用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒的制作方法

本发明属于体外诊断技术领域，涉及一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒。

背景技术：

神经元特异性烯醇化酶(nse)是烯醇化酶中的一种，在糖酵解过程中参与催化2-磷酸甘油酸转变成磷酸烯醇式丙酮酸，分子量为78kd，等电点为ph4.7，是一种酸性蛋白酶。烯醇化酶同工酶是由α、β、γ三种亚基以二聚体的形式组合而成，存在αα、αβ、ββ、αγ、γγ五种形式，其中α亚基主要存在于肝、肾等组织，二聚体αα被称为非神经元特异性烯醇化酶，β亚基为骨骼肌和心肌所特有，γ亚基为神经组织和神经内分泌组织所特有，二聚体γγ在神经元中表达，二聚体αγ在小胶质细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞中表达，因此二聚体αγ、γγ被称为nse。nse同时发挥炎症作用和神经营养活性作用，在神经元的生长、分化、存活和死亡过程中起着重要的调节作用。因大脑灰质含有大量的神经元，所以nse在脑组织中的含量最高，占脑神经组织全部可溶性蛋白的1.5％-3％，占人脑皮质烯醇化酶的40％-60％，正常情况下，血清及脑脊液中含有微量的nse，nse异常增高与脑损伤、其它神经系统疾病以及肿瘤疾病相关，如脑出血、脑缺血、脑外伤、阿尔茨海默病、神经母细胞瘤、神经内分泌疾病(嗜铬细胞瘤、胰岛细胞瘤、甲状腺髓样癌、黑色素瘤等)和小细胞肺癌等。临床上，nse主要应用于小细胞肺癌(sclc)的诊断，它是sclc最敏感、最特异的肿瘤标志物，nse在sclc患者血清中的水平明显高于非小细胞肺癌的患者(肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌等)，也可用于鉴别诊断。此外nse也用于神经母瘤的诊断，它与s-100蛋白联合检测也被用于黑色素瘤的诊断。nse在上述疾病的早期诊断和预后观察领域具有重要的临床价值。

目前，市场上检验nse的试剂盒主要分为酶联免疫法、化学发光免疫法和时间分辨荧光法等。传统的酶联免疫法自动化程度不高，受人为因素影响较大，不利于高通量的全自动化检测，特异性和灵敏度有待提高，未来会被自动化程度高的化学发光方法取代。目前进口主流nse试剂是罗氏的产品，为电化学发光，其检测样本类型单一，只适用于血清样本的检测，血浆和血清样本测值存在较大的差异，所以提供一种血清和血浆样本通用的试剂即可以满足临床多种样本类型的需求，也可以减少病人的二次采样痛苦，另一方面也可以节约时间和经济成本。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有的检验nse的试剂盒线性区间窄，且对血清和血浆样本的测值存在显著差异的问题，提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒。

本发明提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒a，该试剂盒a包括：

校准品、磁颗粒反应液ra1、示踪结合物反应液ra2和捕获抗体反应液ra3；

所述的磁颗粒反应液ra1包含链酶亲和素磁珠、缓冲液和防腐剂；

所述的示踪结合物反应液ra2包含吖啶酯标记的nse抗体、nacl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；

所述的捕获抗体反应液ra3包含生物素标记的nse抗体、nacl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。

本发明还提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒b，该试剂盒b包括：

校准品、磁颗粒反应液rb1、示踪结合物反应液rb2和项目稀释反应液rb3；

所述的磁颗粒反应液rb1包含nse抗体包被的磁珠、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂，所述的磁珠为羧基磁珠或对甲苯磺酰磁珠；

所述的示踪结合物反应液rb2包含吖啶酯标记的nse抗体、nacl、mgcl2、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；

所述的项目稀释反应液rb3包含缓冲液nacl、mgcl2、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。

本发明还提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒c，该试剂盒c包括：

校准品、磁颗粒反应液rc1和示踪结合物反应液rc2；

所述的磁颗粒反应液rc1包含nse抗体包被的磁珠、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂，所述的磁珠为羧基磁珠或对甲苯磺酰磁珠；

所述的示踪结合物反应液rc2包含吖啶酯标记的nse抗体、nacl、mgcl2、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂。

优选的是，所述的试剂盒a、试剂盒b、试剂盒c中，所述的校准品浓度为0，2，10，25，100，250，500ng/ml，校准品基质配方为ph7.4的磷酸缓冲液(pb)，0.15mol/l氯化钠(nacl)，质量浓度为5％的牛血清白蛋白(bsa)。

