本发明涉及一种茶中糖苷结合态香气前体物质的检测方法，具体的说是一种利用超高压液相色谱-质谱/质谱(UPLC-MS/MS)多反应监测模式(MRM)直接对茶树鲜叶、茶叶在制品以及干茶的糖苷结合态香气前体物质进行快速、高效检测的方法。
背景技术：
香气是重要的茶叶品质因子。茶中的香气成分主要包括醇类、醛类、酮类、酯类、杂环化合物等，其中醇类化合物是最为重要的香气组份。茶叶醇类香气物质又可分为萜烯醇、芳香醇和脂肪醇三类化合物，而且萜烯醇和芳香醇常具有花香特征，对茶叶的香气品质有重要贡献。茶叶中常见的萜烯醇有芳樟醇、芳樟醇氧化物(I、II、III、IV)、香叶醇、橙花醇、橙花叔醇等，芳香醇有苯甲醇和苯乙醇等，脂肪醇有顺3-己烯醇、庚醇、辛醇等。已有研究证实，成品茶香气主要有4种来源，其一为糖苷结合态前体水解、释放出挥发性香气，其二为长链脂肪酸通过脂氧合酶催化或自由基氧化途径形成挥发性短链脂肪醇，其三为在湿热作用下通过羰氨反应形成吡嗪、吡喃等杂环化合物，其四为茶鲜叶中既已存在的游离态香气物质，其中糖苷结合态前体水解是茶叶香气形成的最关键途径。因此糖苷结合态前体是茶叶香气潜力的重要表征成分，糖苷结合态香气前体的快速提取和准确检测方法建立对茶树品种香气品质潜力客观评价以及高香茶叶栽培加工配套技术开发有重要意义。
虽然糖苷结合态前体物质对茶叶香气贡献显著，但这类物质在茶鲜叶或者成品茶中丰度很低，分离和纯化非常困难，而且这类物质紫外吸收弱、甚至无紫外吸收，因而较难直接、准确地定性和定量。目前，茶叶糖苷结合态香气前体物质的检测主要采用酶解与气相-质谱联用(GC-MS)相结合方法、或者糖苷结合态香气前体衍生与GC-MS相结合方法、或者采用超高压液相色谱-质谱(UPLC-MS)单离子监测模式(SIM)方法等进行。其中，酶解与GC-MS检测技术，需要将茶样品中的游离态和糖苷结合态香气前体用水或缓冲液浸提出来、并用乙醚等溶剂反复萃取除去游离态的香气物质，将含有糖苷结合态香气前体的提取液与葡萄糖苷酶或果胶酶等混合、水解并释放香气物质，再用固相微萃取(SPME)或同时蒸馏萃取(SDE)等方式富集香气物质，进而通过GC-MS对萃取的香气物质进行定性和定量，这种测定方法只能间接推定结合态糖苷前体的苷元性质，不能获得糖基的信息，而且在糖苷酶解以及释放的香气富集过程中往往还存在水解不彻底、富集不完全等问题。糖苷结合态香气前体衍生与GC-MS结合分析法，主要过程为，提取和纯化茶叶等样品中的糖苷结合态香气前体，并充分干燥后与三氟乙酰胺试剂或硅烷化试剂混合进行衍生化处理引入挥发性乙酰基或硅烷基团，经GC-MS分析对衍生转化后的前体物质进行定性和定量；该方法可以获得糖苷结合态香气前体的较为完整的结构信息，但是纯化前体物质过程繁琐，而且分析数据后续处理复杂，因为GC-MS获得的是衍生后的糖苷物质信息，还需要解卷积等过程还原获得的原始糖苷前体信息。利用UPLC-MS的SIM检测糖苷结合态香气前体时，需要将茶叶中的糖苷结合态香气前体浸提出来、并通过柱层析等手段纯化后，经UPLC分离，根据糖苷结合态前体分子量特点采用SIM对单个目标物进行信号采集和定量；这种方法虽然可以直接测定糖苷结合态香气前体物质，但是，前体物质提取和纯化过程繁琐，需要尽可能多的去掉干扰性杂质，因为在前体提取物中往往存在分子量相似的干扰物质；而且这种分析方法通量低，每次只能检测一种糖苷结合态香气前体物质，一个样品需要经过多次检测才能将所含前体物质完全检测出来。到目前为止，尚缺乏快速直接的茶叶糖苷结合态香气前体物质的高效检测方法。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种可以同时检测茶叶9种糖苷结合态香气前体物质的方法。该方法具有样品用量少、提取操作简单、分析快速高效、适用范围广等优点。
为了解决该技术问题，本发明提供一种直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法(即，利用UPLC-MS/MS MRM模式同时检测9种糖苷结合态香气前体物质的方法)，以茶鲜叶、或茶在制品、或成品茶作为待测样品，依次进行以下步骤：
1)、待测样品中糖苷结合态香气前体提取：
将相当于0.05-0.1g干重的待测样品利用20mL提取剂进行提取，提取液经离心，得上清液；所述提取剂为预冷(-5℃)的体积浓度为90-95％甲醇；
在上清液中添加3μg 4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷作为内标，并加入0.1-0.2g经超纯水预溶胀的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP充分混匀(以沉淀多酚)，静置后离心(静置时间为60min，10000±2000r/min离心10±2min)，离心所得的上清浓缩至干，得浸膏(为含糖苷结合态香气前体物质的浸膏)；将浸膏溶于1-2mL超纯水中，并过0.22μm微孔滤膜，得茶叶糖苷结合态香气前体提取物；
2)、提取物中糖苷结合态香气前体UPLC-MS/MS分析：
以UPLC HSST3色谱柱(150mm×2.1mm，1.8μ)为分析柱，柱温35℃，进样量5ul；以甲酸/水(0.05/99.95，v/v)为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.3ml/min，洗脱时间程序为0-3min B相保持10％、3.01-15min B相从10％增加至20％、15.01-20min B相从20％增加至35％、20.01-22min B相从35％增加至90％、22.01-24min B相保持90％、24.01-26min B相保持10％；
