本发明涉及一种简单、快速、高灵敏度、分离能力强及稳定性好的同时分析卷烟主流烟气中39种酚的色谱检测方法，属于烟草化学成分的测定方法技术领域。
背景技术：
烟草经处理制成卷烟燃烧时，烟草中的多酚物质因挥发性低，使得燃吸时很少直接转入烟气中，而是通过热分解成酚进入烟气，因此卷烟烟气中的酚类物质大多为单羟基苯酚、二羟基苯酚与三羟基苯酚等。卷烟主流和测流烟气中主要的酚类成分有7种，分别为苯酚、邻-苯二酚、间-苯二酚、对-苯二酚、邻-甲酚、间-甲酚、对-甲酚。由于大多数酚对皮肤及呼吸道粘膜有强烈的刺激作用，且影响卷烟的口感，如引起涩味、辣味、余味不干净等，特别是烟气冷凝物中的儿茶酚(邻-苯二酚)有较强的辅助促癌作用，因此，烟气中的酚类已列入烟气中7类主要有害成分之一，但已有的文献报道对烟气中酚类的检测只包含主要的7种，无法完全反映卷烟烟气中酚类的组成及含量，因此，尽可能多的对烟气中的酚同时定性与定量分析显得尤为重要。
酚类化合物均含有羟基官能团，且属于极性较强的半挥发性物质，因此目前液相色谱法是分析卷烟烟气中酚类物质的常用方法，但完全分离间-甲酚和对-甲酚及其它酚的异构体一直是该方法的瓶颈。直接进样气相色谱法也有研究报道，但非衍生化方法进样分析时，由于存在强极性基团-羟基，分析时易产生基质效应，峰拖尾与干扰等现象，从而导致定量分析不准确。此外，水溶性较强的极性酚易导致方法的提取效率降低。为了克服上述缺陷，常采用衍生化方法将羟基转化为极性较小的衍生化产物进行分析。常见的衍生化方法有硅烷化、烷基化与酰基化，最为常见的衍生化试剂有双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、2,3,4,5,6-五氟溴苄、烷基氯甲酸酯等，但这些衍生试剂存在衍生反应时间长，衍生产物稳定性差，价格较昂贵、且有些试剂为强的催泪剂等缺点。
综上所述，在烟草化学成分的测定技术领域中，目前还没有建立一套简单、快速、高灵敏度且稳定性好的卷烟主流烟气中39种酚同时定性与定量的分析方法。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：提供一种同时分析卷烟主流烟气中39种酚的色谱检测方法，该方法具有简单、快速、高灵敏度、分离能力强及稳定性好的特点，可以有效提高样品检测的数据准确性，以克服现有技术的不足。
本发明的技术方案是：一种同时分析卷烟主流烟气中39种酚的色谱检测方法，包括以下步骤：
(1)卷烟主流烟气的捕集：利用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气；
(2)卷烟主流烟气样品中酚的提取：将酚的内标溶液和提取溶液加入到放置有剑桥滤片的容器中，超声提取后，将提取后的上层清液通过滤膜得滤液；
(3)酚的衍生化：取滤液于离心管中，加入乙酸水溶液与衍生化试剂混匀，缓慢加入碳酸氢钠，涡旋混匀溶解后静置，再加入碳酸钾溶液与衍生化试剂涡旋混匀后静置；
(4)酚的萃取与富集：向衍生化后的溶液中加入氯化钠，涡旋溶解后加入分散溶剂与萃取溶剂，涡旋振荡混匀形成微小液滴，提取酚的乙酰化衍生产物，离心，吸取离心管中的沉淀相并将其转移至色谱进样瓶中；
(5)分析检测：用气相色谱-质谱检测器对进样瓶中的酚进行分析检测。
在分析检测时，对有标准品的酚进行绝对定量，对未有标准品的酚进行相对定量。
步骤(2)中提取溶液为1％乙酸水溶液，内标溶液为2-甲氧基苯酚-D3。
步骤(3)中衍生化试剂为乙酸酐。
步骤(4)中分散溶剂为丙酮，萃取溶剂为四氯化碳，其中丙酮与四氯化碳体积比为4:1。
