本发明涉及一种用于早期诊断肺癌的基于6种肺癌相关自身抗原的自身抗体检测的蛋白质芯片，以及由此蛋白质芯片衍生的诊断试剂盒。本发明进一步提供了该蛋白质芯片以及由此蛋白质芯片衍生的诊断试剂盒在肺癌早期诊断、健康人群或肺癌高危人群的早期肺癌筛查中的应用。
具体的，本发明涉及一种可用于血清学检测早期诊断人肺癌的蛋白质芯片，该蛋白质芯片可以通过检测6种肺癌相关的自身抗原在被检人血液样品中的各自的相应igg型和igm型自身抗体的相对含量，并联合分析这6种自身抗原相应抗体检测的结果，来判定被检人是否患有肺癌。进一步，本发明还涉及由此蛋白质芯片衍生的诊断试剂盒，这些诊断试剂盒均采用或包含了此蛋白质芯片。另外，本发明还涉及该蛋白质芯片及衍生的诊断试剂盒在早期肺癌诊断、健康人群或肺癌高危人群的早期肺癌筛查中的应用。
背景技术：
肺癌是全球死亡率和发病率最高的恶性肿瘤之一。根据美国癌症中心的最新数据，肺癌死亡率占癌症死亡总人数的27％，比常见的结肠癌，乳腺癌和胰腺癌死亡人数总和还要多。世界卫生组织在2001年曾经发布警告：在过去的10年中，全球肺癌的发病率每年以22％的速度在飞快上升，每年全球新增肺癌患者达120万人，死亡110万人。据北京市卫生局提供的统计数据显示，2010年肺癌位居北京市户籍人口男性恶性肿瘤发病的第一位，在女性中居第二位，仅次于乳腺癌。2001至2010年，北京市肺癌发病率增长了56％。全市新诊断出的癌症中有五分之一为肺癌。据流行病学专家预测，如果不控制吸烟和空气污染，到2025年，我国肺癌患者将超过100万，成为世界第一肺癌大国。
现有临床相关数据显示，肺癌的5年存活率是16.6％，显著低于其他常见癌症，如结肠癌(64.2％)，乳腺癌(89.2％)和前列腺癌(99.2％)。肺癌的预后与其发展阶段紧密相关，局限性肺癌五年存活率为53％，而在出现转移的情况下五年存活率仅为4％。肺癌的早发现和早防治能显著提高患者的存活率和生活质量。
然而，由于肺癌发展早期大多无明显症状，临床上只有10％-15％的肺癌能在早期被发现。由于早期肺癌病人无体征，因而到医院就诊的病人绝大多数是中晚期病人。提高早期肺癌、肺癌的诊断率，将亚临床肺癌或隐匿性肺癌从人群中筛查出来，对于提高肺癌的治愈率及降低死亡率具有重大的意义。
目前肺癌的诊断主要分为2类：侵入性诊断和非侵入性诊断。侵入性诊断包括穿刺活检、手术探查等创伤性手段；非侵入性诊断包括各种影像学诊断手段(如x光胸片、ct、核磁共振、pet等)、细胞学检查，以及各种体液中某些肺癌或肿瘤标志物的检测。肺癌的侵入性诊断痛苦大，病人不愿意接受，一般只用于临床的鉴别诊断和确诊。肺癌最常用的诊断手段还是非侵入性诊断，在目前尤其是指影像学诊断和细胞学诊断。
40年前胸部x光片就已作为早期肺癌的诊断和筛查手段之一，尽管这种技术费时，费用也高于细胞学检查，但确实能发现一些痰检阴性的早期肺癌，优于痰细胞学。但x光片通常只能检出大于1.5cm病灶的肺癌，而对更早期的肺癌、隐匿性、可疑肺癌及癌前病变均不能检出。
自70年代英国科学家housfield发明ct用于肺癌的诊断以来，先进的影像设备和技术的应用使得对早期肺癌的检出率也有所提高。近年来美国、日本一些发达国家将螺旋ct技术用于人群早期肺癌的筛查。1993年美国的早期肺癌普查方案对1000例自愿者高危人群采用低剂量螺旋ct筛查，发现233例有1-6个非钙化结节，其中27例确诊肺癌，早期肺癌23例(85％)，而同期x光片漏诊率为83％。随着医学影像学的发展，低剂量螺旋ct被广泛用于检测肺部早期结节。根据2011年6月发表在《新英格兰医学杂志》上的美国国家肺癌筛查临床试验数据显示，使用低剂量螺旋ct进行肺部筛查使高危人群的肺癌致死率降低了20％(aberledr,etal.(2011)reducedlung-cancermortalitywithlow-dosecomputedtomographicscreening.nengljmed365(5):395-409.)。因此，美国国家癌症研究所推荐低剂量螺旋ct是肺癌早期筛查的有效手段。同时，美国国家癌症研究所也明确指出，低剂量螺旋ct的问题在于其检测结果的高假阳性，而且多次ct检测还有可能加速肺癌的恶化。
近几年发展起来的另一种新技术pet对肺癌诊断的敏感性和准确性又有进一步的提高。美国、日本、德国、加拿大等各国报道的结果显示，pet在分辨恶性与良性非钙化结节的敏感性、特异性均高于螺旋ct，可达85％和90％。但是，pet不能检出小于1.5cm的肺癌病灶，在早期肺癌的诊断上无显著优势，且设备价格更昂贵。
综上所述，现有影像学设备和技术，在我国目前的国情下均不可能单独用于人群早期肺癌的筛查和诊断，需要联合其他肺癌早期诊断或筛查技术以解决假阳性率高和敏感性有时不高的问题。但它们在确诊早期肺癌中有一定的意义。
支气管纤维镜检在肺癌诊断中的应用，主要是用于痰检和x光胸片发现异常或ct发现非钙化结节的病例，通过支纤镜检确定病变，并取活检组织或洗液，再进一步进行病理或细胞学确诊。通常对于有经验的大夫，支纤镜检可发现约30-40％的早期癌，难以检出癌前病变和原位癌。近年来出现了荧光支气管镜，有助于确定活检部位，发现早期肺癌，并有助于判断手术范围，同时还能检出癌前病变。美国、加拿大报道的结果显示，其原位癌和癌前病变检出率是普通白光支纤镜的几倍。但这一设备价格昂贵，对操作人员专业水平要求很高，检测费也贵，是痛苦有创性检测技术，对中心型早期肺癌和癌前病变，检出率较高，对周围型肺癌检出率低。因此这一技术和设备也不可能作为肺癌早期诊断和筛查人群的技术方法。
痰细胞学检测技术阳性检出率低，中晚期病人的检出率为60-80％，而早期肺癌的检出率仅有10-20％。美国nci的肺癌早期发现实验中，不足10％的肺癌是由细胞学单独发现。近年来国外发展一种新的痰细胞学检测技术(thinprep即液基超薄细胞电脑扫描技术)，目前已发展出第三代自动化设备autocyteprepandautopap系统，该技术能制备出质量很高的超薄细胞片，从而提高痰检的检出率，对早期肺癌诊断的敏感性可提高到40-60％。但该技术需价格昂贵的进口设备，每份标本处理的试剂费为100元人民币，操作人员需较高的专业水平。国外主要在大医院里应用，用于人群早期肺癌筛查的报道甚少。国内目前仅有几个大城市的极少医院有此设备，开展了这项技术。因此，在我国现有国情下不可能用于肺癌早期诊断和大人群筛检。此外，该技术的致命缺点是对于周围型和边缘型早期肺癌检出率较低。
随着分子生物学的迅速发展，在研究肺癌病因的同时，也在分子水平上对肺癌发生发展有了更多的了解。已有的研究表明在肺癌发生发展的多阶段过程中，细胞形态的恶性生物学改变伴随着其分子水平的多种基因参与和改变，它们包括癌基因的扩增、过度表达、突变和抑癌基因的缺失、突变、易位、重排等等多种基因的改变。到目前为止，已报道的与肺癌发生相关的基因异常改变约有十余种。最常见的癌基因改变有ras家族、myc家族、her2、bcl-2的过度表达等等。同时发现p53、rb、cdkn2、dutt1、fhit、bap-1等抑癌基因的突变、缺失、转导、易位及甲基化等改变。细胞遗传学和分子生物学技术的分析，还发现多个染色体上某些基因的改变与肺癌的发生发展密切相关。近年来还发现端粒酶，hnrnpa2/b1有较高的癌变预测意义。近年来还发现了一些在肺癌中异常表达或存在的mirna(小rna，microrna，mirna)和lncrna(长链非编码rna，longnon-codingrna，lncrna)。为检测这些基因的改变，相继建立和发展起来多种分子生物学检测技术，如各种pcr技术(rt-pcr.pcr-sscp.pcr-rflps)，各种核酸杂交技术(southern、northern、比较基因组杂交技术等)和直接测序技术等，以及近年来发展起来的荧光原位杂交技术(fish)和微卫星多态性分析技术等。但这些技术对肺癌的诊断均需依赖于病灶组织或病变细胞的获得，阳性样本的获取均有较大的难度，而且难于在肺癌的早期阶段采集到所需的标本，使这些技术在肺癌的早期诊断中难以发挥相应的作用。一些血液型的dna或rna标志物的诊断作用尚未得到大规模人群检测的验证，其早期诊断肺癌的能力尚存很大的疑问。加之这些技术需要特殊试剂和仪器、操作复杂、价格昂贵、其敏感性、特异性和准确性尚难以定论，目前国内外均未将这些技术作为人群普查筛检早期肺癌的手段和方法。