MS分析条件为：电喷雾ESI负电离模式、毛细管电压3KV、二级锥孔电压3V、透镜电压0.2V、离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃、脱溶剂气流量800L/h、锥孔气流量60L/h、锥孔电压25V、碰撞气氩气流速0.25mL/min、扫描质荷比范围为100～700m/z、数据采集时间为26min；
在4-9min对应的通道1中以离子对346/138检测内标4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、以离子对447/269检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对491/293检测水杨酸甲酯樱草糖苷，在7-13min对应的通道2中以离子对461/149检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对439/149检测顺3-己烯醇樱草糖苷、以离子对509/331检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在13-17min对应的通道3中以离子对509/331检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在17-23min对应的通道4中以离子对493/161检测芳樟醇樱草糖苷、以离子对493/149检测香叶醇樱草糖苷；
具体而言，在上述UPLC分离和MS分析条件下，可检测到4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷内标以及茶叶苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物(I、II、III)樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷以及香叶醇樱草糖苷等糖苷结合态香气前体的清晰信号。其中，4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷母离子质荷比为m/z 346和300，m/z 346是该化合物和甲酸根的耦合离子[M+HCOO]-，m/z 300为该化合物的去氢离子[M-H]-，且母离子质荷比m/z 346信号显著强于m/z 300，m/z 346母离子的二级子离子为m/z 300、138；苯甲醇樱草糖苷母离子质荷比为m/z 447(即[M+HCOO]-)和401(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 447信号显著强于m/z 401，m/z 447母离子的二级子离子为m/z 401、269和161；水杨酸甲酯樱草糖苷母离子质荷比为m/z 491(即[M+HCOO]-)、445(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 491信号显著强于m/z 445，母离子m/z 491的二级子离子为m/z 293、233、191、149和131；苯乙醇樱草糖苷母离子质荷比为m/z 461(即[M+HCOO]-)、415(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 461信号显著强于m/z 415，母离子m/z 461的二级子离子为m/z 415、283、191和149；顺3-己烯醇樱草糖苷母离子质荷比为m/z 439(即[M+HCOO]-)、393(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 439信号显著强于m/z 393，母离子m/z 439的二级子离子为m/z 393、261、161和149；三种芳樟醇氧化物(I、II、III)樱草糖苷同分异构体母离子质荷比均为m/z 509(即[M+HCOO]-)、463(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 509信号显著强于m/z 463，母离子m/z 509的二级子离子为m/z 463、331和161；芳樟醇樱草糖苷母离子质荷比为m/z 493(即[M+HCOO]-)、447(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 493信号显著强于m/z 447，母离子m/z 493的二级子离子为m/z 447、315和161；香叶醇樱草糖苷等糖苷母离子质荷比为m/z 493(即[M+HCOO]-)、447(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 493信号显著强于m/z 447，母离子m/z 493的二级子离子为m/z 447、293和149。