优选的是，所述的试剂盒a、试剂盒b、试剂盒c中，所述的防腐剂为nan3、proclin300或proclin950，所述的防腐剂的质量浓度为0.01％-1％。

优选的是，所述的试剂盒a、试剂盒b、试剂盒c中，所述的蛋白稳定剂为bsa、酪蛋白或bgg中的一种或几种，所述的蛋白稳定剂的质量浓度为0.1％-10％。

优选的是，所述的试剂盒a、试剂盒b、试剂盒c中，所述的表面活性剂为吐温、聚乙二醇或者曲拉通，所述的表面活性剂的质量浓度为0.01％-1％。

优选的是，所述的试剂盒a、试剂盒b、试剂盒c中，吖啶酯标记的nse抗体的制备方法，包括：

在避光条件下，取nse抗体和吖啶酯溶液按照摩尔浓度1:(1-20)的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb，标记时间1-12小时。

优选的是，所述的试剂盒a中，生物素标记的nse抗体的制备方法，包括：

在避光条件下，取nse抗体和生物素溶液按照摩尔浓度1:(1-50)的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb，标记时间2-24h。

优选的是，所述的试剂盒b、试剂盒c中，nse抗体包被的磁珠的制备方法，包括：

当磁珠为羧基磁珠时，取羧基磁珠用缓冲液清洗，然后重悬至缓冲液中，加入nse抗体和碳二亚胺盐酸盐混匀，nse抗体用量为磁珠质量的0.1％-10％，在室温下活化悬混反应2-18小时，得到nse抗体包被的磁珠；

当磁珠为对甲苯磺酰磁珠时，取对甲苯磺酰磁珠用缓冲液清洗，然后重悬至缓冲液中，同时加入nse抗体和硫酸铵混匀，nse抗体用量为磁珠质量的0.1％-10％，硫酸铵反应浓度为1.2mol/l，在37℃条件下活化悬混反应10-36小时，得到nse抗体包被的磁珠。

本发明的原理

因为nse分子γ亚基的三维结构包括大约300个氨基酸组成8个α/β桶状结构，其中β折叠位于桶状结构的核心部位，为nse的活性位点所在，周围环绕a螺旋。酶活性中心主要由以下三种碱性氨基酸组成：组氨酸-189、精氨酸-371和赖氨酸-393。nse所有抗原决定簇都分布在48～96、188～293、399～433氨基酸序列区，位于其三维结构表面，在免疫反应中可刺激机体产生nse的单克隆抗体。人类的nse二聚体是不对称的复合物，其中一个亚基含有硫酸根离子和两个镁离子是闭合的构象，可观察到该亚基结合有酶底物或其类似物。而另一个亚基没有结合任何底物或类似物呈开放的构象。edta血浆样本因样本管中添加了edta，edta与镁离子的结合能力强，从而会破坏nse分子与mg²⁺离子的结合，进而影响nse分子构象，直接或间接的影响抗原结合位点，影响免疫反应。所以本发明在配方中添加过量的mg²⁺离子，与edta过饱和结合，从而不影响nse抗原分子的构像，保证了血清与血浆样本测值的一致性。

本发明的有益效果

本发明提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒，本发明的试剂盒检测线性范围宽、灵敏度高、特异性好，试剂盒的测试原理采用双抗体夹心法，nse浓度与相对发光强度(rlu)成正相关，根据nse浓度标准曲线即可得到被测样本中nse的含量。同时该试剂盒为全自动化学发光仪器配套试剂，适用于血清和血浆中nse的定量测定，本发明通过添加适量的mg²⁺离子，实现血清和edta血浆样本的一致性测定，血清与血浆测值相关系数r>0.975。

附图说明

图1为本发明实施例1试剂盒的定标曲线；

图2为对比例1不含mg²⁺试剂盒的定标曲线；

图3为本发明实施例1的线性曲线。

具体实施方式

本发明提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒a，该试剂盒a包括：

校准品，所述的校准品优选浓度为0，2，10，25，100，250，500ng/ml，校准品基质配方为ph7.4的磷酸缓冲液(pb)，0.15mol/l氯化钠(nacl)，质量浓度为5％的牛血清白蛋白(bsa)；

磁颗粒反应液ra1，所述的磁颗粒反应液ra1包含链酶亲和素磁珠、缓冲液和防腐剂；所述的磁颗粒反应液ra1中，链酶亲和素磁珠的质量浓度优选为0.03％-0.1％；所述的链酶亲和素磁珠的粒径优选为1-3μm；

示踪结合物反应液ra2，所述的示踪结合物反应液ra2包含吖啶酯标记的nse抗体、nacl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的示踪结合物反应液ra2中，吖啶酯标记的nse抗体的浓度优选为0.1-3ug/ml，nacl的浓度优选为0.15mol/l，氯化镁(mgcl2)的浓度优选为0-50mmol/l；

捕获抗体反应液ra3，所述的捕获抗体反应液ra3包含生物素标记的nse抗体、nacl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂，所述的捕获抗体反应液ra3中，生物素标记的nse抗体的浓度优选为0.5-8ug/ml，nacl的浓度优选为0.15mol/l，氯化镁的浓度优选为0-50mmol/l；