目前大约已经发现了60余种蛋白类的血液型肺癌生物标志物，它们或与人肺癌直接相关，或与不同种类的肺癌相关，或与肺癌预后相关，或与肺癌转移相关，或与肺癌临床分期相关，或与肺癌耐药相关等等。这些标志物包括：ace、adh、afp、agnors、anp、ahh、bloodgroupantigens、bn/grp、ca125、ca19-9、ca242、ca50、cadherins、clcitonin、cathepsinb、cc10、cea、cholecystokinin-b/gastrinreceptor、ck-bb、c-n-l-myc、cyclind1、cyfra21-1、cyfra21.1、cyp1a1/gstm1、egfr、epithelialglycoprotein1、epithelialglycoprotein2、ferritin、gangliosidefucosyl-gm1(fucgm1)、glutathione-s-transferase、her2、heterogeneousnuclearribonucleoproteina2/b1、h-k-n-ras、igf-i、il-2r、integrins、ki-67、lewisantigens、le-y、mmp-9、muc1、ncam、neuac、nse、p53、pcna、peptidhormonesacth、phosphopyruvatehydratase、progrp、p21、sccantigen、sialylssea-1、slx、ta-4、telomerase、tgf-a、thymidinekinase、tpa、transferrin、upa等等(kulpa,j.,wojcik,e.,radkowski,a.,kolodziejski,l.,andstasik,z.cyfra21-1,tpa-m,tps,scc-agandceainpatientswithsquamouscelllungcancerandinchemicalindustryworkersasareferencegroup.anticancerres.,2000,20(6d):5035-5040.nguyen,v.n.,mirejovsky,t.,melinova,l.,andmandys,v.cd44anditsv6splicedvariantinlungcarcinomas:relationtoncam,cea,emaandup1andprognosticsignificance.neoplasma,2000,47(6):400-408.alatas,f.,alatas,o.,metintas,m.,colak,o.,harmanci,e.,anddemir,s.diagnosticvalueofcea,ca15-3,ca19-9,cyfra21-1,nseandtsaassayinpleuraleffusions.lungcancer,2001,31(1):9-16.foa,p.,fornier,m.,miceli,r.,seregni,e.,santambrogio,l.,nosotti,m.,massaron,s.,cataldo,i.,oldani,s.,iurlo,a.,caldiera,s.,andbombardieri,e.preoperativecea,nse,scc,tpaandcyfra21.1serumlevelsasprognosticindicatorsinresectednon-smallcelllungcancer.int.j.biol.markers,1999,14(2):92-98.graziano,s.l.,kern,j.a.,herndon,j.e.,tatum,a.,brisson,m.l.,memoli,v.,sugarbaker,d.,skarin,a.t.,kreisman,h.,andgreen,m.r.analysisofneuroendocrinemarkers,her2andceabeforeandafterchemotherapyinpatientswithstageiiianon-smallcelllungcancer:acancerandleukemiagroupbstudy.lungcancer,1998,21(3):203-211.abe,s.[molecularbiologicalprognosticmarkersinlungcancer].nippongekagakkaizasshi,1997,98(1):2-7.fukuda,m.andoka,m.[usefulnessandlimitationofserumtumormarkersindiagnosisoflungcancer].nipponrinsho,1996,54(6):1610-1615.moro,d.,villemain,d.,vuillez,j.p.,delord,c.a.,andbrambilla,c.cea,cyfra21-1andsccinnon-smallcelllungcancer.lungcancer,1995,13(2):169-176.giovanella,l.,ceriani,l.,bandera,m.,beghe,b.,androncari,g.evaluationoftheserummarkerscea,nse,tpsandcyfra21.1inlungcancer.int.j.biol.markers,1995,10(3):156-160.niklinski,j.andfurman,m.clinicaltumourmarkersinlungcancer.eur.j.cancerprev.,1995,4(2):129-138.中文翻泽:kulpa,j.,wojcik,e.,radkowski,a.,kolodziejski,l.,andstasik,z.cyfra21-1,tpa-m,tps,scc-ag和cea在鳞状细胞肺癌病人和化工产业工人对照人群中的情况.抗癌症研究.,2000,20(6d):5035-5040.nguyen,v.n.,mirejovsky,t.,melinova,l.,andmandys,v.cd44和它的v6剪接变体在肺癌中:与ncam,cea,ema和up1以及预后因子相关.赘生物,2000,47(6):400-408.alatas,f.,alatas,o.,metintas,m.,colak,o.,harmanci,e.,anddemir,s.cea,ca15-3,ca19-9,cyfra21-1,nse和tsa试验在胸水中的诊断价值.肺癌,2001,31(1):9-16.foa,p.,fornier,m.,miceli,r.,seregni,e.,santambrogio,l.,nosotti,m.,massaron,s.,cataldo,i.,oldani,s.,iurlo,a.,caldiera,s.,andbombardieri,e.