本发明属于化学分析检测技术领域，具体地说，涉及一种内参比表面增强拉曼测试试纸、制备方法与应用。
背景技术：
表面增强拉曼散射(sers)是指当一些分子或者官能团被吸附到某些金属或半导体的特殊表面(如纳米颗粒、纳米线的表面以及具有纳米级粗糙度的表面)上时，在激发区域内它的拉曼散射信号强度会大幅增加的一种光谱现象。sers由于具有高灵敏度、快速、丰富的光谱信息，被广泛用于研究表面、吸附界面表面状态、生物大小分子的界面取向及构型构象、结构分析等，可以有效地分析化合物在界面的吸附取向、吸附态的变化、界面信息等。在利用和发展sers对环境污染物的检测中，目前，主要通过增强基底材料sers效应、提高基底材料选择性、优化基底材料实用性等手段实现。基底表面的粗糙度是产生sers现象的必要条件，基底的理化性质决定了sers效应的强弱。因此，在利用表面增强拉曼散射光谱建立分析方法的过程中，制备具有高稳定、高重复性、高选择性的基底一直是sers检测方法的重点研究方向。
羟基磷灰石是一种组成人体和动物骨骼的主要无机成分，它具有优良的生物相容性和生物活性，是一种广泛应用的生物医学材料。利用羟基磷灰石可以进行结构修饰得到银纳米颗粒负载的羟基磷灰石，形成滤纸或者试纸。
试剂盒为用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。与传统实验室操作相比，采用试剂盒进行样品前处理或者进行分析，整个检测过程简单、快速、方便，适合现场操作，对分析操作技能要求低，在很短的时间内，可以得到检测结果。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种内参比表面增强拉曼测试试纸。
本发明的另一个目的是提供一种所述内参比表面增强拉曼测试试纸的制备方法。
本发明的再一个目的是提供一种所述内参比表面增强拉曼测试试纸在环境样品污染物的快速检测试剂盒中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的一个方面提供了一种内参比表面增强拉曼测试试纸，以羟基磷灰石超长纳米线为介质，还包括修饰于所述羟基磷灰石超长纳米线上的银纳米颗粒。
所述羟基磷灰石超长纳米线的长度为100～300μm，优选为200μm，直径为10～30nm，优选为20nm。
所述内参比表面增强拉曼测试试纸的厚度为0.1-0.5mm，优选为0.2mm。
所述修饰于所述羟基磷灰石超长纳米线上的银纳米颗粒的含量为5.0～10％，优选为7.8％。
本发明的另一个方面提供了一种所述内参比表面增强拉曼测试试纸的制备方法，包括以下步骤：
第一步，将油酸分散于去离子水和甲醇的混合溶液中，机械搅拌混合均匀，得到油酸的均匀混合溶液；
第二步，将第一步获得的混合溶液与浓度为8～10％的氢氧化钠水溶液搅拌混合均匀，得到均匀混合的液体；
第三步，向第二步获得的混合溶液中加入浓度为1～3％的氯化钙水溶液和浓度为2～7％的磷酸二氢钠水溶液，搅拌混合均匀，得到均匀混合的液体；
第四步，将第三步获得的混合溶液加热反应，获得悬浮颗粒溶液，将产物离心，用去离子水和甲醇清洗，保存在水中；
第五步，将第四步获得的溶液与浓度为40～60％的硝酸银溶液搅拌混合均匀，得到悬浮液体，真空抽滤，得到所述内参比表面增强拉曼测试试纸。
所述油酸、甲醇与去离子水的质量比为(8～12):(2～6):(5～15)，优选为(8～10):(3～5):(10～15)。
所述第一步获得的混合溶液与氢氧化钠水溶液的质量比为(26～28):(14～18)。
所述第二步获得的混合溶液与氯化钙水溶液、磷酸二氢钠水溶液的质量比为(40～50):(10～14):(15～20)。
所述第四步中加热反应的温度为100～250℃，反应时间为12～36h。
所述第五步中第四步获得的溶液与硝酸银溶液的质量比为(30～50):(90～110)。
所述内参比表面增强拉曼测试试纸的尺寸为(2～20mm)×(2～20mm)。
本发明的再一个方面提供了一种所述的内参比表面增强拉曼测试试纸在环境样品污染物的快速检测试剂盒中的应用。
本发明的又一个方面提供了一种所述的试剂盒在有机污染物的快速检测中的应用。
所述有机污染物为4-硝基苯硫酚、4-氨基苯硫酚、联苯胺。