将母离子与相应的子离子配对建立包括内标在内的10种化合物的多反应监测MRM离子对，在MRM模式下即可实现对上述糖苷物质的同时检测；作为优选，以特征性强、信噪比高的母离子和子离子进行配对，并根据各物质的UPLC色谱行为建立4个通道，即在4-9min通道1中以离子对346/138检测内标4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、以离子对447/269检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对491/293检测水杨酸甲酯樱草糖苷，在7-13min通道2中以离子对461/149检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对439/149检测顺3-己烯醇樱草糖苷、以离子对509/331检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在13-17min通道3中以离子对509/331检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在17-23min通道4中以离子对493/161检测芳樟醇樱草糖苷、以离子对493/149检测香叶醇樱草糖苷，在该条件下可同时实现上述10种化合物的有效检测(如图1)。
3)、茶叶糖苷结合态香气前体物质含量计算：
以4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷内标为参照，获得苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物樱草糖苷III、芳樟醇樱草糖苷、香叶醇樱草糖苷这9种糖苷结合态香气前体的物质含量。
备注说明：
茶在制品，就是指茶叶加工过程中的各个阶段的在制品，比如摊青后的萎凋叶、杀青工序后的杀青叶、揉捻工序后的揉捻叶等等；
成品茶，就是指干茶，含水率一般≤7％；
作为本发明的直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法的改进：
所述步骤3)的公式为：内标浓度×内标体积×目标化合物峰面积/内标峰面积×提取物体积/茶叶样品干重。
作为本发明的直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法的进一步改进：
所述经超纯水预溶胀的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP的制备方法为：按照超纯水：PVPP＝2.8～3.2:1(较佳为3：1)的质量比，将PVPP浸泡在超纯水中静置2±0.2h；
静置结束后，去除PVPP表面的水分(可用滤纸过滤去除表面水分)，得超纯水预溶胀的PVPP。
作为本发明的直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法的进一步改进：
一、当待测样品为茶鲜叶、或茶在制品时：
称取相当于0.05-0.1g干重的待测样品，与10mL提取剂混合后，用匀浆机匀浆10-20min，然后离心，分别得首次上清液和残渣；
以残渣与10mL提取剂混合后，超声浸提10～20min，离心，吸取上清，并与首次上清液合并后作为上清液；
所述离心为5000±500r/min、4±1℃离心5±1min；
二、当待测样品为成品茶(干茶)时：
将待测样品粉碎(粉碎至能过60目筛)，取0.05-0.1g干重的待测样品粉末加入10mL提取剂超声浸提20±5min，然后离心，分别得首次上清液和残渣；
将残渣与10mL提取剂混合后超声浸提10～20min，离心，吸取上清，并与首次上清液合并后作为上清液；
所述离心为5000±500r/min、4±1℃离心5±1min。
作为本发明的直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法的进一步改进：
所述步骤1)中，在上清液中添加3.0μL浓度为1mg/mL的4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷溶液作为内标。
在本发明中：
设定了用于检测9种糖苷结合态香气前体物质的多反应监测离子对信息，只有在最合适的离子对条件下，才能获得目标物最高的信噪比；
设定了梯度洗脱的时间程序，只有在合适的时间程序下，各种目标物质可以获得良好的基线分离，这样非常有利于物质的定性和定量，尤其是对于母离子和子离子信息相似的同分异构体物质来说尤为重要；如果洗脱时间程序不合适，可能发生峰重叠，无法准确定量。
本发明的利用UPLC-MS/MS MRM模式检测茶鲜叶、或茶在制品、或干茶糖苷结合态香气前体物质的方法，具有以下优点：
1)、直接高效检测糖苷结合态香气前体物质，不需要对目标物质进行衍生或水解；
2)、对糖苷结合态香气前体物质检测灵敏度高，样品用量少，样品干重可少至0.05g；
3)、对糖苷结合态香气前体物质检测特异性强、信噪比高，样品中目标物质提取时不需要过柱纯化等前处理过程，操作简单、耗时短；
4)、对糖苷结合态香气前体物质检测效率高，可同时检测茶样品中的9种糖苷结合态香气前体。
5)、对糖苷结合态香气前体物质检测适用范围广，可用于茶鲜叶分析，也可用于茶在制品或者各种成品茶分析，同样适用于茶叶提取液或茶饮料样品分析。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为MRM模式下茶中糖苷结合态香气前体物质分析结果；