在可切除性非小细胞肺癌中术前cea,nse,scc,tpa和cyfra21.1血清水平可作为预后指标.生物标志物国际期刊,1999,14(2):92-98.graziano,s.l.,kern,j.a.,herndon,j.e.,tatum,a.,brisson,m.l.,memoli,v.,sugarbaker,d.,skarin,a.t.,kreisman,h.,andgreen,m.r.iiia期非小细胞肺癌化疗前后神经内分泌标志,her2和cea的分析:癌症和淋巴瘤组b研究.肺癌,1998,21(3):203-211.abe,s.[肺癌的分子生物学预后指标].日本gekagakkai杂志,1997,98(1):2-7.fukuda,m.andoka,m.[血清肿瘤标志物在肺癌诊断中的作用和不足].日本rinsho,1996,54(6):1610-1615.moro,d.,villemain,d.,vuillez,j.p.,delord,c.a.,andbrambilla,c.cea,cyfra21-1和scc在非小细胞肺癌中.肺癌,1995,13(2):169-176.giovanella,l.,ceriani,l.,bandera,m.,beghe,b.,androncari,g.血清标志物cea,nse,tps和cyfra21.1在肺癌中应用的评估.生物标志物国际期刊,1995,10(3):156-160.niklinski,j.andfurman,m.肺癌的临床肿瘤标志物.欧洲癌症期刊prev.,1995,4(2):129-138.)。
这些肺癌相关生物标志物中，多数属于位于胞浆的类型，另外的afp、ca125、ca19-9、ca242、ca50、cadherins、cholecystokinin-b/gastrinreceptor、epithelialglycoprotein1、epithelialglycoprotein2、her2、cea、integrins、lewisantigens、muc1、ncam等标志物位于肺癌细胞表面，大致分为三大类，受体类、细胞表面粘附分子和细胞表面糖蛋白类。总的来说，这些标志物单独诊断肺癌的意义不是太高，但联合检测仍具有一定的诊断、判断预后的意义。例如，nse在小细胞肺癌中的阳性率为60-85％，cea达50-60％，而her2仅达30-50％。
以上方法均是直接检测样品中发生改变的抗原、蛋白或基因。与以上检测方法明显不同，近年来发现肿瘤病人血液中含有针对肿瘤抗原或自身抗原的抗体，某些抗原的相应抗体在正常人和肿瘤病人中的分布呈现一定的特异性，可能具有一定的诊断价值。早在上世纪60年代，robertw.baldwin就已经证实在癌症发展的早期，人体免疫系统可以产生自身抗体，但是由于技术的限制，自身抗体在癌症发展的早期很难被检测到。现已发现，由于免疫系统的敏感性和稳定性，肺癌自身抗体可以在影像学诊断出肺癌前5年在血液中被检测出(自身抗体分子在肺癌早期诊断中的应用.贾静，任娟，黄晓明，马胜林，王孝举.实用医学杂志2013年第29卷第2期，319-321.)。qiu等用肺癌细胞系a549的分离蛋白制成芯片，对肺癌确诊前1年内的血清样本和正常对照血清样本进行检测，发现annexini、14-3-3theta和lamr1的自身抗体在无症状期就已经存在，提示自身抗体检测可作为肺癌高危人群筛查早诊的一种方法(qiuj,choig,lil,etal.wangh,occurrenceofautoantibodiestoannexini,14-3-3thetaandlamr1inprediagnosticlungcancersera.jclinoncol.nov1,2008；26(31):5060–5066.)。chapman等使用酶联免疫法比较了采用6个(p53、ny-eso-1、cage、gbu4-5、annexini和sox2)和7个(p53、ny-eso-1、cage、gbu4-5、sox2、hud和magea4)自身抗体来检测肺癌患者和健康对照组血清中相应自身抗体的含量。结果显示单一抗体检出阳性率在5～36％之间，特异性为96～100％(autoantibodiesinlungcancer:possibilitiesforearlydetectionandsubsequentcure.thorax.2008；63:228–233.)。虽然目前发现的这些种类的抗原在肿瘤病人当中阳性率低，单独应用时诊断的灵敏度和准确度都不够，不能作为一种新的诊断方法，不具有单独的诊断肺癌的意义。但是，同时联合检测肺癌相关自身抗体标志物谱在人体中的表达水平，却可以达到提高肺癌诊断的敏感性和准确性的目的。英国诺丁汉大学的研发出了
综上所述，上述众多的肺癌诊断技术中，目前国外常用的肺癌筛检诊断技术为痰细胞学检查、x光片等技术，其检出率仍不高；而低剂量螺旋ct假阳性率过高，需要其他联合应用的诊断方法或手段。从血液中检测各种分子标志物的技术方法，具有简便、经济、快速、无创无痛易于接受的特点，但是目前尚缺乏敏感性和特异性均较高的标志物或标志物组合谱。肺癌涉及的多种基因及核酸分子的改变均难以在血清中检出。目前已有一些关于采用多种蛋白质抗原检测血清中相应抗体的含量，并以此判断被检人是否患有肺癌的报道，但尚未见到多蛋白样品的蛋白质芯片用于检测人血清中相应抗体含量的报道，最重要的是也需要进一步优化自身抗体标志物谱来提高检测诊断早期肺癌的敏感性或特异性，使其可以切实用于临床早期诊断肺癌或在肺癌高危人群中筛查肺癌。
技术实现要素：
针对上述现有技术中的不足，本发明提供一种可以非常方便、快捷、无创、高效地早期诊断或普查筛检肺癌疑似患者或肺癌高危人群的蛋白芯片、蛋白质芯片诊断试剂盒制备及使用方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种蛋白质芯片，包含但不仅仅包含以下6种肺癌自身抗原蛋白的蛋白标志物：(1)p53抗原片段，其特征氨基酸序列如id.1sequence所示；(2)sox2抗原片段，其特征氨基酸序列如id.2sequence所示；(3)copb1抗原片段，其特征氨基酸序列如id.3sequence所示；(4)efhd2抗原片段，其特征氨基酸序列如id.4sequence所示；(5)eif4g3抗原片段，其特征氨基酸序列如id.5sequence所示；(6)pcna抗原片段，其特征氨基酸序列如id.6sequence所示。
所述的自身抗原蛋白质的蛋白标志物为重组表达纯化的蛋白质。
一种蛋白质芯片诊断试剂盒，包括：检测玻片、检测校正玻片、样品稀释液、洗涤液、荧光二抗；
在大肠杆菌中表达包含有本发明所述的6种抗原特征氨基酸序列的重组蛋白或重组融合蛋白，纯化分离这些目标蛋白，使其纯度达到80％以上，在各抗原以及人igg、人igm中加入适量的生物素化的bsa，以适宜的浓度点样于经醛基化处理的玻璃基片上，抗原将共价交联于基片之上，采用牛血清封闭剩余的交联位点，干燥后低温干燥保存，得到检测玻片；
将人igg及人igm抗体标准品进行倍比稀释，选择适宜的浓度梯度点样于经醛基化处理的玻璃片基上，抗体标准品将共价交联于基片之上，采用牛血清封闭剩余的交联位点，干燥后低温干燥保存，得到检测校正玻片；
将含10％牛血清的pbs(0.01mol/lm，ph7.4)无菌过滤装瓶，得到样品稀释液；
将含0.02％tween20的pbs(0.01mol/lm，ph7.4)无菌过滤装瓶，得到洗涤液；
将含有适宜稀释度的链霉亲和素-cy5荧光标记二抗、链霉亲和素-cy3荧光标记二抗、羊抗人igg-cy5荧光标记二抗及羊抗人igm-cy3荧光标记二抗装瓶，得到荧光二抗。
一种蛋白质芯片诊断试剂盒的制备方法，包括：