所述应用包括以下步骤：将环境测试样品取40～60μl加入试剂盒中，在内参比表面增强拉曼测试试纸中室温浸泡2～5min，将内参比表面增强拉曼测试试纸用镊子取出，于载玻片上方，利用拉曼光谱仪进行检测。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸，以油酸、氯化钙以及磷酸二氢钠为原料通过热熔法制备得到羟基磷灰石超长纳米线，利用银离子与磷酸根的结合，制备得到银纳米颗粒负载的羟基磷灰石超长纳米线，进一步获得内参比表面增强拉曼测试试纸，本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸具有较高的稳定性，将其应用于试剂盒中，对多种化合物4-硝基苯硫酚、4-氨基苯硫酚、联苯胺等具有sers响应，通过试纸特有的拉曼峰作为内参比，样品化合物的特征拉曼峰为测试信号，可以实现对样品化合物的定量分析，能够快速进行检测。
附图说明
图1是本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸的扫描电镜图。
图2是本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸的透射电镜图。
图3是本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸的x射线衍射图。
图4是利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸检测4-硝基苯硫酚的拉曼测试结果；a是直接分析4-硝基苯硫酚固体的拉曼光谱图，b是浓度为1.0mmoll-14-硝基苯硫酚的表面增强拉曼光谱图，c是4-硝基苯硫酚的饱和乙醇溶液拉曼光谱图。
图5是利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸检测4-氨基苯硫酚的拉曼测试结果；a是直接分析4-氨基苯硫酚固体的拉曼光谱图，b是浓度为1.0μmoll-14-氨基苯硫酚的表面增强拉曼光谱图，c是空白内参比表面增强拉曼测试试纸的拉曼光谱图。
图6是以本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸作为基底测试4-氨基苯硫酚的稳定性对比图，a是当天对4-氨基苯硫酚的测试信号图，b为放置14天后的测试信号图。
图7是利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸检测联苯胺的拉曼测试结果；a是直接分析联苯胺固体的拉曼光谱图，b是浓度为1.0μmoll-1联苯胺的表面增强拉曼光谱图，c是空白内参比表面增强拉曼测试试纸的拉曼光谱图。
图8是利用内参比对联苯胺进行检测的线性关系图。
图9是利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对环境水样中联苯胺的分析图；a为利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对空白水的sers光谱图，b为利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对环境污水的sers光谱图，c为利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对环境污水加入1.0μmoll-1联苯胺的sers光谱图，d为利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对环境污水加入2.0μmoll-1联苯胺的sers光谱图，其中，拉曼峰1451.63cm-1做为联苯胺的特征信号峰，拉曼峰911.43cm-1做为内参比峰。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明实施例所用的试剂和材料如下：
96孔试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,96孔microtitertm微孔板,规格：vinyl400μl。
实施例1
(1)将9.36g油酸和4.75g甲醇与13.5g去离子水的混合溶液进行缓慢搅拌，通过机械搅拌，得到油酸的均匀混合溶液。
(2)将油酸混合溶液中加入16g浓度为8％的氢氧化钠水溶液，进行机械搅拌30min，得到均匀混合溶液。
(3)将油酸的氢氧化钠混合溶液中加入12g浓度为2％的氯化钙水溶液和19g浓度为5％的磷酸二氢钠水溶液搅拌混合均匀，得到均匀溶液。
