本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种HPLC法检测迷迭香中迷迭香酸、 鼠尾草酸和熊果酸的方法。
背景技术：
迷迭香作为一种天然香料植物，含有多种有效成分，目前生产上提取使用的主要 为迷迭香精油和迷迭香天然抗氧化剂。迷迭香抗氧化剂的安全性及其在动植物油脂抗 氧化方面的突出效果已获得国际食品界公认，迷迭香提取物已被列入欧盟有机食品添 加剂名单。
迷迭香富含多酚化合物：酚酸类化合物，如迷迭香酸和咖啡酸；二萜酚类化合物， 如鼠尾草酸和鼠尾草酚；三萜类化合物如熊果酸。迷迭香酸(Rosmarinic acid)，分子 式C18H16O8，分子量360.318g/mol，CAS号：20283-92-5。鼠尾草酸(Carnosic acid)， 分子式C20H28O4，分子量332.44g/mol，CAS号：3650-09-7。熊果酸(Ursolic acid)， 分子式C30H48O3，分子量456.711g/mol，CAS号：77-52-1。迷迭香酸和鼠尾草酸作为 天然抗氧化剂已经在食品工业投入使用，熊果酸已被证明具有良好的抗肿瘤、抗病毒 效果，呈具有较低水溶性的五环结构，故在生物利用度方面有所欠缺，熊果酸的紫外 吸收较弱，且检测时易发生基线漂移，导致吸光度较低，不利于其分析检测。近年来 采用HPLC测定三种有效物质的方法较少，且流动相组成复杂，出峰时间长，峰形和 分离度不太理想。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种HPLC检测迷迭香醇提液中迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果 酸的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种HPLC检测迷迭香醇提液中迷迭香 酸、鼠尾草酸和熊果酸的方法，采用Waters e2695高效液相色谱仪(美国·Waters公司)， 本发明所述的检测方法包括以下步骤：
(1)制备标准品溶液：取迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的标准品分别用甲醇制成标准品 溶液；
(2)制备迷迭香醇提液：取迷迭香干叶进行超声辅助溶剂提取，得到醇提液；
(3)绘制标准曲线：取不同浓度的迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的标准品溶液进行HPLC 检测，获取不同浓度下三种物质的峰面积，分别绘制迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的 标准曲线；
(4)检测醇提液：取醇提液进行HPLC检测，获得醇提液中迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果 酸的峰面积，然后根据迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的标准曲线获得醇提液中迷迭香 酸、鼠尾草酸和熊果酸的含量。
所述步骤(1)中，分别精确称取迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸标准品5.0mg，用甲 醇配制成1mg/mL的母液，并梯度稀释为25、50、100、200、400、800μg/mL，HPLC 测出峰面积，并以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标分别绘制标准曲线。
所述步骤(2)中，将迷迭香干叶粉碎，过40目筛，称取0.2g粉末样品溶于4mL体 积分数90％的乙醇溶液，浸泡15min，40℃下超声提取30min，超声功率150W，5000 r/min离心10min后取上清液，残渣重复提取一次，合并上清液，定容至25mL，用 0.45μm有机系滤头过滤后进行HPLC检测。
所述步骤(3)和(4)中的色谱条件：4.6×250mm，5μm Symmetry C18色谱柱，进样 量：10μL，体积流量：1mL/min，柱温35℃。迷迭香酸检测波长为328nm，流动相： 含0.5％甲酸的水-乙腈(68:32，V/V)；鼠尾草酸和熊果酸检测波长为210nm，流动相： 含0.5％甲酸的水-甲醇(10:90，V/V)。分析迷迭香酸的波长为328nm，保留时间为4.83 min；由于熊果酸的紫外吸收非常弱，为了减少基线漂移，并且使吸光度尽可能高，减 小分析误差，波长选择210nm，保留时间为10.08min；鼠尾草酸在210nm下的吸光 度大于328nm，并且可以与其他物质较好分离，与熊果酸在同一色谱条件下进行检测， 保留时间为5.84min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明采用超声辅助溶剂提取迷迭香中迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸，提取效率高， 且绿色环保便于回收。
2.本发明使用4.6×250mm，5μm Symmetry C18色谱柱，设置两个等度色谱条件检测 迷迭香醇提液中三种有效物质，分析迷迭香酸的时间仅为8min，分析鼠尾草酸和熊果 酸的时间仅为12min，可有效提高分析效率。
3.流动相使用0.5％-甲酸水和甲醇及乙腈以不同比例搭配，流动相配制过程更简便。
附图说明
图1为迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸标准品在两种波长条件下(a：328nm，b：210nm) 的色谱图。
图2为两种波长条件下(a：328nm，b：210nm)迷迭香醇提液的色谱图。
具体实施方式
实施例1
(1)制备标准品溶液：分别精确称取迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸标准品5.0mg，用甲 醇配制成1mg/mL的母液，并梯度稀释为25、50、100、200、400、800μg/mL。
(2)制备迷迭香醇提液：将迷迭香干叶粉碎，过40目筛，称取0.2g粉末样品溶于4mL 体积分数90％的乙醇溶液，浸泡15min，40℃下超声提取30min，超声功率150W， 5000r/min离心10min后取上清液，残渣重复提取一次，合并上清液，定容至25mL， 用0.45μm有机系滤头过滤后进行HPLC检测。
(3)绘制标准曲线：HPLC测出不同浓度下迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸标准溶液的峰 面积，并以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)分别绘制标准曲线。迷迭香酸曲 线方程为：Y＝28874X-131123，R2＝0.9979；鼠尾草酸曲线方程为：Y＝28387X+1×106， R2＝0.9967；熊果酸曲线方程为：Y＝3992.6X+92240，R2＝0.9986；迷迭香酸、鼠尾草 酸和熊果酸均在100～800μg/mL内呈良好的线性关系。
色谱条件：4.6×250mm，5μm Symmetry C18色谱柱，进样量：10μL，体积流 量：1mL/min，柱温35℃。迷迭香酸检测波长为328nm，流动相：含0.5％甲酸的水- 乙腈(68:32，V/V)；鼠尾草酸和熊果酸检测波长为210nm，流动相：含0.5％甲酸的 水-甲醇(10:90，V/V)。
(4)检测醇提液：色谱条件与步骤(4)相同，获得醇提液中迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果 酸的峰面积，然后根据迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的标准曲线计算迷迭香醇提液中 迷迭香酸、鼠尾草酸和熊果酸的含量。
(5)样品测定：称取三份迷迭香粉末，按上述方法进样提取检测，结果如下：
表1 重复性实验各物质得率
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的 上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不是限制，因此凡是依据本发明的实质 技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的 范围内。