注：通道1中，峰1为4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(内标)、峰2为苯甲醇樱草糖苷、峰3为水杨酸甲酯樱草糖苷；通道2中，峰4为苯乙醇樱草糖苷、峰5为顺3-己烯醇樱草糖苷、峰6为芳樟醇氧化物I樱草糖苷、峰7为芳樟醇氧化物II樱草糖苷；通道3中，峰8为芳樟醇氧化物III樱草糖苷；通道4中，峰9为芳樟醇樱草糖苷、峰10为香叶醇樱草糖苷。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、一种直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，依次进行以下步骤：
1)、茶鲜叶中糖苷结合态香气前体物质提取：
采收‘浙农113’春季1芽2叶新梢，用直径为0.5cm的打孔器在采收的新梢叶片上打孔取样，称取相当于0.1g干重的叶片圆盘，置于匀浆器中，加入10mL预冷(-5℃)95％甲醇混合后，1200-2000r/min(幼嫩样品可采用低转速、粗老样品则可采用高转速)的转速下匀浆10min，将匀浆液转移至50mL离心管中，5000r/min、4℃离心5min，吸取全部上清转移至新离心管；将残渣再次与10mL预冷甲醇(-5℃)混合，并超声(40W)浸提20min，5000r/min、4℃离心5min，吸取全部上清。合并2次上清，并在其中添加3.0μL 4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(1mg/mL)作为内标，加入0.1g经超纯水预溶胀的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP(将质量比为3/1的超纯水与PVPP充分混匀、静置2h、滤纸过滤去除表面水分，即为超纯水预溶胀的PVPP)，充分混匀以沉淀多酚，静置60min后，10000r/min离心10min，转移上清至新离心管中，并浓缩至干(在室温下旋转蒸发(30-60r/min)浓缩至干、或者采用室温鼓吹氮气方式浓缩至干)，获得含茶鲜叶糖苷结合态香气前体物质的浸膏；将浸膏溶于2.0mL超纯水中，并以0.22μm微孔滤膜过滤，滤液即为茶鲜叶糖苷结合态香气前体提取物。
从打孔取样开始，再重复上述过程2次，分别获得茶鲜叶糖苷结合态香气前体提取物的第2和第3个重复样。
2)、提取物中糖苷结合态香气前体UPLC-MS/MS分析：
以UPLC HSST3色谱柱(150mm×2.1mm，1.8μ)为分析柱，柱温35℃，进样量5μL；以甲酸/水(0.05/99.95，v/v)为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速0.3ml/min，洗脱时间程序为0-3min B相保持10％、3.01-15min B相从10％增加至20％、15.01-20min B相从20％增加至35％、20.01-22min B相从35％增加至90％、22.01-24min B相保持90％、24.01-26min B相保持10％。
MS分析条件为：电喷雾ESI负电离模式、毛细管电压3KV、二级锥孔电压3V、透镜电压0.2V、离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃、脱溶剂气流量800L/h、锥孔气流量60L/h、锥孔电压25V、碰撞气氩气流速0.25mL/min、扫描质荷比范围为100～700m/z、数据采集时间为26min。
在上述UPLC分离和MS分析条件下，可检测到4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷内标以及茶叶苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物(I、II、III)樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷以及香叶醇樱草糖苷等糖苷结合态香气前体清晰信号。
其中：
4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷母离子质荷比为m/z 346和300，m/z 346是该化合物和甲酸根的耦合离子[M+HCOO]-，m/z 300为该化合物的去氢离子[M-H]-，且母离子质荷比m/z 346信号显著强于m/z 300，m/z 346母离子的二级子离子为m/z 300、138；
苯甲醇樱草糖苷母离子质荷比为m/z 447(即[M+HCOO]-)和401(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 447信号显著强于m/z 401，m/z 447母离子的二级子离子为m/z 401、269和161；
水杨酸甲酯樱草糖苷母离子质荷比为m/z 491(即[M+HCOO]-)、445(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 491信号显著强于m/z 445，母离子m/z 491的二级子离子为m/z 293、233、191、149和131；
苯乙醇樱草糖苷母离子质荷比为m/z 461(即[M+HCOO]-)、415(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 461信号显著强于m/z 415，母离子m/z 461的二级子离子为m/z415、283、191和149；
顺3-己烯醇樱草糖苷母离子质荷比为m/z 439(即[M+HCOO]-)、393(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 439信号显著强于m/z 393，母离子m/z 439的二级子离子为m/z 393、261、161和149；