检测玻片制备步骤；检测校正玻片制备步骤；样品稀释液制备步骤；洗涤液制备步骤；荧光二抗制备步骤；
所述检测玻片制备步骤如下；
在大肠杆菌中表达包含有本发明所述的6种抗原特征氨基酸序列的重组蛋白或重组融合蛋白，纯化分离这些目标蛋白，使其纯度达到80％以上，在各抗原以及人igg、人igm中加入适量的生物素化的bsa，以适宜的浓度点样于经醛基化处理的玻璃基片上，抗原将共价交联于基片之上，采用牛血清封闭剩余的交联位点，干燥后低温干燥保存；
样品稀释液制备步骤；
将人igg及人igm抗体标准品进行倍比稀释，选择适宜的浓度梯度点样于经醛基化处理的玻璃片基上，抗体标准品将共价交联于基片之上，采用牛血清封闭剩余的交联位点，干燥后低温干燥保存；
洗涤液制备步骤；
将含0.02％tween20的pbs(0.01mol/lm，ph7.4)无菌过滤装瓶；
样品稀释液制备步骤；
将含10％牛血清的pbs(0.01mol/lm，ph7.4)无菌过滤装瓶；
荧光二抗制备步骤；
将含有适宜稀释度的链霉亲和素-cy5荧光标记二抗、链霉亲和素-cy3荧光标记二抗、羊抗人igg-cy5荧光标记二抗及羊抗人igm-cy3荧光标记二抗装瓶。
一种蛋白质芯片诊断试剂盒的使用方法，在检测玻片的点样区加入荧光标记的链霉亲和素37℃下保湿孵育1小时，采用洗涤液洗涤3次；
将被检人血清取21，，以样品稀释液稀释至201，取101加在检测玻片上覆盖点样区，37℃下保湿孵育1小时；
取10ul的稀释液加在检测校正玻片上覆盖点样区；
采用洗涤液洗涤3次，加入与链霉亲和素标记荧光不同的抗人igg或人igm荧光二抗，37℃下保湿孵育1小时，采用洗涤液洗涤5次，干燥后在激光共聚焦芯片读片机上读取各点样点荧光的颜色和强度。
将癌胚抗原(cea)也点于检测玻片上。
本发明相对现有技术的有益效果：
本发明蛋白芯片、蛋白质芯片诊断试剂盒制备及使用方法，针对临床上被怀疑为肺癌的被检者，可抽取其血液样品，采用本发明所涉及的诊断人肺癌的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒，检测被检人血液中所述的6种抗原相应抗体的含量，进而判断被检者是否为肺癌患者。由于检测方法或试剂盒的各种对照的差异，判断被检者是否为肺癌的标准并不是唯一的，一旦被检者被采用本发明判断涉及的诊断方法或由该方法衍生的试剂盒判断为患有肺癌，则应高度怀疑被检者为实际肺癌患者，并采用各种检测手段进行各种临床确诊，如临床不能发现病灶，则应密切随访监测被检者肺癌发生发展的情况。
对于普通的健康人群或医学上定义的肺癌高危人群，则可以采用本发明所涉及的诊断人肺癌的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒对他们进行普查筛检，抽取被检人群的血液样本，按上述方法判定其是否患有肺癌，一旦被检者被采用本发明判断涉及的诊断方法或由该方法衍生的试剂盒判断为患有肺癌，则应采用各种检测手段进行各种临床确诊，如临床不能发现病灶，则应密切随访监测被检者肺癌发生发展的情况。
本发明提供的新的诊断人肺癌的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒，则可以非常方便、快捷、无创、高效地早期诊断或普查筛检肺癌疑似患者或肺癌高危人群，以及参加检测的正常健康人群。
具体实施方式
以下实施例对本发明进行详细的说明：
本发明的第一个目的在于提供一种新的可用于早期诊断人肺癌的蛋白质芯片，该蛋白质芯片包含但不是仅仅包含6种特定的蛋白质抗原，通过该蛋白质芯片可以检测被检人血液(血清、血浆或全血成分)中这6种特定的肺癌相关自身抗原的相应igg型和igm型自身抗体的含量，联合分析这6种抗原相应抗体检测的结果，可以用来判定被检人是否患有肺癌。
本发明的第二个目的在于提供一类由上述蛋白质芯片衍生的早期诊断肺癌的试剂盒。
本发明的第三个目的在于所述的早期诊断人肺癌的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒在肺癌早期诊断、健康人群或肺癌高危人群肺癌筛查中的应用。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种早期诊断人肺癌的蛋白质芯片，
1)包含但不仅仅包含以下6种肺癌自身抗原蛋白的蛋白标志物：(1)p53抗原片段，其特征氨基酸序列如id.1sequence所示；(2)sox2抗原片段，其特征氨基酸序列如id.2sequence所示；(3)copb1抗原片段，其特征氨基酸序列如id.3sequence所示；(4)efhd2抗原片段，其特征氨基酸序列如id.4sequence所示；(5)eif4g3抗原片段，其特征氨基酸序列如id.5sequence所示；(6)pcna抗原片段，其特征氨基酸序列如id.6sequence所示；
2)检测样品为被检人的血液样品，
3)检测如2)所述的样品中如1)所述的6种自身抗原蛋白的相应igg型和igm型自身抗体的相对含量，
4)通过联合分析6种自身抗原蛋白相应自身抗体的检测结果可以判断被检人是否为肺癌。
在本发明中，所述的自身抗原蛋白是指包含上述氨基酸残基序列的任何多肽、蛋白质或融合蛋白质。因为本发明是采用这些蛋白质抗原检测可以与之结合的抗体，因此在技术上是显而易见的，只要采用包含上述氨基酸残基序列的任何多肽、蛋白质或融合蛋白质，均可以具有几乎相同的免疫学特性，从而也可以用于检测可以与这些蛋白质抗原结合的抗体。
本发明所述的6种抗原是经采用混合人肺癌原发病灶组织(包括2例肺腺癌、2例肺鳞癌、2例小细胞肺癌)建立表达cdna文库，并通过30例自体和异体肺癌病人血清进行免疫印迹筛选、削减抑制杂交筛选、去ig背景筛选后获得的在肺癌病人血清中存在相应抗体的抗原，在筛选完3×106pfu的库之后，共获得了102个可与肺癌病人血清反应的蛋白质抗原克隆。
将上述抗原的基因克隆入带有正确读码框的原核表达载体pet30(b)，通过iptg诱导表达，提取包函体并初步纯化，获得了该肺癌抗原的重组蛋白。采用上述重组蛋白，以适量浓度点于免疫印迹膜上，采用肺癌和正常人血清各10例，并采用酶联免疫印迹法检测，挑选正常人的阳性率与肺癌病人的阳性率有较大差异的克隆。按此方法获得了24个与正常人血清反应的阳性率与肺癌病人有较大差异的抗原克隆。
将前述获得的抗原的重组蛋白采用生物芯片点样机点样于醛基化的玻璃基片上，每点的浓度约1mg/ml，点样量约8nl。采用免疫荧光的方法检测被检血清中针对这些抗原的人抗体。共采用上述方法检测了200例肺癌病人血清和200例正常人血清，结果显示，其中6种抗原在肺癌病人血清和正常人血清中的相应igg型和igm型自身抗体存在较大的差异，联合分析诊断肺癌的灵敏度可达89.0％，而特异度也可达85.5％。这6种抗原分别是：(1)p53抗原片段，(2)sox2抗原片段，(3)copb1抗原片段，(4)efhd2抗原片段，(5)eif4g3抗原片段，(6)pcna抗原片段。以上筛选该6种肺癌相关自身抗原的标志物谱的过程数据表明，采用上述6种蛋白质抗原检测上述6种抗原血液中相应的igg型和igm型自身抗体的含量，并且进行联合分析，判断被检人是否患有肺癌对于肺癌诊断具有较高的灵敏度和特异度，具有非常重要的应用价值。进一步，采用相同方法对200例肺部良性病变的病人的血清进行了检测，结果该自身抗体标志物组合(谱)对区分肺部良性病变具有较好的特异性，仅仅有18％的假阳性率，鉴别诊断的效果良好。
