本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种二维液相色谱检测复方南星止痛膏的方法。
背景技术：
近年来，随着商品化二维液相色谱仪器技术的逐渐成熟，出现了中心切割、多中心切割和全二维液相色谱等结合多种分离模式的二维液相色谱，其可分为在线和离线两种方式，其中在线二维液相色谱可以选择性的将一维馏分转移至第二维色谱柱中进行分析，能很好地解决常规色谱分离能力有限的问题。
复方南星止痛膏由生天南星、生川乌、丁香、肉桂、白芷、细辛、川芎、徐长卿、乳香、没药、樟脑、冰片12味药组成，是传承祖国多部医学经典而成的止痛组方，具有散寒除湿、活血止痛之功效。生川乌作为组方中的君药，具有祛风除湿、温经止痛之功效，其中双酯型生物碱作为其特征活性成分，具有镇痛作用的同时还具有较强的毒性。由于复方南星止痛膏的成分极其复杂，且含有凡士林、液体石蜡等辅料，样品的前处理方法较为繁琐，该制剂的现行质量标准仅采用HPLC法对其中的次乌头碱进行含量测定。因此，建立同时测定制剂中多个双酯型生物碱的检测方法非常必要。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明旨提出一种复方南星止痛膏双酯型生物碱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，供试品溶液的制备，取复方南星止痛膏样品经提取、除杂，制得供试品溶液；
步骤二，吸取供试品溶液，采用二维液相色谱方法进行双酯型生物碱的测定。
具体地，所述二维液相色谱方法采用以下方法进行：
一维色谱方法：C18色谱柱一，流动相A为甲醇，流动相B为0.001～0.02％的二乙胺或三乙胺，流速0.05～0.2mL·min-1，柱温15～20℃，用40～70％的流动相A梯度洗脱40min，检测波长230～240nm，进样量1～3μL，样品盘温度为8～20℃；
阀切换方法：阀切换时间为所述双酯型生物碱起始出峰时间至结束；
二维色谱方法：C18色谱柱二，流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为0.005～0.02％的磷酸或二乙胺，流速0.5～0.8mL·min-1，柱温35～45℃，用30～90％的流动相A梯度洗脱4min，检测波长230～240nm。
优选地，所述二维液相色谱方法采用以下方法进行：
一维色谱方法：所述C18色谱柱一规格为1×50mm，1.7μm，流动相A为甲醇，流动相B为0.008％DEA，流速为0.1mL·min-1，柱温18℃；梯度洗脱，0～12min，40～58％A，12～25min，58％～58％A，25～35min，58％～65％A，35～40min，65％～70％A，40～42min，70％～70％A，42～45min，70％～100％A，45～48min，100％～40％A；检测波长235nm，进样量1μL，样品盘温度为10℃；
阀切换方法：阀切换时间为所述双酯型生物碱起始出峰时间至结束；
二维色谱方法：所述C18色谱柱二规格为3.0×100mm，1.7μm，流动相A为乙腈，流动相B为0.01％磷酸，流速为0.7mL·min-1，柱温40℃；梯度洗脱，0～1min，30％～38％A，1～3min，38％～48％A，3～4min，48％～90％A，4～4.2min，90％～30％A；检测波长235nm。
具体地，所述C18色谱柱一和所述C18色谱柱二选自Waters XBridge BEH C18色谱柱，
进一步地：所述步骤一中的提取、除杂为：取本品加甲醇适量，研匀，定量转移至量瓶，超声处理，加甲醇稀释至刻度，摇匀滤过，弃去初滤液，取续滤液，减压回收至干；加入盐酸溶液，微热使残渣溶解，摇匀，置冰箱中冷藏，滤过，取续滤液，置分液漏斗中，用氯仿分次提取，合并氯仿提取液，用无水碳酸钠脱水，滤液减压回收至干，残渣用甲醇溶解并定容，摇匀，离心，即得。
具体地，所述提取、除杂方法为，取本品10片，除去衬布，刮取药膏，取相当于2片量约8g，精密称定，置研钵中，加甲醇适量，研匀，定量转移至100mL量瓶中，超声处理1h，放置1h，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液50mL，减压回收至干。精密加入2％的盐酸溶液100mL，微热使残渣溶解，摇匀，放冷，置冰箱中冷藏1h，滤过，精密量取续滤液50mL，置分液漏斗中，用氯仿分次提取(40、40、40、30mL)，合并氯仿提取液，用无水碳酸钠脱水，滤液减压回收至干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL，摇匀，14000r·min-1离心10min，即得。