三种芳樟醇氧化物(I、II、III)樱草糖苷同分异构体母离子质荷比均为m/z 509(即[M+HCOO]-)、463(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 509信号显著强于m/z 463，母离子m/z 509的二级子离子为m/z 463、331和161；
芳樟醇樱草糖苷母离子质荷比为m/z 493(即[M+HCOO]-)、447(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 493信号显著强于m/z 447，母离子m/z 493的二级子离子为m/z 447、315和161；
香叶醇樱草糖苷等糖苷母离子质荷比为m/z 493(即[M+HCOO]-)、447(即[M-H]-)，且母离子质荷比m/z 493信号显著强于m/z 447，母离子m/z 493的二级子离子为m/z 447、293和149。
将母离子与相应的子离子配对建立包括内标在内10种化合物的多反应监测MRM离子对，在MRM模式下即可实现对上述糖苷物质的同时检测；作为优选，以特征性强、信噪比高的母离子和子离子进行配对，并根据各物质的UPLC色谱行为建立4个通道，即在4-9min通道1中以离子对346/138检测内标4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、以离子对447/269检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对491/293水杨酸甲酯樱草糖苷，在7-13min通道2中以离子对461/149检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对439/149检测顺3-己烯醇樱草糖苷、以离子对509/331检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在13-17min通道3中以离子对509/331检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在17-23min通道4中以离子对493/161检测芳樟醇樱草糖苷、以离子对493/149检测香叶醇樱草糖苷，在该条件下可同时实现上述包括内标在内的10种糖苷物质的有效检测。
三次重复内标峰面积分别为1089.3、1069.6、1061.8；
三次重复目标化合物峰面积分别为：苯甲醇樱草糖苷323.2、310.2、322.1，水杨酸甲酯樱草糖苷365.3、357.2、368.1，苯乙醇樱草糖苷2337.6、2320.3、2268.0，顺3-己烯醇樱草糖苷、98.0、92.7、99.8，芳樟醇氧化物I樱草糖苷327.5、319.5、326.3，芳樟醇氧化物II樱草糖苷204.8、206.1、191.1，芳樟醇氧化物III樱草糖苷3518.4、3466.9、3413.3，芳樟醇樱草糖苷3395.0、3316.5、3321.3，香叶醇樱草糖苷8084.1、7900.8、7911.1。
3)茶鲜叶糖苷结合态香气前体物质含量计算：
以4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷内标为参照，采用内标浓度1mg/mL×内标用量0.003mL(即3.0μL)×目标化合物峰面积/内标峰面积×提取物体积(本实施例为2.0mL)/茶叶样品质量(本实施例为0.1g干重)×1000(单位换算，从mg/g换算为μg/g)公式进行样品糖苷结合态香气前体物质含量(单位为μg/g干重)计算。
根据该公式计算，‘浙农113’茶树鲜叶重复1样品中，苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(μg/g干重)分别为17.80、20.12、128.76、5.40、18.04、11.28、193.80、187.00和445.28；重复2样品中，苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(μg/g干重)分别为17.40、20.04、130.16、5.20、17.92、11.56、194.48、186.04和443.20；重复3样品中，苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(μg/g干重)分别为18.20、20.80、128.16、5.64、18.44、10.80、192.88、187.68和447.04。
根据三次重复进行均值计算，‘浙农139’鲜叶中苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(μg/g干重)分别为17.80±0.40、20.32±0.42、129.03±1.03、5.41±0.22、18.13±0.27、11.21±0.38、193.72±0.80、186.91±0.82和445.17±1.92。可见本方面不仅可以同时测定茶鲜叶的9种糖苷结合态香气前体物质，而且9种物质的测定变异系数均小于5％，重复性好。
实施例2、一种直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，依次进行以下步骤：
1)、绿茶糖苷结合态香气前体物质提取：