按照本发明，所述的ra1、ra2和ra3反应液中的缓冲液缓冲范围优选ph6.0-8.0，更优选ph6.0-7.4，作为缓冲盐可以使用2-(n-吗啡啉)乙磺酸(mes)、哌嗪-nn-双(2-乙磺酸)(pipes)、3-(n-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠(mopso)、tris-盐酸。缓冲盐的浓度优选为10-600mmol/l，更优选为25-400mmol/l。

按照本发明，所述的ra1、ra2和ra3反应液中的防腐剂优选为叠氮钠(nan3)、proclin300或者proclin950，防腐剂的质量浓度优选为0.01％-1％。

按照本发明，所述的ra2反应液中的阻断剂可以使用鼠igg、或者罗氏、scantibody商品化的阻断剂，阻断剂使用浓度范围优选为10-500ug/ml，更优选为50-200ug/ml。

按照本发明，所述的ra2和ra3反应液中的蛋白稳定剂优选为bsa、酪蛋白或者bgg中的一种或几种，所述的蛋白稳定剂的质量浓度为0.1％-10％。

按照本发明，所述的ra2和ra3反应液中的表面活性剂优选为吐温、聚乙二醇或者曲拉通，所述的表面活性剂的质量浓度优选为0.01％-1％。

按照本发明，所述的试剂盒a的制备方法，包括：

步骤一：ra1反应液的制备

将缓冲液和防腐剂混合，配制成ra1基础缓冲液；

取商品化的链酶亲和素磁珠(选自jsr公司，型号为ms300/streptavidin)，磁珠粒径3μm，用ph7.2的pbs(20mmol/lpb与150mmol/lnacl)缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至ra1基础缓冲液中，配成质量浓度0.03％-0.1％的ra1反应液；

步骤二：ra2反应液的制备

将nacl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成ra2基础缓冲液；

取nse抗体，与溶解于溶剂中的吖啶酯溶液按照摩尔浓度1:(1-20)的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb，标记时间1-12小时，反应过程需要避光，标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，得到吖啶酯标记的nse抗体；所述的溶剂优选为dmf，吖啶酯溶液的浓度优选为3mg/ml，标记缓冲液的浓度优选为20mmol/l；

取吖啶酯标记的nse抗体置于ra2基础缓冲液中，配成浓度为0.05-3ug/ml的ra2反应液；

步骤三：ra3反应液的制备

将nacl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成ra3基础缓冲液；

取nse抗体，与溶解于溶剂中的生物素溶液按照摩尔浓度1:(1-50)的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb，标记时间2-24h，反应过程需要避光，标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，得到生物素标记的nse抗体；所述的溶剂优选为dmf，吖啶酯溶液的浓度优选为3mg/ml，标记缓冲液的浓度优选为20mmol/l；

取生物素标记的nse抗体置于ra3基础缓冲液中，配成浓度0.5-8ug/ml的ra3反应液。

步骤四：校准品

将高浓度抗原定量添加至含有5％bsa的pbs缓冲液中，配成理论浓度为0，2，10，25，100，250，500ng/ml的校准品，然后使用公司一级校准品赋值，赋值后的浓度即为校准品使用浓度。

按照本发明，所述的试剂盒a的测定方法，包括：

将样本、ra2、ra3反应液顺序加入反应杯中，孵育5-20分钟，在该过程中，抗体与抗原形成夹心复合物；然后在反应杯中继续加入ra1反应液，孵育5-20分钟；加入清洗液，清洗；最后将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数，样本中nse的含量与光量子数成正比。

本发明还提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒b，该试剂盒b包括：

校准品，所述的校准品优选浓度为0，2，10，25，100，250，500ng/ml，校准品基质配方为ph7.4的磷酸缓冲液(pb)，0.15mol/l氯化钠(nacl)，质量浓度为5％的牛血清白蛋白(bsa)；

磁颗粒反应液rb1，所述的磁颗粒反应液rb1包含nse抗体包被的磁珠、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂，所述的磁颗粒反应液rb1中，nse抗体包被的磁珠的质量浓度优选为0.03-0.1％；所述的磁珠为羧基磁珠或对甲苯磺酰磁珠；粒径优选为3μm；

示踪结合物反应液rb2，所述的示踪结合物反应液rb2包含吖啶酯标记的nse抗体、nacl、mgcl2、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的示踪结合物反应液rb2中，吖啶酯标记的nse抗体的浓度优选为0.1-3ug/ml，nacl的浓度优选为0.15mol/l，氯化镁(mgcl2)的浓度优选为0-50mmol/l；

项目稀释反应液rb3，所述的项目稀释反应液rb3包含缓冲液nacl、mgcl2、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的项目稀释反应液rb3中，nacl的浓度优选为0.15mol/l，氯化镁(mgcl2)的浓度优选为0-50mmol/l；

按照本发明，所述的rb1、rb2和rb3反应液中的缓冲液缓冲范围优选ph5.5-9.0，更优选ph6.0-7.4，作为缓冲盐可以使用2-(n-吗啡啉)乙磺酸(mes)、哌嗪-nn-双(2-乙磺酸)(pipes)、3-(n-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠(mopso)、tris-盐酸。缓冲盐的浓度优选为10-600mmol/l，更优选为25-400mmol/l。

