本发明涉及再造烟叶的检测技术领域，更具体地，涉及一种同时测定再造烟叶中山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根的离子色谱方法及应用。
背景技术：
造纸法再造烟叶因其具有平衡烟草结构、稳定卷烟质量、有效降低焦油和部分有害成分释放量等作用，已被广泛地应用于卷烟的生产过程中。由于再造烟叶是利用废弃的烟梗、烟叶碎片、烟末等为原料，在原材料上与烟叶存在一定的差距，如物理性质、感官质量、降焦减害、功能性等方面的差异，需要通过改善或者掩盖来提升其品质，因此，在再造烟叶中加入一种或几种添加剂来改善其某种或某些性能，如用山梨酸盐作为防霉剂；磷酸盐作为灰分调节剂，使灰分结实不松散；柠檬酸盐作为目前最常用的助燃剂。但是，添加剂的加入量和残留量会影响再造烟叶的质量稳定性和安全性，所以需要进行严格控制。
离子色谱法具有选择性好、灵敏度高、前处理简单等优点，已被广泛地应用于烟草及其制品的阴阳离子和有机酸的测定。但目前未见有报道同时测定再造烟叶中的山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根，且再造烟叶成分复杂，离子干扰大，简单的前处理方法不能去除干扰离子。目前测定再造烟叶中山梨酸含量存在着以下问题：与磷酸根和柠檬酸根相比，山梨酸根在分离柱上的灵敏度相对较低，且与其相邻的硝酸根(必然存在于再造烟叶样品中)的响应却很高，硝酸根的干扰较大，使测定的结果不准确，重复性差。
技术实现要素：
本发明的目的是，针对现有再造烟叶中山梨酸、磷酸和柠檬酸检测技术的不足，建立了一种能同时测定再造烟叶中山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根的离子色谱方法，旨在为对再造烟叶加工过程中化学物质加入量的控制提供技术依据。
本发明的另一个目的是提供所述离子色谱方法的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
提供一种同时测定再造烟叶中山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根的离子色谱方法，将再造烟叶样品以超纯水作为萃取剂振荡萃取，所得萃取液经滤膜过滤后得到滤液，然后进行离子色谱分析；
所述色谱分析的条件为：离子交换柱：AS11-HC，4×250mm；柱温：23℃；进样量：50μL；抑制器电流：112mA；检测器为自循环抑制电导检测；淋洗液为KOH溶液；流速：1.5mL min-1；
梯度洗脱程序如表1所示：
表1
优选地，在所述离子色谱分析前还包括将所述滤液采用RP柱进行净化处理步骤。由于再造烟叶成分较复杂，萃取液必须经过净化处理除去对色谱柱造成污染的成分，才可以进入离子色谱进行分析。
进一步地，本发明对RP柱的填料及滤液进行优选，能有效地过滤杂质成分并对山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根有较高的前处理回收率。
优选地，所述RP柱为以聚苯乙烯/二乙烯苯高聚物为填料的RP柱。
优选地，所述滤液在进行所述净化处理步骤之前还包括将所述滤液的pH调节至11。
优选地，所述pH调节的步骤是采用浓度为250mmol L-1的NaOH溶液进行调节。
优选地，所述RP柱使用前分别用5mL甲醇和10ml超纯水以1mL/min的流速进行活化。
优选地，所述净化处理中所述滤液的流速为0.5mL/min。
优选地，所述振荡萃取的时间为30min。
山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根这三种目标物都能溶于水，对于测定水溶性离子，常用的萃取剂为纯水、酸溶液和碱溶液。由于方法所用的分离柱为阴离子柱，大量的酸根离子会带来干扰，以水和NaOH溶液作萃取液，但在碱性条件下，磷酸根的提取效率明显较低。因此本试验选取纯水为萃取剂。而本发明以纯水为萃取剂，振荡20min时，得到三种目标组分的提取效率最高。
本发明经过仔细研究总结，优选了AS11-HC柱作为本方法的分析柱，山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根这三种目标成分在该柱上有相对较好的分离效果。但是与磷酸根和柠檬酸根相比，山梨酸根在AS11-HC分离柱上的灵敏度相对较低，而与其相邻的硝酸根的响应却很高，为了减少硝酸根对其干扰，本发明进一步研究比较不同浓度的淋洗液和柱温对山梨酸根和硝酸根的分离情况、山梨酸根的信噪比和峰形对称性的影响，最终确定采用柱温为23℃，4mmol L-1的KOH溶液为淋洗液的初始浓度，此色谱条件能使山梨酸根以较好的峰形及灵敏度与硝酸根达到基线分离。