将毛峰绿茶样品用磨样机磨碎，过60目筛，称取相当于0.05g干重的样品于50mL离心管中，加入10mL预冷(-5℃)90％甲醇超声(40W)浸提20min后，以5000r/min、4℃离心5min，上清全部转移至新离心管中；将残渣再次以10mL预冷90％甲醇超声(40W)浸提10min，并离心，吸取全部上清、合并2次上清；在合并后上清中添加3.0μL 4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(1mg/mL)作为内标，加入0.2g经超纯水预溶胀的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP、充分混匀以沉淀多酚，静置60min后，10000r/min离心10min，转移上清至新离心管中，并浓缩至干，获得含毛峰绿茶糖苷结合态香气前体物质的浸膏；将浸膏溶于1.0mL超纯水中，并以0.22μm微孔滤膜过滤，滤液即为毛峰绿茶糖苷结合态香气前体提取物。从样品磨碎和取样开始，再重复上述过程2次，分别获得绿茶糖苷结合态香气前体提取物的第2和第3个重复样。
2)、提取物中糖苷结合态香气前体UPLC-MS/MS分析：
采用实施例1中相同的UPLC-MS/MS条件以及4个通道10种化合物MRM离子对分析毛峰绿茶提取物中的内标和糖苷结合态香气前体，即在4-9min通道1中以离子对346/138检测内标4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、以离子对447/269检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对491/293水杨酸甲酯樱草糖苷，在7-13min通道2中以离子对461/149检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对439/149检测顺3-己烯醇樱草糖苷、以离子对509/331检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在13-17min通道3中以离子对509/331检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在17-23min通道4中以离子对493/161检测芳樟醇樱草糖苷、以离子对493/149检测香叶醇樱草糖苷。在该条件下可同时实现上述内标在内的10种糖苷物质的有效检测。
3)绿茶糖苷结合态香气前体物质含量计算：
以4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷内标为参照，采用内标浓度1mg/mL×内标用量0.003mL(即3.0μL)×目标化合物峰面积/内标峰面积×提取物体积(本实施例为1.0mL)/茶叶样品质量(本实施例中为0.05g干重)×1000(单位换算，从mg/g换算为μg/g)公式进行样品糖苷结合态香气前体物质含量(μg/g干重)计算。
根据该公式，毛峰绿茶重复1样品中，苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(μg/g干重)分别为28.12、12.57、51.30、4.19、8.48、21.49、245.80、114.12、551.48；重复2样品中，苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(μg/g干重)分别为27.48、12.88、51.14、4.55、8.21、21.08、245.12、115.74、552.17；重复3样品中，苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(mg/g干重)分别为28.57、12.41、51.88、4.47、8.67、21.94、246.81、114.82、549.04。根据三次重复进行均值计算，毛峰绿茶中苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(μg/g干重)分别为28.06±0.55、12.62±0.24、51.44±0.39、4.40±0.19、8.45±0.23、21.50±0.43、245.91±0.85、114.89±0.81、550.90±1.64。可见本方面不仅可以同时测定绿茶的9种糖苷结合态香气前体物质，而且9种物质的测定变异系数均小于5％，重复性好。
实施例3、一种直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，依次进行以下步骤：
1)、乌龙茶在制品糖苷结合态香气前体物质提取：
对乌龙茶加工过程中的摇青叶进行取样，称取相当于0.1g干重的摇青叶样品，置于匀浆机中，加入10mL预冷(-5℃)95％甲醇匀浆20min后，以5000r/min、4℃离心5min，上清全部转移至离心管中；将残渣再次以10mL预冷95％甲醇混合，并超声(40W)浸提20min，离心、吸取全部上清，合并2次上清；在合并后上清中添加3.0μL 4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(1mg/mL)作为内标，加入0.1g经超纯水预溶胀的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP、充分混匀以沉淀多酚，静置60min后，10000r/min离心10min，转移上清至新离心管中，并浓缩至干，获得含乌龙茶在制品摇青叶糖苷结合态香气前体物质的浸膏；将浸膏溶于2.0mL超纯水中，并以0.22μm微孔滤膜过滤，滤液即为乌龙茶在制品摇青叶糖苷结合态香气前体提取物。从取样和匀浆开始，再重复上述过程2次，分别获得乌龙茶在制品摇青叶糖苷结合态香气前体提取物的第2和第3个重复样。