按照本发明，所述的rb1、rb2和rb3反应液中防腐剂优选为叠氮钠(nan3)、proclin300或者proclin950，防腐剂的质量浓度优选为0.01％-1％。

按照本发明，所述的rb3反应液中的阻断剂可以使用鼠igg、或者罗氏、scantibody商品化的阻断剂，阻断剂使用浓度范围优选为10-500ug/ml，更优选为50-200ug/ml。

按照本发明，所述的rb1、rb2和rb3反应液中的蛋白稳定剂优选为bsa、酪蛋白或者bgg中的一种或几种，所述的蛋白稳定剂的质量浓度为0.1％-10％。

按照本发明，所述的rb1、rb2和rb3反应液中的表面活性剂优选为吐温、聚乙二醇或者曲拉通，所述的表面活性剂的质量浓度优选为0.01％-1％。

按照本发明，所述的试剂盒b的制备方法，包括：

步骤一：rb1反应液的制备

将缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成rb1基础缓冲液；

对于羧基磁珠，取磁珠(来源为jsr公司，型号为ms300/carboxyl)，粒径3μm，用缓冲液清洗，然后重悬至缓冲液中，混均匀后加入nse抗体，nse抗体用量为磁珠质量的0.1％-10％，继续悬混均匀，然后加入碳二亚胺盐酸盐(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，edc)，用量为磁珠质量的10％，在室温下活化悬混反应2-18小时，反应结束后，使用磁力架集磁，弃上清液，然后使用缓冲液清洗磁珠，得到nse抗体包被的磁珠。所述的碳二亚胺盐酸盐(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，edc)在加入之前优选先溶解于缓冲液中，所述的缓冲液优选为ph6.0的mes缓冲液或ph7.4的pb缓冲液，浓度优选为20mm；edc与磁珠的质量比优选为10％，磁珠的终反应浓度不低于20mg/ml；

对于对甲苯磺酰基官能团化的磁珠，取磁珠(选自jsr公司，型号为ms300/tosyl)，粒径3μm，同时加入硫酸铵和nse抗体，nse抗体用量为磁珠质量的0.1％-10％，磁珠的终反应浓度不低于20mg/ml，硫酸铵反应浓度为12mol/l，所述的硫酸铵在加入之前优选先溶解于缓冲液中，在37℃条件下活化悬混反应10-36小时，反应结束后，使用磁力架集磁，弃上清液，然后使用缓冲液清洗磁珠，得到nse抗体包被的磁珠。

将nse抗体包被的磁珠置于rb1基础缓冲液，配成磁珠浓度为0.03％-0.1％的rb1反应液；

步骤二：rb2反应液的制备

将nacl、氯化镁、缓冲液、防腐剂蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成rb2基础缓冲液；

取nse抗体，与溶解于溶剂中的吖啶酯溶液按照摩尔浓度1:(1-20)的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb，标记时间1-12小时，反应过程需要避光，标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，得到吖啶酯标记的nse抗体；所述的溶剂优选为dmf，吖啶酯溶液的浓度优选为3mg/ml，标记缓冲液的浓度优选为20mmol/l；

取吖啶酯标记的nse抗体置于rb2基础缓冲液中，配成浓度为0.1-3ug/ml的rb2反应液；

步骤三：rb3反应液的制备

将nacl、氯化镁、缓冲液、阻断剂、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制rb3反应液；

步骤四：校准品

将高浓度抗原定量添加至含有5％bsa的pbs缓冲液中，配成理论浓度为0，2，10，25，100，250，500ng/ml的校准品，然后使用公司一级校准品赋值，赋值后的浓度即为校准品使用浓度。

按照本发明，所述的试剂盒b的测定方法，包括：

将样本、rb3、rb1反应液顺序加入反应杯中，孵育5-20分钟，加入清洗液，清洗；再加入rb2，孵育5-20分钟；然后加入清洗液，清洗；最后将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数，样本中nse的含量与光量子数成正比。

或者，将样本、rb3、rb1反应液顺序加入反应杯中，孵育5-20分钟；再加入rb2，孵育5-20分钟；然后加入清洗液，清洗；最后将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数，样本中nse的含量与光量子数成正比。

本发明还提供一种用于检测神经元特异性烯醇化酶的化学发光免疫试剂盒c，该试剂盒c包括：

校准品，所述的校准品优选浓度为0，2，10，25，100，250，500ng/ml校准品基质配方为ph7.4的磷酸缓冲液(pb)，0.15mol/l氯化钠(nacl)，质量浓度为5％的牛血清白蛋白(bsa)；

磁颗粒反应液rc1，所述的磁颗粒反应液rc1包含nse抗体包被的磁珠、缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂，所述的磁颗粒反应液rc1中，nse抗体包被的磁珠的质量浓度优选为0.03％～0.1％；所述的磁珠为羧基磁珠或对甲苯磺酰磁珠；粒径优选为3μm；