综上所述，本发明提供了一种新的新的可用于诊断人肺癌的蛋白质芯片，该蛋白质芯片可用于联合检测分析被检人血液中6种特定抗原相应igg型和igm型自身抗体的含量，从而判断被检人是否为肺癌患者。该蛋白质芯片采用被检人的血液样品为检测样品，可采用各种适宜的方法分别检测6种特定抗原的相应igg型和igm型自身抗体在样品中的相对含量，每种抗原相应抗体的相对含量都有一个相应的阈值，被检血样高于(或低于)此值的被判断为阳性，联合分析这6种抗原相应自身抗体阳性的总数，当被检人的12种自身抗体(igg型+igm型)阳性总数的值大于一个相应的阈值时，该被检人被判为阳性，即被诊断为肺癌患者。该蛋白质芯片经在200人的肺癌患者和200人的正常人中验证，其灵敏度为89.0％，准确度为85.5％。该蛋白质芯片的创新之处在于：1)检测的指标是6种抗原的相应igg型和igm型自身抗体在被检人血清中的含量，相对直接检测抗原本身来说，抗原的相应抗体在肺癌发生的早期就可以产生，此时抗原也许尚不能在血液中被检出，因而比直接检测抗原来说可诊断的肺癌可能更小；抗原的相应抗体更容易进入血液循环而被检测到，同时人体可以对微量抗原产生相当多的相应抗体，具有一定的放大作用；另外，非常重要的是，除了常规的igg型自身抗体之外，我们检测了这6种自身抗原产生的相应igm自身抗体的情况，这在以往没有相关的报道，我们的前期相关研究结果提示了，检测igm型自身抗体十分有助于发现早期的肿瘤患者，这使得本试剂盒在原理上就具有明显的创新性。2)该蛋白质芯片所采用的6种抗原中有4种(copb1抗原、efhd2抗原、eif4g3抗原、pcna抗原)目前尚未见到肺癌病人体内存在相应抗体的报道，也尚未见到其用于诊断、检测肺癌的报道，所以我们的自身抗原标志物标志物组合(谱)具有明显的创新性。3)结果判定是在联合分析12种自身抗体(igg型+igm型)相对含量的检测结果的基础上做出的，具有更好的灵敏度和准确度。本发明所采用的12种自身抗体单独检测肺癌的灵敏度和准确度都不是很高，但联合分析之后该方法诊断肺癌的灵敏度和准确度都大大提高，达到了一个临床可接受的水平。
根据本发明的第二个方面，提供一类由上述蛋白质芯片衍生的诊断肺癌的试剂盒，这类诊断肺癌的试剂盒可用于非侵入性地诊断人肺癌。这类诊断试剂盒采用了但不是仅仅采用本发明提供的新的蛋白质芯片，实际上，这些试剂盒可以在本领域共知的范围内，加上其它一些对照以便进行结果的标准化判断，或是在本发明提供的蛋白质芯片所包含的6种蛋白质抗原的基础上，再增加其它的检测指标来联合判断。另外，由本发明提供的肺癌诊断方法衍生的试剂盒也可以采用本领域共知的范围内的多种技术手段来检测各抗原相应抗体的含量，实现本发明的目的，例如免疫荧光、免疫印迹、放射免疫、酶联免疫吸附等，检测抗原相应抗体的手段的不同并不会影响对该被检人是否为肺癌患者的判断。
根据本发明提供的新的诊断人肺癌的蛋白质芯片，很容易获得由该蛋白质芯片衍生的各种诊断试剂盒。本发明提供的可用于肺癌诊断的蛋白质芯片的核心关键在于该芯片上所包含的6种蛋白质抗原的种类(蛋白质具体的氨基酸序列)，从而可以通过该蛋白质芯片检测这6种特定抗原相应igg型和igm型自身抗体在被检人血液中的含量，从本技术领域的普通专业知识很容易推出，采用何种技术手段检测抗原相应抗体的含量，以及采用何种抗原的存在形式(天然抗原、重组蛋白抗原、合成多肽)来检测均不会影响该方法对被检人是否患有肺癌的判断；并且，在任何肺癌诊断试剂盒中只要包含了检测本发明所述方法的6个抗原的相应抗体的检测指标，该试剂盒检测肺癌的灵敏度和特异度就应该至少达到本发明涉及的方法的灵敏度和准确度，额外地增加其它肺癌相关的检测指标一般均能在本发明涉及的方法的基础上进一步提高诊断灵敏度和准确度。下面举一些简单的制备本发明涉及的肺癌诊断方法衍生的试剂盒的例子，可以通过以下方法获得衍生试剂盒，但不只限于下列方法。
在大肠杆菌中表达包含有本发明所述的6种抗原特征氨基酸序列的重组蛋白或重组融合蛋白，纯化分离这些目标蛋白，使其纯度达到80％以上，在各抗原以及人igg、人igm(以上两种为对照，以便进行横向参比)中加入适量的生物素化的bsa，以适宜的浓度点样于经醛基化处理的玻璃基片上，抗原将共价交联于基片之上，采用牛血清封闭剩余的交联位点，干燥后低温干燥保存，这就是试剂盒中的检测玻片；将人igg及人igm抗体标准品进行倍比稀释，选择适宜的浓度梯度点样于经醛基化处理的玻璃片基上，抗体标准品将共价交联于基片之上，采用牛血清封闭剩余的交联位点，干燥后低温干燥保存，这就是试剂盒中的检测校正玻片；将含10％牛血清的pbs(0.01mol/lm，ph7.4)无菌过滤装瓶，这就是样品稀释液；将含0.02％tween20的pbs(0.01mol/lm，ph7.4)无菌过滤装瓶，这就是洗涤液；将含有适宜稀释度的链霉亲和素-cy5荧光标记二抗、链霉亲和素-cy3荧光标记二抗、羊抗人igg-cy5荧光标记二抗及羊抗人igm-cy3荧光标记二抗装瓶，这就是荧光二抗。以上五种成分即可组装成一种由本发明所述方法衍生的肺癌诊断试剂盒，
应用时，在检测玻片的点样区加入荧光标记的链霉亲和素37℃下保湿孵育1小时，采用洗涤液洗涤3次。将被检人血清取21，，以样品稀释液稀释至201，取101加在检测玻片上覆盖点样区，37℃下保湿孵育1小时；而取10ul的稀释液加在检测校正玻片上覆盖点样区。采用洗涤液洗涤3次，加入与链霉亲和素标记荧光不同的抗人igg或人igm荧光二抗(例如，链霉亲和素为cy-3标记，则加入羊抗人igg-cy5荧光标记二抗)，37℃下保湿孵育1小时，采用洗涤液洗涤5次，干燥后在激光共聚焦芯片读片机上读取各点样点荧光的颜色和强度。各抗原点样点的荧光强度代表了相应抗体的相对含量，生物素化的bsa与链霉亲和素反应的荧光强度可作为抗原抗体反应的内参照，人igg、igm的荧光强度可作为各被检人横向参比的对照，而由不同稀释度的人igg或igm抗体标准品的荧光强度绘制的标准曲线可作为抗体含量的量化标准和批间反应的对照。按预先确定好的各抗原的阈值分析各抗原荧光强度的数据，可判断被检人该抗原相应抗体是否为阳性，累加12种自身抗体(igg型+igm型)的阳性数，再根据预先确定的阳性数阈值即可判断该被检人是否为肺癌患者。在上述衍生试剂盒的基础上，可再增加检测指标，例如，将癌胚抗原(cea)额外作为1种抗原也点于玻片上，就可以衍生出另外一种试剂盒，并可能增加该试剂盒诊断肺癌的灵敏度和准确度。
根据本发明的第三方面，本发明还提供了所述的诊断人肺癌的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒在肺癌早期诊断、健康人群或肺癌高危人群肺癌筛查中的应用。
针对临床上被怀疑为肺癌的被检者，可抽取其血液样品，采用本发明所涉及的诊断人肺癌的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒，检测被检人血液中所述的6种抗原相应抗体的含量，进而判断被检者是否为肺癌患者。由于检测方法或试剂盒的各种对照的差异，判断被检者是否为肺癌的标准并不是唯一的，一旦被检者被采用本发明判断涉及的诊断方法或由该方法衍生的试剂盒判断为患有肺癌，则应高度怀疑被检者为实际肺癌患者，并采用各种检测手段进行各种临床确诊，如临床不能发现病灶，则应密切随访监测被检者肺癌发生发展的情况。
对于普通的健康人群或医学上定义的肺癌高危人群，则可以采用本发明所涉及的诊断人肺癌的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒对他们进行普查筛检，抽取被检人群的血液样本，按上述方法判定其是否患有肺癌，一旦被检者被采用本发明判断涉及的诊断方法或由该方法衍生的试剂盒判断为患有肺癌，则应采用各种检测手段进行各种临床确诊，如临床不能发现病灶，则应密切随访监测被检者肺癌发生发展的情况。