2)、提取物中糖苷结合态香气前体UPLC-MS/MS分析：
采用实施例1中相同的UPLC-MS/MS条件以及4个通道10种化合物MRM离子对分析乌龙茶在制品摇青叶提取物中的内标和糖苷结合态香气前体，即在4-9min通道1中以离子对346/138检测内标4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、以离子对447/269检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对491/293水杨酸甲酯樱草糖苷，在7-13min通道2中以离子对461/149检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对439/149检测顺3-己烯醇樱草糖苷、以离子对509/331检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在13-17min通道3中以离子对509/331检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在17-23min通道4中以离子对493/161检测芳樟醇樱草糖苷、以离子对493/149检测香叶醇樱草糖苷。在该条件下可同时实现上述内标在内的10种糖苷物质的有效检测。
3)、乌龙茶在制品摇青叶糖苷结合态香气前体物质含量计算：
以4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷内标为参照，采用内标浓度1mg/mL×内标用量0.003mL(即3.0μL)×目标化合物峰面积/内标峰面积×提取物体积(本实施例为2.0mL)/茶叶样品质量(本实施例中为0.1g干重)×1000(单位换算，从mg/g换算成μg/g)公式进行样品糖苷结合态香气前体物质含量(μg/g干重)计算。根据该公式，乌龙茶在制品摇青叶重复1样品中，苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(μg/g干重)分别为7.47、3.94、11.78、1.46、4.11、2.68、44.43、61.31、113.39、250.12；重复2样品中，苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(μg/g干重)分别为7.23、3.67、11.14、1.38、3.95、2.65、44.80、61.86、112.94和249.85；重复3样品中，苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(μg/g干重)分别为7.64、3.79、11.35、1.49、3.88、2.85、44.02、61.53、113.75和249.10。根据三次重复进行均值计算，乌龙茶在制品摇青叶中苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量以干重计(mg/g干重)分别为7.45±0.21、3.80±0.14、11.42±0.33、1.44±0.06、3.98±0.12、2.73±0.11、44.42±0.39、61.57±0.28、113.36±0.41和249.69±0.53。可见本方法不仅可以同时测定乌龙茶在制品摇青叶的9种糖苷结合态香气前体物质，而且9种物质的测定变异系数均小于5％，重复性好。
验证实验：
对实施例1～实施例3的样品采用本行业目前普遍采用的、检测效果好的酶解并结合GC-MS分析法进行验证，具体为将实施例1～实施例3中所得的糖苷结合态香气前体提取物，上样于装有Amberlite XAD-2吸附剂的微萃取小柱(柱床体积2mL)中，先用5mL水洗涤柱床，再以5ml戊烷/二氯甲烷(体积比2/1)洗涤柱床，最后以20mL甲醇洗脱糖苷结合态香气前体，将收集的含糖苷结合态香气前体的甲醇洗脱液在室温下用氮气吹干，并将干燥物重新溶解于100μL含樱草糖苷酶和葡萄糖苷酶的柠檬酸缓冲液(50mM，pH6.0)中，37℃反应14h；加入30mg氯化钠和100μL二氯甲烷混匀，12000r/min离心10min，转移二氯甲烷层至新离心管，并加入100mg无水硫酸钠脱水2h，将含香气物质的二氯甲烷转移至新管，以GC-MS分析其中的香气成分；将获得的4-硝基苯酚、苯甲醇、水杨酸甲酯、苯乙醇、顺3-己烯醇、芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、芳樟醇氧化物III、芳樟醇和香叶醇峰面积，换算成内标4-硝基苯基葡萄糖苷以及苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷峰面积，并以内标为参照采用类似实施例1～3中的方法计算各种目标物含量(以μg/g干重计)。