示踪结合物反应液rc2，所述的示踪结合物反应液rc2包含吖啶酯标记的nse抗体、nacl、mgcl2、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂；所述的示踪结合物反应液rc2中，吖啶酯标记的nse抗体的浓度优选为0.1-3ug/ml，nacl的浓度优选为0.15mol/l，氯化镁(mgcl2)的浓度优选为0-50mmol/l；

按照本发明，所述的rc1和rc2反应液中的缓冲液缓冲范围优选ph5.5-9.0，更优选ph6.0-7.4，作为缓冲盐可以使用2-(n-吗啡啉)乙磺酸(mes)、哌嗪-nn-双(2-乙磺酸)(pipes)、3-(n-码啡基)-2-羟基丙磺酸钠(mopso)、tris-盐酸。缓冲盐的浓度优选为10-600mmol/l，更优选为50-400mmol/l。

按照本发明，所述的rc1和rc2反应液中防腐剂优选为叠氮钠(nan3)、proclin300或者proclin950，防腐剂的质量浓度优选为0.01％-1％。

按照本发明，所述的rc1反应液中的阻断剂可以使用鼠igg、或者罗氏、scantibody商品化的阻断剂，阻断剂使用浓度范围优选为10-500ug/ml，更优选为50-200ug/ml。

按照本发明，所述的rc1和rc2反应液中的蛋白稳定剂优选为bsa、酪蛋白或者bgg中的一种或几种，所述的蛋白稳定剂的质量浓度为0.1％-10％。

按照本发明，所述的rc1和rc2反应液中的表面活性剂优选为吐温、聚乙二醇或者曲拉通，所述的表面活性剂的质量浓度优选为0.01％-1％。

按照本发明，所述的试剂盒c的制备方法，包括：

步骤一：rc1反应液的制备

将缓冲液、防腐剂、阻断剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成rc1基础缓冲液；

对于羧基磁珠，取磁珠(来源为jsr公司，型号为ms300/carboxyl)，粒径3μm，用缓冲液清洗，然后重悬至缓冲液中，混均匀后加入nse抗体，nse抗体用量为磁珠质量的0.1％-10％，继续悬混均匀，然后加入碳二亚胺盐酸盐(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，edc)，用量为磁珠质量的10％，在室温下活化悬混反应2-18小时，反应结束后，使用磁力架集磁，弃上清液，然后使用缓冲液清洗磁珠，得到nse抗体包被的磁珠。所述的碳二亚胺盐酸盐(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，edc)在加入之前优选先溶解于缓冲液中，所述的缓冲液优选为ph6.0的mes缓冲液或ph7.4的pb缓冲液，浓度优选为20mm；edc与磁珠的质量比优选为10％，磁珠的终反应浓度不低于20mg/ml；

对于对甲苯磺酰基官能团化的磁珠，取磁珠(选自jsr公司，型号为ms300/tosyl)，粒径3μm，同时加入硫酸铵和nse抗体，nse抗体用量为磁珠质量的0.1％-10％，磁珠反应浓度不低于20mg/ml，硫酸铵反应浓度为12mol/l，所述的硫酸铵在加入之前优选先溶解于缓冲液中，在37℃条件下活化悬混反应10-36小时，反应结束后，使用磁力架集磁，弃上清液，然后使用缓冲液清洗磁珠，得到nse抗体包被的磁珠。

将nse抗体包被的磁珠置于rc1基础缓冲液，配成浓度为0.03％～0.1％的rc1反应液；

步骤二：rc2反应液的制备

将nacl、氯化镁、缓冲液、防腐剂、蛋白稳定剂和表面活性剂混合，配制成rc2基础缓冲液；

取nse抗体，与溶解于溶剂中的吖啶酯溶液按照摩尔浓度1:(1-20)的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb，标记时间1-12小时，反应过程需要避光，标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，得到吖啶酯标记的nse抗体；所述的溶剂优选为dmf，吖啶酯溶液的浓度优选为3mg/ml，标记缓冲液的浓度优选为20mmol/l；

取吖啶酯标记的nse抗体置于rc2基础缓冲液中，配成浓度为0.05-3ug/mlrc2反应液；

步骤三：校准品

将高浓度抗原定量添加至含有5％bsa的pbs缓冲液中，配成理论浓度为0，2，10，25，100，250，500ng/ml的校准品，然后使用公司一级校准品赋值，赋值后的浓度即为校准品使用浓度。

按照本发明，所述的试剂盒c的测定方法，包括：

将样本、rc1反应液顺序加入反应杯中，孵育5-20分钟；然后加入清洗液清洗；再加入rc2，孵育5-20分钟加入清洗液清洗；最后将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数，样本中nse的含量与光量子数成正比。

或者，将样本、rc1反应液顺序加入反应杯中，孵育5-20分钟；再加入rc2，孵育5-20分钟加入清洗液清洗；最后将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数，样本中nse的含量与光量子数成正比。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。