本发明所述离子色谱方法能够很好地应用于再造烟叶中山梨酸、磷酸和/或柠檬酸组分的测定。并且所述离子色谱方法也能够应用于再造烟叶中添加剂中山梨酸、磷酸和/或柠檬酸组分的测定。利用本发明所述离子色谱方法，各个待测组分测试含量的相对标准偏差(RSD)为0.18％～0.74％，加标回收率在97.1％～102.7％之间，其准确、简单、可靠。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明填补了现有技术的空白，提供一种同时测定再造烟叶中山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根的离子色谱方法，建立了以柱温为23℃，4mmol L-1KOH溶液为淋洗液的初始浓度，AS11-HC柱为分离柱的测定再造烟叶中山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根的方法。该方法解决了硝酸根对山梨酸根的干扰，使样品中的山梨酸定量更加准确、可靠。将本发明所述离子色谱方法应用于测定再造烟叶中山梨酸、磷酸和柠檬酸时，各个待测组分测试含量的相对标准偏差(RSD)为0.18％～0.74％，加标回收率在97.1％～102.7％之间，其准确、简单、可靠。
附图说明
图1为实际样品的色谱图(其中，1-山梨酸根，2-为硝酸根，3-磷酸根，4-柠檬酸根)。
图2为混合标准溶液的色谱图(1-山梨酸根，2-磷酸根，3-柠檬酸根)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂为常规市购或商业途径获得的试剂，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
材料与方法
1)设备
ICS5000离子色谱仪(美国戴安公司)；自动固相萃取仪(美国Gilson公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore)。
2)材料
本发明以随机选取的26个再造烟叶试验品和成品为例进行说明；山梨酸钾(99.5％，美国sigma公司)；磷酸根标准溶液(1000μg mL-1，国家标准物质中心)；柠檬酸(99％，美国sigma公司)；超纯水(电阻率≥18.2MΩ.cm)；氢氧化钠溶液(50％，美国Fluka)；滤膜(0.45μm，希波氏)；RP柱(1CC，美国戴安)；分析柱(AS11-HC 4mm，美国戴安)；自动淋洗液(氢氧化钾，美国戴安)。
实施例1萃取剂的影响实验
本发明测定的山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根这三个目标组分都能溶于水，对于测定水溶性离子，常用的萃取剂为纯水、酸溶液和碱溶液。由于方法所用的分离柱为阴离子柱，大量的酸根离子会带来干扰，所以尝试了用水和4mmol L-1的NaOH溶液作萃取液。结果(见表2)表明：在碱性条件下，磷酸根的提取效率明显较低。因此本实验选取纯水为萃取剂。
表2不同萃取剂的萃取效率比较
以纯水为萃取剂，测定了相同重量的样品在不同提取时间下目标组分的含量(见表3)。试验表明：以纯水为萃取剂，振荡20min时，得到三种目标组分的提取效率最高，所以确定用水作萃取剂，萃取时间为20min。同时，对萃取20min后的残渣进行二次提取，已检测不到目标成分，说明一次萃取已提取完全。
表3不同萃取时间下所提取目标组分的浓度
实施例2样品溶液净化处理的研究实验
由于再造烟叶成分较复杂，样品萃取液必须经过净化处理除去对色谱柱造成污染的成分，才可以进入离子色谱进行分析，所以本实验考察了RP柱和C18固相萃取柱的净化效果。因为待测组分含有有机基团和可离子化的基团，在中性和偏酸性的条件下，电离受到抑制，在固相柱上有一定的保留而使净化后的回收率偏低。将样品提取液用250mmol L-1的NaOH溶液调至碱性(使用高浓度的碱液可减少使用量而达到忽略体积变化的目的)，可促进酸根基团的电离，减弱其与前处理柱的相互作用，从而获得良好的回收率。由于C18柱不适合pH过高或过低的样品液，本实验采用了以聚苯乙烯/二乙烯苯高聚物为填料的RP柱对样品液进行净化。表4的结果显示：pH值对磷酸根和柠檬酸根的回收率影响不大，而对山梨酸根的回收率有较大影响。通过调节提取液的pH值，本实验确定采用把样品提取液的pH调至11，然后过RP柱的前处理方法。
表4不同pH值下的净化处理回收率
实施例3色谱条件的确定实验
本实验考察山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根分别在AS20、AS18和AS11-HC三种离子色谱柱上的出峰情况，通过比较，发现磷酸根和柠檬酸根在三种色谱柱上的分离度、峰形对称性、峰宽和灵敏度都较好，而山梨酸根的差异较大，结果表明，其在AS11-HC柱上的出峰情况最优，所以本实验选用AS11-HC色谱柱。
与磷酸根和柠檬酸根相比，山梨酸根在AS11-HC分离柱上的灵敏度相对较低，而与其相邻的硝酸根的响应却很高，为了减少硝酸根对其干扰，试验比较了不同浓度的淋洗液和柱温对两种酸根离子的分离情况、山梨酸根的信噪比和峰形对称性的影响。最终确定采用柱温为23℃，4mmol L-1的NaOH溶液为淋洗液的初始浓度，此色谱条件能使山梨酸根以较好的峰形及灵敏度与硝酸根达到基线分离(见图1，图1中峰1为山梨酸根，峰2为硝酸根，峰3为磷酸根，峰4为柠檬酸根)。