本发明的积极进步效果在于：利用本发明提供的新的诊断人肺癌的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒，则可以非常方便、快捷、无创、高效地早期诊断或普查筛检肺癌疑似患者或肺癌高危人群，以及参加检测的正常健康人群。
下面将结合多种实施例来说明如何实施本发明所述的新的早期诊断人肺癌的蛋白质芯片，如何由该蛋白质芯片衍生出相应的试剂盒，以及如何用上述新的诊断人肺癌的蛋白质芯片及其衍生的诊断试剂盒诊断普查筛检肺癌疑似患者、肺癌高危人群以及健康人群。
实施例1
制备新的早期诊断人肺癌的蛋白质芯片并检测被检血清样本。
本发明涉及的新的诊断人肺癌的蛋白质芯片可以通过多种具体的技术实施，下面就进行较详细的描述：
将本方法涉及的6种抗原吸附或共价交联于适宜的固相支持物上。这6种抗原可以是提纯的天然蛋白，或是重组表达的蛋白，或是重组表达的含有各抗原特征氨基酸序列的重组融合蛋白，或是直接合成的各抗原特征氨基酸序列的多肽。所指的固相支持物可以是玻片、免疫印迹膜、免疫吸附所用的各种微孔板等。可以采用静电作用的方式将抗原直接吸附于固相支持物上，也可以采用共价交联的方式交联于固相支持物上。
具体举例为，取适量生物素化的bsa加入到这6种纯化后的抗原重组蛋白中，然后加入终浓度为0.05％的tween-20，充分混匀后以1mg/ml的浓度点样于醛基化的玻璃基片表面，此时这6种抗原被以共价交联的方式交联于玻片表面，即已经制备成功可用于诊断人肺癌的蛋白质芯片。然后再采用牛血清封闭玻片表面的其它未交联的反应位点。
封闭后首先将cy3或者cy5标记的链霉亲和素与吸附或共价交联这6种抗原的固相支持物表面混合孵育。经通常免疫学技术采用的各种洗涤剂洗涤后，加入被检血样品与固相支持物表面混合孵育，使得被检血样品中的这6种抗原的相应抗体与固相支持物表面的抗原结合，从而间接地吸附于固相支持物表面。再经通常免疫学技术采用的各种洗涤剂洗去非特异吸附的杂蛋白，在固相支持物表面留下相应的人抗体和荧光标记的链霉亲和素。具体举例，将1：100稀释的cy5标记的链霉亲和素或者1：600稀释的cy3标记的链霉亲和素与已封闭的玻片37度保湿孵育1小时后，采用0.01mol/l的ph7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗玻片3次。然后将1:40稀释的被检血清与上述已封闭后的玻片室温保湿孵育1小时，弃被检血清，采用0.01mol/l的ph7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗玻片3次。
可以采用多种常用免疫学方法探测上述存留于固相支持物表面的相应人抗体，例如免疫荧光法、免疫酶法、化学发光法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法等。具体举例，可采用免疫荧光法。在与cy3-链霉亲和素反应后的玻片内加入羊抗人igg-cy5二抗，而在与cy5-链霉亲和素反应后的玻片内加入羊抗人igm-cy3二抗，保湿孵育1小时。弃荧光二抗液，采用0.01mol/l的ph7.4的pbs冲洗玻片3次，去离子水冲洗玻片1次。空气干燥，于激光共聚焦芯片扫描仪下读取635nm和530nm的各点荧光强度和面积。其中635nm下该点的总荧光量(或平均荧光强度)代表被检血清中该点抗原相应的igg抗体的相对含量，530nm下该点的总荧光量(或平均荧光强度)代表被检血清中该点抗原相应的igm抗体的相对含量。然后进行数据的处理：首先，将检测所得抗原点的荧光强度与点内生物素及链霉亲和素反应的荧光强度相除。其次，如果检测的抗体类型为igg，在此步骤将经过第一步处理后的数据与经同样处理的igg标准品的数值相除；如果检测的抗体类型为igm，在此步骤将经过第一步处理后的数据与经同样处理的孔内igm标准品的数值相除。第三,将igg或者igm标准片的数据同样按照以上两个步骤进行处理。然后根据igg或者igm抗体的稀释度，绘制标准曲线。通过不同批次标准曲线的不同，对不同批次的实验数据进行校正。然后将第二步的数据代入标准曲线的公式计算抗原在血清中的相应抗体含量。参照设立的对照并与相应的判断标准进行比较，可以判断该被检人的该抗原的相应抗体是否为阳性。
确定单个抗原是否为阳性后，联合分析6个抗原12种自身抗体(igg型+igm型)的结果，计算总的抗原阳性的个数，再与相应的判断标准进行比较，凡大于规定标准值者即可判断为肺癌患者。
实施例2
6种相应抗原的制备。
本发明所述的(1)p53抗原片段，(2)sox2抗原片段，(3)copb1抗原片段，(4)efhd2抗原片段，(5)eif4g3抗原片段，(6)pcna抗原片段的dna片段已预先采用ecori和xhoi酶克隆在pbluescriptsk(+/-)原核克隆载体中。ecori和xhoi双酶切重组表达载体pet30b(+)，回收约5.4kb的双酶切片段备用。ecori和xhoi双酶切含各抗原片段基因的pbluescriptsk(+/-)载体，回收约各抗原相应的双酶切片段，分别克隆入回收的pet30b(+)表达载体中。再分别采用ecori和xhoi双酶切筛选重组克隆。采用碱裂解法大量提取质粒，以0.1μg的dna转化bl21大肠杆菌。挑取转化克隆，在lb培养基中培养至od600约0.6，加入终浓度为2mm的iptg诱导表达，4小时以后离心收获菌体。超声波震荡破碎菌体，离心收集沉淀，沉淀为含有目的抗原蛋白的包函体。8m尿素溶解沉淀，4度放置12小时以上，离心去除不溶物，与ni亲和层析柱混合结合1小时。结合后装柱，采用ph6.5的8m尿素洗涤层析柱20倍柱体积，然后采用ph5.9的8m尿素洗脱层析柱10倍柱体积，分部收集，最后采用ph4.5的8m尿素洗脱层析柱10倍柱体积，分部收集。洗脱各组分分别上样进行sds-page分析，选择目的蛋白所在的组分进行复性。将目的蛋白所在的组分合并后调整蛋白浓度至0.25mg/ml，对含2m尿素的缓冲液透析，4度透析12小时，再对含0.2m尿素的缓冲液透析，4度透析12小时，再对含0.02m尿素的缓冲液透析，4度透析12小时，再对不含尿素的缓冲液透析，4度透析12小时。采用peg20000吸水浓缩的方法浓缩各抗原至最终浓度为1mg/ml。离心去沉淀，测定蛋白含量，获得各抗原的重组蛋白。
实施例3：
早期诊断肺癌的蛋白质芯片的衍生试剂盒的制备(蛋白芯片诊断试剂盒)
试剂盒的组成：
预点抗原的蛋白芯片；
样品稀释液；
洗涤液浓缩液；
荧光标记二抗的浓缩液；
试剂盒各组成成份的制备：
1、预点抗原的蛋白芯片的制备：购买商品化的bsa包被并经醛基化处理后的载体玻片，例如美国celassociates公司的css-100型玻片。采用实施例2制备的6种抗原的纯化重组蛋白，以及人igg(0.2mg/ml)、人igm(0.2mg/ml)标准品作为样品，加入适量的生物素化的bsa和tween-20，采用生物芯片点样机将上述14种样品点于载体玻片上形成微阵列，每玻片点10个平行的微阵列，每个微阵列之间采用贴上适宜大小的塑料膜分割开来，每个样品每点点样约8nl、2个平行点。点样结束后保湿放置4小时促进样品交联于玻片之上，然后在玻片表面加上一层含20％胎牛血清的pbs，室温保湿放置1小时后4℃放置过夜，以充分封闭玻片上的非特异蛋白交联或结合位点。弃去液体，空气干燥，将玻片放置于铝箔塑料袋中充氮干燥密封，置于4℃下保存。以上过程制备成功预点抗原的蛋白芯片。