实施例1试剂盒a

1.1试剂盒构成

1.2试剂盒的制备方法

(1)ra1反应液的制备

取链酶亲和素磁珠，粒径3μm，用ph7.2的pbs缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至适量的ra1基础缓冲液中(除磁珠之外的其它成分)，配成质量浓度0.1％的ra1反应液。

(2)ra2反应液的制备

a.制备吖啶酯标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的吖啶酯(3mg/ml)按照摩尔浓度1：7.5的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间4h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为245.6ug/ml。

b.制备ra2反应液：

取适量吖啶酯标记的nse抗体原液于ra1基础缓冲液中，配成nse抗体浓度为0.2ug/ml的ra2反应液。

(3)ra3反应液的制备

a.制备生物素标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的生物素(3mg/ml)按照摩尔浓度1:20的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间4h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为200.1ug/ml。

b.制备ra3反应液：

取适量生物素标记的nse抗体原液于ra1基础缓冲液中(除抗体外的其它成分)，配成浓度为1.4ug/ml的ra3反应液。

1.3试剂盒的测试方法

第一步，将30ul样本、60ulra2、60ulra3反应液顺序加入反应杯中，孵育15分钟，在该过程中，抗体与抗原形成夹心复合物；第二步，在反应杯中继续加入50ulra1反应液，孵育5分钟；第三步，加入清洗液，清洗五次；第四步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。

实施例2试剂盒a

1.1试剂盒构成

1.2试剂盒的制备方法

(1)ra1反应液的制备

取链酶亲和素磁珠，粒径3μm，用ph7.2的pbs缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至适量的ra1基础缓冲液中(除磁珠之外的其它成分)，配成质量浓度0.1％的ra1反应液。

(2)ra2反应液的制备

a.制备吖啶酯标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的吖啶酯(3mg/ml)按照摩尔浓度1：3的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间12h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为210.3ug/ml。

b.制备ra2反应液：

取适量吖啶酯标记的nse抗体原液于ra1基础缓冲液中，配成nse抗体浓度为1ug/ml的ra2反应液。

(3)ra3反应液的制备

a.制备生物素标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的生物素(3mg/ml)按照摩尔浓度1:40的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间8h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为198.9ug/ml。

b.制备ra3反应液：

取适量生物素标记的nse抗体原液于ra1基础缓冲液中(除抗体外的其它成分)，配成浓度为4ug/ml的ra3反应液。

1.3试剂盒的测试方法

第一步，将30ul样本、60ulra2、60ulra3反应液顺序加入反应杯中，孵育10分钟，在该过程中，抗体与抗原形成夹心复合物；第二步，在反应杯中继续加入50ulra1反应液，孵育10分钟；第三步，加入清洗液，清洗五次；第四步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。

实施例3试剂盒a

1.1试剂盒构成

1.2试剂盒的制备方法

(1)ra1反应液的制备

取链酶亲和素磁珠，粒径1μm，用ph7.2的pbs缓冲液清洗三次，然后将磁珠重悬至适量的ra1基础缓冲液中(除磁珠之外的其它成分)，配成质量浓度0.03％的ra1反应液。

(2)ra2反应液的制备

a.制备吖啶酯标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的吖啶酯(3mg/ml)按照摩尔浓度1：20的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间1h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为243.2ug/ml。

b.制备ra2反应液：

取适量吖啶酯标记的nse抗体原液于ra1基础缓冲液中，配成nse抗体浓度为3ug/ml的ra2反应液。

(3)ra3反应液的制备

a.制备生物素标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的生物素(3mg/ml)按照摩尔浓度1:50的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间2h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为231.6ug/ml。

b.制备ra3反应液：

取适量生物素标记的nse抗体原液于ra1基础缓冲液中(除抗体外的其它成分)，配成浓度为4ug/ml的ra3反应液。

1.3试剂盒的测试方法

第一步，将30ul样本、60ulra2、60ulra3反应液顺序加入反应杯中，孵育20分钟，在该过程中，抗体与抗原形成夹心复合物；第二步，在反应杯中继续加入50ulra1反应液，孵育5分钟；第三步，加入清洗液，清洗五次；第四步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。

实施例4试剂盒b

1.1试剂盒构成

1.2试剂盒的制备方法

(1)rb1反应液的制备

取适量羧基磁珠，粒径3μm，用20mmph6.0的mes缓冲液清洗三遍，然后重悬至20mmph6.0的mes缓冲液中，磁珠质量浓度为40mg/ml，悬混均匀后加入nse抗体，抗体用量为磁珠质量的2％，混匀后加入适量的碳二亚胺盐酸盐(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，edc)，在室温下活化悬混反应2小时。edc在使用前事先溶解于20mmph6.0的mes缓冲液中，edc与磁珠的质量比为10％，磁珠的终反应浓度为20mg/ml。反应结束后，使用磁力架集磁，弃上清液，使用20mmpb清洗磁珠三次，最后重悬至rb1基础缓冲液中，配成磁珠质量浓度为0.03％的rb1反应液。