进一步地，所述双酯型生物碱包括但不限于新乌头碱、乌头碱和次乌头碱。
本发明提出了一种复方南星止痛膏的检测方法，其特征在于，所述方法采用二维液相色谱方法对双酯型生物碱进行定性或定量检测。
具体地，所述二维液相色谱方法包括一维色谱分析和二维色谱分析；其中，所述一维色谱分析选择甲醇-0.001～0.02％的二乙胺或三乙胺作为其流动相体系。
进一步地，所述二维色谱分析选择甲醇或乙腈-0.005～0.02％的磷酸或二乙胺作为其流动相体系。
优选地，以甲醇-0.008％DEA为所述一维色谱分析的流动相体系，以乙腈-0.01％磷酸为所述二维色谱分析的流动相体系。
本发明的提取分离方法具有如下优点：
(1)在线二维液相色谱可以选择性地将一维馏分转移至第二维色谱柱中进行分析，能很好地解决常规色谱分离能力有限的问题，使常规检测方法中难以检测的新乌头碱、乌头碱也能检测出来。
(2)由于本发明提出的方法对样品前处理中的除杂要求不高，因而可以简化样品前处理方法。
(3)在本发明提出的检测条件下，可检测到明显的新乌头碱和乌头碱，极大地排除了杂质成分的干扰、改善分离效果并提高检测灵敏度。
(4)本发明对复方南星止痛膏的检测方法重复性良好，能够有效分离待测组分，测定结果稳定、准确，可应用于制剂中多个双酯型生物碱类成分的同时定量。本发明提出的方法有效改善了复方南星止痛膏中待测组分的分离度，极大提高了检测灵敏度，提高产品的质量控制水平，并为临床用药提供理论支持。
(5)在样品溶液制备过程，对复方南星止痛膏的提取、除杂过程，能够使杂质降到最低，提高后续的分离效果。
(6)本发明的检测方法对传统液相色谱的优化，提高系统的峰容量，增强色谱系统的分离能力，对制剂的复杂组分进行快速分离。由于其在线分析模式的建立，消除了人为操作的误差，加快了样品的分析效率，保证了样品分析结果的准确性和稳定性，有效解决了复方南星止痛膏组分中微量成分定量难的问题。
附图说明
图1为超高效二维液相色谱系统的配置及连接示意图；
图2为新乌头碱(A)、乌头碱(B)及次乌头碱(C)对照品全波长扫描谱图；
图3为甲醇-0.008％DEA/乙腈-0.02％DEA二维UHPLC分离谱图；
图4为甲醇-0.008％DEA/乙腈-0.01％磷酸二维UHPLC分离谱图；
图5为混合对照品超高效二维液相分离谱图(A：一维UHPLC分离谱图；B：二维UHPLC分离谱图)；
图6为复方南星止痛膏超高效二维液相分离谱图(A：一维UHPLC分离谱图；B：二维UHPLC分离谱图)；
图7为缺生川乌阴性制剂超高效二维液相分离谱图(A：一维UHPLC分离谱图；B：二维UHPLC分离谱图)；
图8为复方南星止痛膏一维检测图谱(保留时间为40.308处的色谱峰为次乌头碱)；图9为图8同一检测条件下的混合对照品溶液图谱(由左至右三个峰分别为新乌头碱，乌头碱，次乌头碱)。
以上附图中：1：新乌头碱，2：乌头碱，3：次乌头碱。
具体实施方式
如前所述，本发明旨在提供一种复方南星止痛膏双酯型生物碱的检测方法。
实验仪器：Agilent 1290Infinity II二维液相色谱系统(包括1290InfinityⅡ高速泵、1290InfinityⅡ自动进样器、1290InfinityⅡ柱温箱、1290InfinityⅡ二极管阵列检测器、1290InfinityⅡ二元泵，用于第二维分析、1290InfinityⅡ二极管阵列检测器，用于第二维分析、外置阀驱动)、BUCHI R-3型旋转蒸发仪、KH-300DB型数控超声波清洗器、ME303E型电子天平、XS205DU型电子分析天平。
试剂与试药：次乌头碱(中国食品药品检定研究院，批号110798-201609)、乌头碱(中国食品药品检定研究院，批号：110720-201111)、新乌头碱(中国食品药品检定研究院，批号：110799-201307)、复方南星止痛膏(江苏康缘阳光药业有限公司，批号：160510、170707、160609、160713、160708、161126、160720、170621、170626、170218)、乙腈(Tedia，批号：16045019)、甲醇(Tedia，批号：17095089)、无水甲醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20151214)、氯仿(南京化学试剂股份有限公司，批号：170424921D)、无水碳酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20130513)、二乙胺(国药集团化学试剂有限公司，批号：20161214)、磷酸(南京化学试剂有限公司，批号：13072211046)、水为超纯水。