2、igg/igm抗体标准片的制备：采用0.01mol/l的ph7.4的pbs对igg和igm抗体的标准品进行稀释，分别配制6个稀释度的抗体溶液，包括0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml和160ug/ml。在每份抗体样品中加入适量的生物素化的bsa，然后加入终浓度为0.05％的tween-20，充分混匀。采用生物芯片点样机将上述抗体标准品样品点于载体玻片上形成微阵列，每玻片点10个平行的微阵列，每个微阵列之间采用贴上适宜大小的塑料膜分割开来，每个样品每点点样约4nl、2个平行点。点样结束后保湿放置4小时促进样品交联于玻片之上，然后在玻片表面加上一层含20％胎牛血清的pbs，室温保湿放置1小时后4℃放置过夜，以充分封闭玻片上的非特异蛋白交联或结合位点。弃去液体，空气干燥，将玻片放置于铝箔塑料袋中充氮干燥密封，置于4℃下保存。以上过程制备成功预点抗体标准品的蛋白芯片。
3、样品稀释液：配制含10％胎牛血清的pbs(0.01mol/l，ph7.4)，加入终浓度为0.02％的tween20，无菌过滤分装，每瓶2ml。
4、洗涤液浓缩液：配制10倍浓缩的pbs(0.01mol/l，ph7.4)，无菌过滤分装，每瓶20ml，使用前采用去离子水稀释至200ml。
5、荧光标记抗人抗体二抗的浓缩液：使用市售的抗人igg-cy5荧光标记二抗和抗人igm-cy3荧光标记二抗在分别滴定适宜的稀释度后，分装于棕色小瓶。
6、荧光标记链霉亲和素的浓缩液：使用市售的链霉亲和素-cy5荧光标记二抗和链霉亲和素-cy3荧光标记二抗在分别滴定适宜的稀释度后，分装于棕色小瓶。
7、试剂盒说明书：说明书应包含以下内容，试剂盒的组成、存放条件、使用操作步骤、结果分析判断方法、注意事项等。
试剂盒的操作方法与结果判断：
操作方法：
1、将密封的预点芯片从4℃下取出，室温预温15分钟以上。
2、将180ml去离子水加入20ml洗涤液浓缩液，配制好洗涤液。
3、打开预点抗原和抗体标准品芯片密封袋，取出芯片平放。采用样品稀释液按标签上标定的稀释度稀释荧光标记链霉亲和素的浓缩液，将稀释好的工作液各取201，加入各个微阵列样品池，均匀覆盖样品池的所有表面，但不要溢出样品池。
4、37℃下保湿孵育1小时。
5、快速甩去芯片上的液体，以20ml以上的洗涤液均匀流过玻片表面洗涤玻片，共洗涤玻片3次。
6、采用样品稀释液按照预定的比例稀释血清样品，推荐采用1:40稀释。
7、将稀释好的样品各取201，加入预点抗原芯片的微阵列样品池，均匀覆盖样品池的所有表面，但不要溢出样品池。在预点抗体标准品的芯片微阵列样品池内加入稀释液。
8、37℃下保湿孵育1小时。
9、快速甩去芯片上的液体，以20ml以上的洗涤液均匀流过玻片表面洗涤玻片，共洗涤玻片3次。
10、采用样品稀释液按标签上标定的稀释度稀释荧光二抗工作液，将稀释好的荧光二抗工作液各取201，加入各个微阵列样品池，均匀覆盖样品池的所有表面，但不要溢出样品池。
11、37℃下保湿孵育1小时。
12、快速甩去芯片上的液体，以20ml以上的洗涤液均匀流过玻片表面洗涤玻片，共洗涤玻片3次。
13、以20ml以上的去离子水均匀流过玻片表面洗涤玻片，共洗涤玻片1次。
14、空气干燥，于适宜的仪器上读取各点在635nm、530nm的荧光强度。
结果判断：
1、对于单个微阵列的单个点样点来说，按以下方法判断其是否阳性：分别计算该点的635nm荧光强度与该点的532nm荧光强度的比值和人igg点635nm荧光强度与该点的532nm荧光强度的比值，取二者的比值，然后根据人igg标准品预点片的抗体标准曲线的公式计算该抗原相应的抗体含量。采用该数值与预定的标准比，判断该点抗原igg抗体是否阳性，阳性则计数为1，阴性计数为0；分别计算该点的532nm荧光强度与该点的635nm荧光强度的比值和人igm点635nm荧光强度与该点的532nm荧光强度的比值，取二者的比值，然后根据人igm标准品预点片的抗体标准曲线的公式计算该抗原相应的抗体含量。采用该数值与预定的标准比，判断该点抗原igm抗体是否阳性，阳性则计数为1，阴性计数为0。
2、对于某个微阵列对应的被检人来说，其阳性抗原数按以下方法计算：按1.所述方法判断单点阳性数后，阵列中12种自身抗体单点阳性数的总和即为被检人的阳性抗原数。
3、将被检人阳性抗原数与预定标准对比，当被检人阳性抗原数大于或等于预定标准值时，即被判断为肺癌阳性。
实施例4：
采用新的早期诊断肺癌的蛋白质芯片及衍生试剂盒诊断普查筛检肺癌疑似患者、肺癌高危人群以及健康人群
采用实施例3所述的试剂盒(采用蛋白芯片加免疫荧光法)检测肺癌患者200例、正常人对照200例、肺部良性病变200例、肺癌高危人群2000例、普通社区人群1000例。采用正常人对照200例划定肺癌诊断标准进行结果判断。结果如下表所示：
肺癌患者200例、正常人对照200例中，试剂盒检测出肺癌患者阳性的164例、正常人阳性的24例，因此该试剂盒诊断肺癌的敏感性为82.00％，特异性为88.00％，说明该试剂盒诊断肺癌的敏感性特异性均较高。
肺癌患者200例中，i期肺癌患者有50例，其中41例试剂盒检测结果为阳性，早期肺癌(i期)的敏感性为82％，并未发生显著下降，说明该试剂盒早期诊断肺癌的敏感性特异性均较高。
肺部良性病变200例患者中被误判为肺癌的35例，说明该方法不仅可以诊断肺癌，而且对于肺部良性病变具有较高的鉴别诊断率，鉴别诊断的特异性为82.50％。
肺癌高危人群2000例中282例被判断为肺癌，高危人群检测阳性率大约为14.1％。2000例高危人群经随访，其中46人在此后被临床确诊为肺癌，而这46人中28人试剂盒检测阳性，说明该试剂盒可以以较高的灵敏度将肺癌患者从被检人群中筛检出来，敏感性约60.87％，从而可以用于肺癌高危人群的筛查。
被检测的普通社区人群(健康人群)1000例中103例被判断为肺癌。1000例普通社区人群经随访，其中2人在此后被临床确诊为肺癌，而这2人中全部为试剂盒检测阳性，说明该试剂盒可以以较高的灵敏度将肺癌患者从健康人群中筛检出来，从而可以用于普通社区人群的筛查。
(1)p53抗原片段，其特征氨基酸序列如id.1sequence所示：
nh3-meepqsdpsvepplsqetfsdlwkllpennvlsplpsqamddlmlspddieqwftedpgpdeaprmpeaaprvapapaaptpaapapapswplsssvpsqktyqgsygfrlgflhsgtaksvtctyspalnkmfcqlaktcpvqlwvdstpppgtrvramaiykqsqhmtevvrrcphhercsdsdglappqhlirvegnlrveylddrntfrhsvvvpyeppevgsdcttihynymcnsscmggmnrrpiltiitledssgnllgrnsfevrvcacpgrdrrteeenlrkkgephhelppgstkralpnntssspqpkkkpldgeyftlqirgrerfemfrelnealelkdaqagkepggsrahsshlkskkgqstsrhkklmfktegpdsd-cooh
(2)sox2抗原片段，其特征氨基酸序列如id.2sequence所示：
nh3-mynmmetelkppgpqqtsgggggnstaaaaggnqknspdrvkrpmnafmvwsrgqrrkmaqenpkmhnseiskrlgaewkllsetekrpfideakrlralhmkehpdykyrprrktktlmkkdkytlpggllapggnsmasgvgvgaglgagvnqrmdsyahmngwsngsysmmqdqlgypqhpglnahgaaqmqpmhrydvsalqynsmtssqtymngsptysmsysqqgtpgmalgsmgsvvkseasssppvvtssshsrapcqagdlrdmismylpgaevpepaapsrlhmsqhyqsgpvpgtaingtlplshm-cooh