步骤(5)中气相色谱-质谱条件是：气相色谱柱为DB-1701，30m×0.25mm i.d×0.25μm d.f，进样体积：1μL，进样口温度280℃，分流进样，分流比为20:1，载气为氦气，恒流模式，流速为1.0mL/min，柱温箱为程序升温，50℃保持3min，以18℃/min升至160℃，保持4min，以20℃/min升至260℃，保持5min，一共运行23.11min；离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，电离能70eV，传输线温度为280℃，溶剂延迟8.3min，扫描模式为全扫描与选择离子扫描同时采集，全扫描质量范围45～400amu。
本发明的有益效果是：本发明建立了一种1％乙酸水溶液超声提取-乙酸酐衍生化-分散液液微萃取提取与富集-气相色谱-质谱同时测定主流烟气中的39种酚类物质的方法。与现有技术相比，本发明的优点在于：1)增加了方法定性与定量的物质种类，能同时分析39种酚；2)乙酸酐衍生试剂具有反应时间短，衍生化产物稳定，价格低廉且易获得，毒性也较小等优点；3)分离能力提高，能有效分离间-甲酚和对-甲酚；4)具有简单、快速、高灵敏度且稳定性好的特点，可以有效提高样品检测的数据准确性。
附图说明
图1是本发明方法的流程图；
图2是常见7种酚标准品的乙酰化产物气相色谱-质谱色谱图；
图3是卷烟主流烟气中39种酚的乙酰化产物气相色谱-质谱色谱图。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施例对发明进行进一步介绍：
实施例1：
参考图1流程图，根据本发明一种同时分析卷烟主流烟气中39种酚的色谱检测方法，包括以下步骤：
(1)按GB/T 5606.1-2004的方法挑选卷烟烟支，在温度22±1℃、相对湿度60％±2％条件下平衡48h，使用SM450直线型吸烟机，按照GB/T 19609-2004的方法，采用ISO抽吸模式收集4支卷烟的主流烟气于44mm剑桥滤片上，留取滤片。
(2)将剑桥滤片置于50mL锥形瓶中，准确加入15μL浓度为1.04mg/mL的同位素内标溶液(2-甲氧基苯酚-D3)后用20mL提取溶液(1％乙酸水溶液)，振荡混匀1min后常温下超声提取30min，再次振荡混匀1min后，取上层清液过0.45μm水系滤膜待测。
(3)取1mL过滤液于10mL玻璃离心管中，加入3mL1％乙酸水溶液与60μL衍生化试剂(乙酸酐)后混匀，缓慢加入0.2g碳酸氢钠，涡旋混匀溶解后静置2min，再加入0.1mL质量分数50％碳酸钾溶液与60μL乙酸酐涡旋混匀后静置2min。
(4)向衍生化后的溶液中缓慢加入0.5g氯化钠，涡旋溶解后加入分散溶剂与萃取溶剂330μL(分散溶剂丙酮与萃取溶剂四氯化碳体积比4:1)，涡旋振荡混匀2min提取酚的乙酰化衍生产物(注意开盖放一次气，溶液中有少量的二氧化碳气体)，3500rpm离心5min，用100μL微量进样针吸取离心管中的沉淀相(25～28μL)，将其转移至150μL微量进样瓶中用气相色谱-质谱检测器进行分析检测。
(5)用气相色谱-质谱检测器进行定性及定量分析，分别以保留时间、NIST08、Wiley08、保留指数或标准物质进行定性分析，内标法进行定量分析。定量以2-甲氧基苯酚-D3为内标分别进行绝对定量与相对定量。利用标准曲线绝对定量苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、邻甲基苯酚、间甲基苯酚、对甲基苯酚；利用内标2-甲氧基苯酚-D3按照校正因子F＝1相对定量其它32种酚。
气相色谱条件如下：