本发明未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料、所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
以下将结合实验内容进行具体描述。
复方南星止痛膏双酯型生物碱的检测方法
1对照品溶液的制备
分别称取新乌头碱、乌头碱、次乌头碱对照品各适量，精密称定，置于10mL量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容至刻度，得浓度分别为0.990mg·mL-1、0.820mg·mL-1和1.370mg·mL-1的对照品储备液。
2供试品溶液的制备
取本品10片，除去衬布，刮取药膏，取相当于2片量约8g，精密称定，置研钵中，加甲醇适量，研匀，定量转移至100mL量瓶中，超声处理1h，放置1h，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液50mL，减压回收至干。精密加入2％的盐酸溶液100mL，微热使残渣溶解，摇匀，放冷，置冰箱中冷藏1h，滤过，精密量取续滤液50mL，置分液漏斗中，用氯仿分次提取(40、40、40、30mL)，合并氯仿提取液，用无水碳酸钠脱水，滤液减压回收至干，残渣用甲醇溶解并定容至2mL，摇匀，14000r·min-1离心10min，即得。
3色谱条件
超高效二维液相色谱系统的配置及连接如图1所示，二维液相色谱检测的条件具体为：
一维色谱方法：Waters XBridge BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色谱柱，流动相A为甲醇，B为0.008％DEA，流速为0.1mL·min-1，柱温18℃，梯度洗脱，0～12min，40～58％A，12～25min，58％～58％A，25～35min，58％～65％A，35～40min，65％～70％A，40～42min，70％～70％A，42～45min，70％～100％A，45～48min，100％～40％A；检测波长235nm，进样量1μL，样品盘温度为10℃；
阀切换方法：阀切换时间为三个双酯型生物碱起始出峰时间至结束，共3个片段，定量环体积为80μL。
二维色谱方法：Waters XBridge BEH C18(3.0×100mm，1.7μm)色谱柱，流动相A为乙腈，B为0.01％磷酸，流速为0.7mL·min-1，柱温40℃，梯度洗脱，0～1min，30％～38％A，1～3min，38％～48％A，3～4min，48％～90％A，4～4.2min，90％～30％A，检测波长235nm。
4检测结果
4.1检测波长选择
为了选择合适的检测波长，实验中将混合对照品溶液进行全波长扫描，结果见图2，可以发现新乌头碱、乌头碱及次乌头碱的最大吸收波长均在235nm左右。
4.2检测波长选择
为了保证目标化合物能够完全被切割进入第二维进行分析，在一维色谱系统水相的选择上尝试了不同比例的磷酸-DEA缓冲盐、DEA(二乙胺)、三乙胺等体系，优选为甲醇-0.008％DEA体系，该体系下目标化合物的峰宽较小，便于进行中心切割操作。在第二维色谱条件选择上，为了保证收集到的目标组分能够分析完全且不干扰下一个目标化合物的分析，优选将有机相改为洗脱能力更强的乙腈，可有效缩短分析时间。为了消除其他杂质对目标化合物峰分离的干扰，在水相选择上尝试了0.02％DEA和0.01％磷酸，二维流动相体系分离效果见图3和图4(1：新乌头碱，2：乌头碱，3：次乌头碱；其它附图中的峰1、2、3所标示的均为这三种物质)。通过比较可以发现，乙腈-0.01％磷酸流动相体系可以改善目标化合物的峰形和分离度，消除其它杂质成分的干扰。因此，优选以甲醇-0.008％DEA为一维流动相系统，以乙腈-0.01％磷酸为二维流动相系统。
4.3专属性试验
精密称取无川乌阴性制剂，按照“2”项下方法制备阴性制剂待测溶液。按照“3”项色谱条件进样分析，对照品、样品制剂及阴性制剂的2D-UHPLC分离谱图见图5至图7。从阴性制剂色谱图可以看出，阴性制剂对样品的测定无干扰，方法专属性较好。
4.4线性关系