(3)copb1抗原片段，其特征氨基酸序列如id.3sequence所示：
nh3-mplrldikrkltarsdrvksvdlhptepwmlaslyngsvcvwnhetqtlvktfevcdlpvraakfvarknwvvtgaddmqirvfnyntlervhmfeahsdyirciavhptqpfiltssddmliklwdwdkkwscsqvfeghthyvmqivinpkdnnqfasasldrtikvwqlgssspnftleghekgvncidyysggdkpylisgaddrlvkiwdyqnktcvqtleghaqnvscasfhpelpiiitgsedgtvriwhsstyrlestlnygmervwcvaslrgsnnvalgydegsiivklgreepamsmdangkiiwakhsevqqanlkamgdaeikdgerlplavkdmgsceiypqtiqhnpngrfvvvcgdgeyiiytamalrnksfgsaqefawahdsseyairesnsivkifknfkekksfkpdfgaesiyggfllgvrsvnglafydwdntelirrieiqpkhifwsdsgelvciateesffilkylsekvlaaqethegvtedgiedafevlgeiqeivktglwvgdcfiytssvnrlnyyvggeivtiahldrtmyllgyipkdnrlylgdkelniisysllvsvleyqtavmrrdfsmadkvlptipkeqrtrvahflekqgfkqqaltvstdpehrfelalqlgelkiayqlaveaeseqkwkqlaelaiskcqfglaqeclhhaqdyggllllatasgnanmvnklaegaerdgknnvafmsyflqgkvdaclellirtgrlpeaaflartylpsqvsrvvklwrenlskvnqkaaesladpteyenlfpglkeafvveewvkethadlwpakqyplvtpneernvmeegkdfqpsrstaqqeldgkpasptpvivashtankeeksllelevdldnleledidttdinldedildd-cooh
(4)efhd2抗原片段，其特征氨基酸序列如id.4sequence所示：
nh3-matdelatklsrrlqmegegggetpeqpglngaaaaaagapdeaaealgsadcelsakllrradlnqgigepqspsrrvfnpytefkefsrkqikdmekmfkqydagrdgfidlmelklmmeklgapqthlglknmikevdedfdsklsfrefllifrkaaagelqedsglcvlarlseidvssegvkgaksffeakvqainvssrfeeeikaeqeerkkqaeemkqrkaafkelqstfk-cooh
(5)eif4g3抗原片段，其特征氨基酸序列如id.5sequence所示：
nh3-mnsqpqtrspggfrpiqffqrpqiqppratipnsspsirpgaqtptavyqanqhimmvnhlpmpypvpqgpqycipqyrhsgppyvgppqqypvqppgpgpfypgpgpgdfpnaygtpfypsqpvyqsapiivptqqqpppakrekktirirdpnqggkditeeimsgggsrnptppigrptstptppqlpsqvpehspvvygtvesahlaastpvtaasdqkqeekpkpdpvlkspspvlrlvlsgekkeqegqtsettaivsiaelplppspttvssvarstiaaptssalssqpifttaiddrcelsspredtipipsltsctetsdplptnendddickkpcsvapndiplvsstnlineingvseklsatesiveivkqevlpltleleilenppeemklecipapitpstvpsfpptpptppaspphtpvivpaaattvsspsaaitvqrvleedesirtclsedakeiqnkieveadgqteeildsqnlnsrrspvpaqiaitvpktwkkpkdrtrtteemleaelelkaeeelsidkvleseqdkmsqgfhperdpsdlkkvkaveengeeaepvrngaesvsegegidansgstdssgdgvtfpfkpeswkptdtegkkqydreflldfqfmpaciqkpeglppisdvvldkinqpklpmrtldprilprgpdftpafadfgrqtpggrgvpllnvgsrrsqpgqrreprkiitvsvkedvhlkkaenawkpsqkrdsqaddpeniktqelfrkvrsilnkltpqmfnqlmkqvsgltvdteerlkgvidlvfekaidepsfsvayanmcrclvtlkvpmadkpgntvnfrklllnrcqkefekdkadddvfekkqkeleaasapeertrlhdeleeakdkarrrsignikfigelfklkmlteaimhdcvvkllknhdeesleclcrllttigkdldfekakprmdqyfnqmekivkerktssrirfmlqdvidlrlcnwvsrradqgpktieqihkeakieeqeeqrkvqqlmtkekrrpgvqrvdeggwntvqgaknsrvldpskflkitkptidekiqlvpkaqlgswgkgssggakasetdalrssasslnrfsalqppapsgstpstpvefdsrrtltsrgsmgrekndkplpsatarpntfmrggsskdlldnqsqeeqrremletvkqltggvdvernsteaernktresakpeisamsahdkaalseeelerksksiideflhindfkeamqcveelnaqgllhvfvrvgvestlersqitrdhmgqllyqlvqseklskqdffkgfsetleladdmaidiphiwlylaelvtpmlkeggismreltiefskpllpvgragvllseilhllckqmshkkvgalwreadlswkdflpegedvhnflleqkldfiesdspcssealskkelsaeelykrlekliiedkandeqifdwveanldeiqmssptflralmtavckaaiiadsstfrvdtavikqrvpillkyldsdtekelqalyalqasivkldqpanllrmffdclydeevisedafykwesskdpaeqngkgvalksvtafftwlreaeeesedn-cooh
(6)pcna抗原片段，其特征氨基酸序列如id.6sequence所示：
nh3-mfearlvqgsilkkvlealkdlineacwdisssgvnlqsmdsshvslvqltlrsegfdtyrcdrnlamgvnltsmskilkcagnediitlraednadtlalvfeapnqekvsdyemklmdldveqlgipeqeyscvvkmpsgefacicrdlshigdavviscakdgvkfsasgelgngni-cooh。
序列表
<110>广州市丹蓝生物科技有限公司
<120>蛋白芯片、蛋白质芯片诊断试剂盒制备及使用方法
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