(4)将混合溶液转移至250ml的四氟乙烯反应釜中加热至180℃反应24h，即得悬浮颗粒溶液，将产物离心，用去离子水和甲醇清洗数次，保存在水中，待用。
(5)取步骤(4)所得的40g悬浮液体与100g浓度为60％的硝酸银水溶液进行混合，光照下进行机械搅拌4h，得到混合均匀的灰色悬浮液体，真空抽滤，得到内参比表面增强拉曼测试试纸。对试纸进行测试结果如图1～3所示，图1是本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸的扫描电镜图。从图中可以看出该试纸为负载银纳米颗粒超长纳米线结构；图2是本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸的透射电镜图。从图中可以看出该试纸为负载银纳米颗粒超长纳米线结构；图3是本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸的x射线衍射图。从图中可以看出该试纸为银磷酸银结构。
本实施例制备的羟基磷灰石超长纳米线的长度为200μm，直径为20nm，内参比表面增强拉曼测试试纸的厚度为0.2mm，修饰于所述羟基磷灰石超长纳米线上的银纳米颗粒的含量为7.8％。
(6)将步骤(5)所得的试纸进行裁剪，得到4mm×4mm的试纸，存放入96孔试剂盒中，得到内参比表面增强拉曼检测试剂盒。
实施例2
将浓度为1.0mmoll-14-硝基苯硫酚乙醇溶液取50μl加入实施例1制备的试剂盒中其中对应试纸中，室温浸泡2min，将试纸用镊子取出，于载玻片上方，利用拉曼光谱仪进行检测。结果如图4所示，图4是利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸检测4-硝基苯硫酚的拉曼测试结果；a是直接分析4-硝基苯硫酚固体的拉曼光谱图，b是浓度为1.0mmoll-14-硝基苯硫酚的表面增强拉曼光谱图，c是4-硝基苯硫酚的饱和乙醇溶液拉曼光谱图。由图可以看出通过本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸的测试，可以明显检测出低浓度的4-硝基苯硫酚的拉曼光谱信号。
实施例3
将浓度为1.0μmoll-14-氨基苯硫酚乙醇溶液取50μl加入实施例1制备的试剂盒中其中对应试纸中，室温浸泡2min，将试纸用镊子取出，于载玻片上方，利用拉曼光谱仪进行检测。结果如图5所示，图5是利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸检测4-氨基苯硫酚的拉曼测试结果；a是直接分析4-氨基苯硫酚固体的拉曼光谱图，b是浓度为1.0μmoll-14-氨基苯硫酚的表面增强拉曼光谱图，c是空白内参比表面增强拉曼测试试纸的拉曼光谱图。由图中可以看出，通过利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸的测试，可以明显检测出低浓度的4-氨基苯硫酚的拉曼光谱信号，c中空白内参比表面增强拉曼测试试纸的两个拉曼峰911cm-1和963cm-1为定量分析的内参比拉曼峰。
图6是以本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸作为基底测试4-氨基苯硫酚的稳定性对比图，a是当天对4-氨基苯硫酚的测试信号图，b为放置14天后的测试信号图。由图对比可知，本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸作为基底，稳定性好。
实施例4
将浓度为1.0μmoll-1联苯胺乙醇溶液取50μl加入实施例1制备的试剂盒中其中对应试纸中，室温浸泡2min，将试纸用镊子取出，于载玻片上方，利用拉曼光谱仪进行检测，结果如图7所示，图7是利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸检测联苯胺的拉曼测试结果；a是直接分析联苯胺固体的拉曼光谱图，b是浓度为1.0μmoll-1联苯胺的表面增强拉曼光谱图，c是空白内参比表面增强拉曼测试试纸的拉曼光谱图。由图可以看出，通过表面增强拉曼测试试纸的测试，可以明显检测出低浓度的联苯胺的拉曼光谱信号，c中空白内参比表面增强拉曼测试试纸的两个拉曼峰911cm-1和963cm-1为定量分析的内参比拉曼峰。