另外，本试验也考察了常见的七种阴离子和烟草中的甲酸根、乙酸根、丙酸根、乳酸根、苹果酸根、琥珀酸根、丙二酸根、草酸根等有机酸根对目标组分的影响。发现这些阴离子都集中在16min前和22～35min内出峰，与待测组分有良好的分离(见图1)。
由于磷酸根和柠檬酸根是强保留离子，所以本实验采用梯度洗脱，在弱保留的山梨酸根洗脱出来以后提高淋洗液浓度使强保留组分尽快被洗脱，以此来缩短洗脱时间(见图2，图2中峰1为山梨酸根，峰2为磷酸根，峰3为柠檬酸根)。
实施例4确定工作曲线和检出限
分别用纯水和4mmol L-1的NaOH溶液配制标准溶液，在两种基质下，三种酸根离子的响应差异不大(见表5)。为简化操作，标准溶液使用纯水配制。配制山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根的混合标准储备液，浓度分别为100μg mL-1、1000μg mL-1和1000μg mL-1。分别移取0.05、0.25、0.5、0.75和1.0mL的混合储备液到25mL的容量瓶中，用超纯水定容，配制成系列标准工作溶液(见表6)并进行IC分析，以目标物的峰面积(Y)对其相应的浓度(X，μg mL-1)进行线性回归。取系列标准溶液中最低浓度的标准溶液，连续进样10次，计算数据的标准偏差(SD)，以3倍SD为方法的检出限。回归方程、相关系数和检出限见表7。
表5不同基质下三种酸根离子峰面积的比较
表6混合标准工作溶液的浓度(μg mL-1)
表7回归方程、相关系数和检出限
实施例5回收率和精密度实验
取三种再造烟叶样品，按照以下方法进行测定。
样品的前处理
根据GB/T19616和YC/T31-1996制备试样和测定样品水分，准确称取0.15g样品(精确至0.0001g)于150mL磨口三角瓶中，加入50.0mL超纯水，盖上瓶塞，置于振荡器上振荡萃取20min。将萃取液过滤膜后，用250mmol L-1NaOH溶液调节pH至11。取5mL pH＝11的样品溶液，以0.5mL min-1的流速通过已活化(分别用5mL甲醇和10mL超纯水活化)的RP柱，弃去前3mL溶液，收集后面的2mL溶液进行离子色谱分析。
色谱条件
离子交换柱：AS11-HC(4×250mm)；柱温：23℃；淋洗液：KOH溶液；流速：1.5mL min-1；梯度洗脱程序：4mmol L-1(0～23min)，4～30mmol L-1(24～35min)，30mmol L-1(36～39min)，4mmol L-1(40～44min)；进样量：50μL；抑制器电流：112mA。检测器：自循环抑制电导检测。
每个样品重复5次，结果表明(见表8)，样品中目标成分含量的相对标准偏差(RSD)为0.18％～0.57％，说明方法的重复性较好。取已知含量的样品溶液，分别加入三个浓度水平的标准溶液进行IC分析，计算回收率，结果显示(见表9)，回收率在97.1％～102.7％之间，说明方法的准确度较高，可以满足定量分析的要求。
表8方法重复性(n＝5)
表9样品中三种酸根离子的回收率
实施例6样品的实际测定
样品的前处理
根据GB/T19616和YC/T31-1996制备试样和测定样品水分，准确称取0.15g样品(精确至0.0001g)于150mL磨口三角瓶中，加入50.0mL超纯水，盖上瓶塞，置于振荡器上振荡萃取20min。将萃取液过滤膜后，用250mmol L-1NaOH溶液调节pH至11。取5mL pH＝11的样品溶液，以0.5mL min-1的流速通过已活化(分别用5mL甲醇和10mL超纯水活化)的RP柱，弃去前3mL溶液，收集后面的2mL溶液进行离子色谱分析。
色谱条件
离子交换柱：AS11-HC(4×250mm)；柱温：23℃；淋洗液：KOH溶液；流速：1.5mL min-1；梯度洗脱程序：4mmol L-1(0～23min)，4～30mmol L-1(24～35min)，30mmol L-1(36～39min)，4mmol L-1(40～44min)；进样量：50μL；抑制器电流：112mA。检测器：自循环抑制电导检测。
采用本方法对26个再造烟叶样品进行测定，结果见表10，其中再造烟叶中山梨酸根的质量分数为5.5～741.2μg g-1，磷酸根的质量分数为59.3～6977.9μg g-1，柠檬酸根的质量分数为259.2～9642.7μg g-1。
表10实际样品中三种酸根离子的含量
本发明建立了以RP柱为净化柱，AS11-HC为分离柱的离子色谱法测定再造烟叶中山梨酸根、磷酸根和柠檬酸根含量的方法。该方法简单、准确、可靠，重复性好，适用于再造烟叶制造过程中使用这三种物质时其残留量的评价。另外，本发明方法同时适用于烟草的测定。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。