(2)rb2反应液的制备

a.制备吖啶酯标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的吖啶酯(3mg/ml)按照摩尔浓度1：15的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间6h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为268.1ug/ml。

b.制备rb2反应液：

取适量吖啶酯标记的nse抗体原液于rb2基础缓冲液中，配成nse抗体浓度为0.1ug/ml的ra2反应液。

(3)rb3反应液的制备

按照rb3反应液配方进行配制。

1.3试剂盒的测试方法

第一步，将30ul样本、60ulrb3、60ulrb1反应液加入反应杯中，孵育10分钟；第二步，加入清洗液清洗5次；第三步，加入rb2反应液，孵育10分钟；第四步，加入清洗液清洗5次；第五步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。

实施例5试剂盒b

1.1试剂盒构成

1.2试剂盒的制备方法

(1)rb1反应液的制备

取适量羧基磁珠，粒径3μm，用20mmph6.0的mes缓冲液清洗三遍，然后重悬至20mmph6.0的mes缓冲液中，磁珠质量浓度为40mg/ml，悬混均匀后加入nse抗体，抗体用量为磁珠质量的10％，混匀后加入适量的碳二亚胺盐酸盐(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，edc)，在室温下活化悬混反应2小时。edc在使用前事先溶解于20mmph6.0的mes缓冲液中，edc与磁珠的质量比为10％，磁珠的终反应浓度为20mg/ml。反应结束后，使用磁力架集磁，弃上清液，使用20mmpb清洗磁珠三次，最后重悬至rb1基础缓冲液中，配成磁珠质量浓度为0.08％的rb1反应液。

(2)rb2反应液的制备

a.制备吖啶酯标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的吖啶酯(3mg/ml)按照摩尔浓度1：1的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间4h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为243.8ug/ml。

b.制备rb2反应液：

取适量吖啶酯标记的nse抗体原液于rb2基础缓冲液中，配成nse抗体浓度为2ug/ml的ra2反应液。

(3)rb3反应液的制备

按照rb3反应液配方进行配制。

1.3试剂盒的测试方法

第一步，将30ul样本、60ulrb3、60ulrb1反应液加入反应杯中，孵育20分钟；第二步，加入清洗液清洗三次；第三步，加入rb2反应液，孵育10分钟；第四步，加入清洗液清洗5次；第五步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。

实施例6试剂盒b

1.1试剂盒构成

1.2试剂盒的制备方法

(1)rb1反应液的制备

取适量tosyl磁珠，粒径3μm，用20mmph8.0的pb缓冲液清洗三遍，然后重悬至20mmph8.0的pb缓冲液中，磁珠质量浓度为40mg/ml，悬混均匀后加入nse抗体，抗体用量为磁珠质量的2％，混匀后加入硫酸铵，硫酸铵反应浓度为1.2mol/l，在37℃下活化悬混反应18小时。硫酸铵事先溶解于20mmph8.0的pb缓冲液中，磁珠的终反应浓度为20mg/ml。反应结束后，使用磁力架集磁，弃上清液，使用20mmpbph7.2清洗磁珠三次，最后重悬至rb1基础缓冲液中，配成磁珠质量浓度为0.05％的rb1反应液。

(2)rb2反应液的制备

a.制备吖啶酯标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的吖啶酯(3mg/ml)按照摩尔浓度1：20的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间4h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为213.8ug/ml。

b.制备rb2反应液：

取适量吖啶酯标记的nse抗体原液于rb2基础缓冲液中，配成nse抗体浓度为0.3ug/ml的ra2反应液。

(3)rb3反应液的制备

按照rb3反应液配方进行配制。

1.3试剂盒的测试方法

第一步，将40ul样本、60ulrb3、60ulrb1反应液加入反应杯中，孵育15分钟；第二步，加入rb2反应液，孵育10分钟；第三步，加入清洗液清洗5次；第四步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。

实施例7试剂盒c

1.1试剂盒构成

1.2试剂盒的制备方法

(1)rc1反应液的制备

取适量对甲苯磺酰基官能团化的磁珠，粒径3μm，用20mmph7.4的pb缓冲液清洗三遍，然后重悬至20mmph7.4的pb缓冲液中，悬混均匀后加入nse抗体，抗体量为磁珠质量的4％，混匀并加入含有3m硫酸铵的20mmph7.4的pb缓冲液，悬混均匀后将反应管置于37℃恒温箱中继续悬混反应24小时。反应结束后，使用磁力架集磁，弃上清液，然后使用20mmpb清洗磁珠三次，最后重悬至rc1基础缓冲液中，配成质量百分比为0.03％rc1反应液。