气相色谱柱为DB-1701，30m×0.25mm i.d×0.25μm d.f，进样体积：1μL，进样口温度280℃，分流进样，分流比为20:1，载气为氦气，恒流模式，流速为1.0mL/min，柱温箱为程序升温，50℃保持3min，以18℃/min升至160℃，保持4min，以20℃/min升至260℃，保持5min，一共运行23.11min；离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，电离能70eV，传输线温度为280℃，溶剂延迟8.3min。扫描模式为全扫描与选择离子扫描同时采集，全扫描质量范围45-400amu；39种酚的保留时间与指数、定量与定性离子、定性方式、分段时间、驻留时间、样品方法重复性与乙酰化衍生产物稳定性如下表1所示：
表1主流烟气中39种酚及同位素内标的质谱及稳定性分析结果
用1％乙酸水溶液配制相应浓度的母液，将母液混合并用1％乙酸水溶液稀释成5个浓度梯度的混合标样，取一定量的混合标样与15μL同位素内标(2-甲氧基苯酚-D3)，用1％乙酸水溶液稀释为4mL，按照(3)、(4)与(5)的条件进行衍生化与色谱分析(标样与样品色谱图如图2与3所示)，以目标化合物峰面积与内标物峰面积的比为纵坐标(y)，目标化合物的量与内标量(15.6μg)的比值为横坐标(x)进行回归分析，得到回归方程及相关系数，将最低浓度的标准溶液按照信噪比为3(S/N＝3)计算方法的最低检测限(LOD)，向3R4F肯塔基标准样的主流烟气剑桥滤片中添加两个浓度梯度的标准溶液后进行提取，衍生化与色谱分析，计算其回收率。回收率为添加后样品的酚类含量减去空白样品酚类的含量除以添加的酚类含量，添加浓度分别大约为空白样品中含量的1/2与1倍添加进行，方法的精密度为将低浓度与高浓度添加在同一天内重复5次，计算其测定结果的相对标准偏差。结果如表2与3所示。方法对样品中其它酚类物质的重复性为同一天内重复5次分析检测，计算其相对标准偏差；乙酰化酚衍生产物稳定性测试在4℃保存条件下1d、3d、5d及7d后的峰面积变化，计算对应的相对标准偏差。方法对样品中其它酚类物质的重复性与乙酰化酚衍生产物稳定性见表1。
表2常见7种酚标样的线性范围、标准曲线、相关系数与检测限
表3常见7种酚标样的添加回收率与精密度
结果表明：本发明方法线性相关系数都大于0.9990，表明方法的线性较好。方法的浓度检测限与烟支检测限分别在0.053～0.087ng/mL与1.06～1.74ng/之间，酚的回收率在95.2％～102.0％之间，回收率良好，精密度范围在1.1％～4.8％之间，符合严格的定量要求。方法对样品中其它酚类物质的重复性与乙酰化酚衍生产物稳定性都小于6.99％与2.89％，只有莨菪亭重复性与稳定性稍差，分别为10.5％与3.78％。
实施例2：
为了比较不同焦油含量卷烟之间的酚含量组成，采取实施例1的方法对低焦油(3mg)、中焦油(11mg)与高焦油(15mg)卷烟的主流烟气中的酚进行分析，测定结果如下表4所示：从检测结果可知，不同焦油含量的卷烟主流烟气中酚组成差异较大，焦油含量越高，酚含量越高。同一焦油含量的卷烟主流烟气中7种常见酚(苯酚、邻-苯二酚、间-苯二酚、对-苯二酚、邻-甲酚、间-甲酚、对-甲酚)的含量占有60％左右，表明7种常见酚在其中占有量较高，较好的解释了常规检测中主要分析上述7种物质。将酚分为单羟基酚，二羟基酚，三羟基酚，其中二羟基酚占85～87％左右，单羟基酚占12～13％，三羟基酚占1～2％，表明烟叶主流烟气中主要为二羟基酚。由于二羟基酚具有较高的毒性，需要重点关注其含量组成。
表4不同焦油含量卷烟的主流烟气中酚的组成
a酚未有效分离，且定量离子也相同，计算其总量为最终结果
结果表明：采用本发明的检测方法可快速、准确的得出卷烟主流烟气中39种酚的组成。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。