图8是利用内参比对联苯胺进行检测的线性关系图。利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对浓度为0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0μmoll-1的联苯胺进行测试，将不同浓度的联苯胺的sers信号中的特征拉曼峰1451.63cm-1与内参比拉曼峰911.43cm-1进行比值，以比值和浓度做线性关系图。通过比值和浓度的线性关系，得到线性关系曲线为r＝0.0416c+1.766，线性相关系数为0.9919。
实施例5
将空白水溶液、环境污水以及联苯胺加入环境污水中样品，分别取50μl加入实施例1制备的试剂盒中其中对应试纸中，室温浸泡2min，将试纸用镊子取出，于载玻片上方，利用拉曼光谱仪进行检测，拉曼测试结果如图9所示，图9是利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对环境水样中联苯胺的分析图；a为利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对空白水的sers光谱图，b为利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对环境污水的sers光谱图，c为利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对环境污水加入1.0μmoll-1联苯胺的sers光谱图，d为利用本发明的内参比表面增强拉曼测试试纸对环境污水加入2.0μmoll-1联苯胺的sers光谱图，其中，拉曼峰1451.63cm-1做为联苯胺的特征信号峰，拉曼峰911.43cm-1做为内参比峰。通过利用标准曲线，测得环境污水中的联苯胺含量为3.3μmoll-1，加标回收率分别为117％和140％。
实施例6
(1)将8g油酸和2g甲醇与15g去离子水的混合溶液进行缓慢搅拌，通过机械搅拌，得到油酸的均匀混合溶液。
(2)将油酸混合溶液中加入14g浓度为9％的氢氧化钠水溶液，进行机械搅拌30min，得到均匀混合溶液。
(3)将油酸的氢氧化钠混合溶液中加入10g浓度为3％的氯化钙水溶液和15g浓度为7％的磷酸二氢钠水溶液搅拌混合均匀，得到均匀溶液。
(4)将混合溶液转移至250ml的四氟乙烯反应釜中加热至180℃反应24h，即得悬浮颗粒溶液，将产物离心，用去离子水和甲醇清洗数次，保存在水中，待用。
(5)取步骤(4)所得的30g悬浮液体与90g浓度为50％的硝酸银水溶液进行混合，光照下进行机械搅拌4h，得到混合均匀的灰色悬浮液体，真空抽滤，得到内参比表面增强拉曼测试试纸。
本实施例制备的羟基磷灰石超长纳米线的长度为200μm，直径为20nm，内参比表面增强拉曼测试试纸的厚度为0.2mm，修饰于所述羟基磷灰石超长纳米线上的银纳米颗粒的含量为7.8％。
(6)将步骤(5)所得的试纸进行裁剪，得到4mm×4mm的试纸，存放入96孔试剂盒中，得到内参比表面增强拉曼检测试剂盒。
实施例7
(1)将12g油酸和6g甲醇与10g去离子水的混合溶液进行缓慢搅拌，通过机械搅拌，得到油酸的均匀混合溶液。
(2)将油酸混合溶液中加入18g浓度为10％的氢氧化钠水溶液，进行机械搅拌30min，得到均匀混合溶液。
(3)将油酸的氢氧化钠混合溶液中加入14g浓度为1％的氯化钙水溶液和20g浓度为2％的磷酸二氢钠水溶液搅拌混合均匀，得到均匀溶液。
(4)将混合溶液转移至250ml的四氟乙烯反应釜中加热至180℃反应24h，即得悬浮颗粒溶液，将产物离心，用去离子水和甲醇清洗数次，保存在水中，待用。
(5)取步骤(4)所得的50g悬浮液体与110g浓度为40％的硝酸银水溶液进行混合，光照下进行机械搅拌4h，得到混合均匀的灰色悬浮液体，真空抽滤，得到内参比表面增强拉曼测试试纸。
本实施例制备的羟基磷灰石超长纳米线的长度为200μm，直径为20nm，内参比表面增强拉曼测试试纸的厚度为0.2mm，修饰于所述羟基磷灰石超长纳米线上的银纳米颗粒的含量为7.8％。
(6)将步骤(5)所得的试纸进行裁剪，得到4mm×4mm的试纸，存放入96孔试剂盒中，得到内参比表面增强拉曼检测试剂盒。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。