沉淀转移入50mL离心管中，用15mL蒸馏水洗涤螯合沉淀并在4000r/min下离心分离10min，重复洗涤3次后将螯合沉淀进行冷冻干燥。合并滤液和洗涤后离心分离得到的上清液，用双硫腙分光光度发检测未被硫脲醛树脂螯合的Cd含量。
3)按照土壤微生物液体培养基配方，除去葡萄糖作为好氧和厌氧微生物降解硫脲醛树脂的无碳源培养液。将螯合沉淀放入100mLLB(Luria-Bertani)液体无碳源培养基中，在紫外灯下灭菌20min后接种5mL菌悬液，接种的菌悬液的OD600值为0.8±0.05。同时用等体积的灭菌蒸馏水替代菌悬液设置空白组。每5天为螯合沉淀更换新的无碳源培养基并重新接种菌悬液，同时测定被更换的旧培养基中的Cd含量，实验组测得的Cd含量减去空白组即为因微生物降解而释放的Cd量。通过计算硫脲醛树脂的生物降解率为87.35％，即可以认为该种硫脲醛的生物降解性会造成重金属的二次释放污染。
实施例3：
1)富集受污染农田中的土著微生物，取200g受污染农田土壤置于液体培养基中，富集培养使用M9液体培养基，每3天更换一次培养基并丢弃40g土壤，15天后丢弃全部土壤完成微生物在液体培养基中的富集，以备用于接种。
2)向50mL 1mg/L的镉储备液中加入1mL硫脲醛树脂，震荡至不再生成沉淀，然后静置至螯合沉淀沉降完全。过滤并将螯合沉淀转移入20mL离心管中，用15mL蒸馏水洗涤螯合沉淀并在3000r/min下离心分离15min，重复洗涤3次后将螯合沉淀进行冷冻干燥。合并滤液和洗涤后离心分离得到的上清液，用双硫腙分光光度发检测未被硫脲醛树脂螯合的Cd含量。
3)按照土壤微生物液体培养基配方，除去葡萄糖作为好氧和厌氧微生物降解硫脲醛树脂的无碳源培养液。将螯合沉淀放入100mLM9液体无碳源培养基中，在紫外灯下灭菌20min后接种5mL菌悬液，接种的菌悬液的OD600值为0.8±0.05。同时用等体积的灭菌蒸馏水替代菌悬液设置空白组。每3天为螯合沉淀更换新的无碳源培养基并重新接种菌悬液，同时测定被更换的旧培养基中的Cd含量，实验组测得的Cd含量减去空白组即为因微生物降解而释放的Cd量。通过计算硫脲醛树脂的生物降解率为16.14％，即可以认为硫脲醛的生物降解性不会造成重金属的二次释放污染。
某种硫脲醛树脂微生物降解性按实施例1的测试结果见图1。由图可知，在培养30天时，硫脲醛树脂的生物降解率为16.14％，即可以认为硫脲醛的生物降解性不会造成重金属的二次释放污染。
本发明提出的评价硫脲醛树脂生物降解性的方法，已通过实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的制作方法进行改动或适当变更与组合，来实现本方法。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。