分别取“1”项下对照品储备液适量，用色谱甲醇配制成新乌头碱、乌头碱和次乌头碱浓度分别为19.80μg·mL-1、16.39μg·mL-1、27.44μg·mL-1的混合对照品溶液。采用逐级稀释的方法得系列浓度的混合标准品溶液，按“3”项下色谱条件进样分析，记录各色谱峰的峰面积，以样品浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表1。结果表明，新乌头碱、乌头碱和次乌头碱在选择的浓度范围内线性关系良好。
表1线性回归方程、相关系数及线性范围考察
4.5精密度试验
取混合对照品溶液，连续进样6针，记录各色谱峰的峰面积，并计算其RSD值，结果见表2。表明仪器的精密度良好。
4.6稳定性试验
取混合对照品溶液、供试品溶液(批次：170218)，分别于配制后0、2、4、8、10、12、18、24h进样，记录各待测成分的峰面积，并计算RSD值，结果见表2。表明对照品和供试品溶液均在24h内稳定。
4.7重复性试验
取同一批次的复方南星止痛膏制剂(批次：170218)6份，每份约8g，精密称定，按“2”项下方法制备供试品溶液，平行操作6份，按“3”项下色谱条件进行测定，记录各待测成分的峰面积，计算含量的RSD值，结果见表2。结果显示，新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量的RSD％分别为3.31％、2.95％、1.99％，符合2015年版《中国药典》关于“样品待测定成分含量为10μg·g-1时，RSD可接受范围为6％”的规定，表明方法的重复性良好。
表2精密度、稳定性及重复性考察结果(n＝6)
4.8加样回收率试验
取已知含量的样品(批次：170218)6份，每份4g，精密称定，置研钵中，加入适量的混合对照品溶液，按“2”项下方法制备供试品溶液并测定含量，计算回收率，结果见表3。结果显示，新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的平均回收率分别为83.86％、82.49％、88.84％，符合2015年版《中国药典》关于“样品待测定成分含量为10μg·g-1时，加样回收率限度应在80％～115％范围内”的规定。
表3新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的加样回收率结果(n＝6)
4.9多批次样品测定
取10批复方南星止痛膏制剂，按“2”项下方法制备样品溶液，按“3”项下色谱条件进行新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的含量测定。同时取此10批样品，采用现行标准中HPLC法测定次乌头碱的含量，结果见表4。结果显示，两种检测方法次乌头碱的含量基本一致，均符合现行质量标准中关于“本品含乌头以次乌头碱计，应为6～12μg·g-1”的规定，表明本方法具有较好的适用性。
表410批样品中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的含量测定结果(n＝3)
本文基于在线中心切割超高效二维液相色谱分离技术，建立了同时测定复方南星止痛膏中三个双酯型生物碱新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的分析方法。由于制剂本身成分复杂，且含有凡士林、液体石蜡等辅料，对目标成分的干扰较为严重，在一维UHPLC检测条件下仅检测到次乌头碱(见图8和图9)。因此，本实验采用对照品保留时间比对法，将制剂中与对照品保留时间一致的峰片段切入二维色谱，发现在二维UHPLC色谱图中可检测到明显的新乌头碱和乌头碱，极大地排除了杂质成分的干扰、改善分离效果并提高检测灵敏度。方法学考察结果表明，该方法的重复性良好，能够有效分离待测组分，测定结果稳定、准确，可应用于制剂中三个双酯型生物碱类成分的同时定量。
多批次样品的检测结果发现，复方南星止痛膏中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的含量分别在3.2～5.0μg·g-1、0.9～1.3μg·g-1、8.5～10.4μg·g-1范围内，且制剂中次乌头碱的含量测定结果与HPLC测定结果基本一致，说明2D-UHPLC检测方法具有较好的适用性，可用于产品的质量控制。该研究结果为中药复杂组分或复杂基质中微量成分的定性、定量研究提供有益借鉴，同时也为临床安全、合理用药提供数据支持。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。