其中，实施例1中所得苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷(以μg/g干重计)分别为：17.65±0.92、19.85±0.79、127.38±1.77、5.04±0.41、17.89±0.68、11.05±0.51、191.05±1.78、185.21±2.56和443.85±3.15；实施例2中苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷(以μg/g干重计)分别为：27.41±0.92、12.13±0.62、50.09±0.88、4.15±0.53、8.07±0.51、20.94±0.68、243.33±2.26、112.42±1.64、547.36±2.80；实施例3中苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷(以μg/g干重计)分别为：7.02±0.75、3.32±0.43、10.92±0.67、1.30±0.25、3.58±0.49、2.55±0.45、43.53±0.72、60.83±0.96、112.28±1.79和247.57±2.05。
比较可知，本发明所测实施例1～3结果与现有本行业目前普遍采用的、检测效果最好的方法得到结果非常接近。
对比例1、
将实施例1步骤2)目标物质多反应监测离子对的子离子进行更改，即，改为：通道1中以离子对346/138检测内标4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、以离子对447/161检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对491/191水杨酸甲酯樱草糖苷，在7-13min通道2中以离子对461/283检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对439/261检测顺3-己烯醇樱草糖苷、以离子对509/161检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在13-17min通道3中以离子对509/161检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在17-23min通道4中以离子对493/315检测芳樟醇樱草糖苷、以离子对493/293检测香叶醇樱草糖苷；其余条件等同于实施例1。苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量(以μg/g干重)测定结果分别为：17.41±1.09、19.89±1,41、128.72±5.94、5.19±0.66、16.93±1.13、11.04±0.83、190.07±5.58、184.86±6.60和442.88±8.69。对比可知，虽然该结果中各种糖苷前体物质含量顺序与实施例1一致，但含量总体低于实施例1，且测定的变异系数增大，为1.88～12.72％，尤其是含量较低的物质变异系数增大明显。
对比例2、
将实施例2步骤2)目标物质的多反应监测离子对中的母离子进行更改，即：通道1中以离子对346/138检测内标4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、以离子对401/269检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对445/293水杨酸甲酯樱草糖苷，在通道2中以离子对415/149检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对393/149检测顺3-己烯醇樱草糖苷、以离子对463/331检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在通道3中以离子对463/331检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在通道4中以离子对447/161检测芳樟醇樱草糖苷、以离子对447/149检测香叶醇樱草糖苷；其余条件等同于实施例2。苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物III樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量(以μg/g干重)测定结果分别为：26.48±1.49、11.06±0.90、49.27±1.53、4.01±0.53、7.89±0.91、20.14±1.04、241.33±4.73、111.38±3.77、545.69±9.70。。对比可知，虽然该结果中各种糖苷前体物质含量顺序与实施例2一致，但含量总体低于实施例2，且测定的各物质变异系数增大，为1.78～13.22％，尤其是含量较低的物质变异系数增大明显。
对比例3、将实施例1步骤2)中梯度洗脱时间程序为：0-3min B相保持10％、3.01-22min B相从10％增加至90％、22.01-24min B相保持90％、24.01-26min B相保持10％；其余条件等同于实施例1。在该条件下，测定的苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷和香叶醇樱草糖苷含量基本与实施例1接近，但是芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷和芳樟醇氧化物III樱草糖苷不能实现基线分离，无法准确计量。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。