(2)rc2反应液的制备

a.制备吖啶酯标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的吖啶酯(3mg/ml)按照摩尔浓度1：3的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间8h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为235.8ug/ml。

b.制备rc2反应液：

取适量吖啶酯标记的nse抗体原液于rc1基础缓冲液中，配成nse抗体浓度为0.7ug/ml的rc2反应液。

1.3试剂盒的测试方法

第一步，将10ul样本、70ulrc1反应液加入反应杯中，孵育20分钟；第二步，加入清洗液清洗5次；第三步，加入70ulrc2，孵育5分钟；第四步，加入清洗液清洗5次；第五步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。

实施例8试剂盒c

1.1试剂盒构成

1.2试剂盒的制备方法

(1)rc1反应液的制备

取适量对甲苯磺酰基官能团化的磁珠，粒径3μm，用20mmph7.4的pb缓冲液清洗三遍，然后重悬至20mmph7.4的pb缓冲液中，悬混均匀后加入nse抗体，抗体量为磁珠质量的4％，混匀并加入含有3m硫酸铵的20mmph7.4的pb缓冲液，悬混均匀后将反应管置于37℃恒温箱中继续悬混反应24小时。反应结束后，使用磁力架集磁，弃上清液，然后使用20mmpb清洗磁珠三次，最后重悬至rc1基础缓冲液中，配成质量百分比为0.1％rc1反应液。

(2)rc2反应液的制备

a.制备吖啶酯标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的吖啶酯(3mg/ml)按照摩尔浓度1：10的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间2h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为267.5ug/ml。

b.制备rc2反应液：

取适量吖啶酯标记的nse抗体原液于rc1基础缓冲液中，配成nse抗体浓度为3ug/ml的rc2反应液。

1.3试剂盒的测试方法

第一步，将20ul样本、70ulrc1反应液加入反应杯中，孵育20分钟；第二步，加入清洗液清洗5次；第三步，加入70ulrc2，孵育5分钟；第四步，加入清洗液清洗5次；第五步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。

实施例9试剂盒c

1.1试剂盒构成

1.2试剂盒的制备方法

(1)rc1反应液的制备

取适量羧基磁珠，粒径3μm，用20mmph6.0的mes缓冲液清洗三遍，然后重悬至20mmph6.0的mes缓冲液中，磁珠质量浓度为40mg/ml，悬混均匀后加入nse抗体，抗体用量为磁珠质量的2％，混匀后加入适量的碳二亚胺盐酸盐(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，edc)，在室温下活化悬混反应4小时。edc在使用前事先溶解于20mmph6.0的mes缓冲液中，edc与磁珠的质量比为10％，磁珠的终反应浓度为20mg/ml。反应结束后，使用磁力架集磁，弃上清液，使用20mmpb清洗磁珠三次，最后重悬至rc1基础缓冲液中，配成磁珠质量浓度为0.1％的rc1反应液。

(2)rc2反应液的制备

a.制备吖啶酯标记的nse抗体：

取适量nse抗体，与溶解于dmf中的吖啶酯(3mg/ml)按照摩尔浓度1：15的比例进行标记，标记缓冲液为ph7.4pb(20mmol/l)，标记时间2h，反应过程需要避光。标记反应结束后，使用akta纯化仪(g25凝胶柱)纯化，流速为3ml/min，收集管中纯化后的原液使用紫外分光光度计进行抗体定量，定量浓度为248.5ug/ml。

b.制备rc2反应液：

取适量吖啶酯标记的nse抗体原液于rc1基础缓冲液中，配成nse抗体浓度为0.2ug/ml的rc2反应液。

1.3试剂盒的测试方法

第一步，将50ul样本、70ulrc1反应液加入反应杯中，孵育20分钟；第二步，加入70ulrc2，孵育5分钟；第三步，加入清洗液清洗5次；第四步，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，激发发光反应，测量产生的光量子数。

对比例1(不添加mgcl2配方)

1.1试剂盒构成

1.2试剂盒的制备方法同实施例1

1.3试剂盒的测试方法同实施例1

图1和表1为实施例1试剂盒的定标曲线和校准数据，图2和表2为对比例1不含mg²⁺试剂盒的定标曲线和校准数据，用5p拟合方法将校准品的浓度对光量子数作图，即得到试剂盒的定标曲线。将临床样本的光量子数带入定标曲线，即可得到临床样本的浓度值。

表3为实施例1的试剂盒的血清血浆样本测试数据，表4为对比例1配方不含mg²⁺试剂盒的血清血浆样本测试数据。试剂盒线性范围达到1-500ng/ml，添加mg²⁺的配方血清与血浆测值相关性r>0.975。

表5为本发明实施例1的线性数据，图3为本发明实施例1的线性曲线。

表6为本发明实施例1的灵敏度光量子数据。

表7为本发明实施例1准确度数据。

表1

表2

表3

表4

添加mgcl2配方血清与血浆测值相关系数r＝0.994，不添加mgcl2配方血清与血浆测值相关系数r＝0.906。

表5

注：线性样本为高值样本按照一定比例顺序稀释制得。

表6

表7