利用高效液相色谱鉴别金银花和山银花的方法与流程

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，涉及一种鉴别金银花和山银花的方法，具体涉及一种利用高效液相色谱鉴别金银花和山银花的方法。

背景技术

金银花和山银花自2005版《中华人民共和国药典》起分列为两种药材。由于二者原植物种属相近、药材外观形态相似，难以区分，因此市场上金银花和山银花药材来源不清、品种混乱，因为山银花产量大，价格低，市场上经常存在山银花冒充金银花现象，然而两者的物质基础相差较大，从而直接影响到药材及其制剂的疗效，更严重的是山银花中皂苷含量比金银花多，而皂苷可以导致注射剂的溶血现象，直接危害用药者的生命安全。

用传统方法可将金银花及山银花同其他药材分开，但是现有的用于金银花与山银花两者之间的品种鉴别方法均存在一些不足之处。如传统的外观形态鉴别依赖经验、主观性大，尤其是对于市场上两者混合品或粉碎状态无法鉴别；dna分子鉴定法技术复杂、环境为万级实验，要求高，成本高，检验周期长，影响因素多导致重复性差。药理法验证成本高、周期长、影响因素多导致误差大，这些方法虽然可以在一定程度上对近缘品种进行区分，但无法对药效的优劣进行评价。

专利cn103173532b(一种鉴别金银花和山银花的方法及其应用)涉及一种鉴别金银花和山银花的方法及其应用。本方法包括pcr扩增its2核苷酸序列，包括1)提取样品dna；2)pcr扩增含有核糖体dna的its2序列的片段；3)对扩增产物进行拼接，获得完整its2基因间隔区；4)构建样品的its2序列的nj树。专利cn104419754a(一种快速鉴别金银花真伪的方法)公开了一种鉴别金银花及其常见伪品山银花的方法，是利用高分辨率溶解曲线技术对金银花与山银花的标志性核酸位点进行分析。本方法通过对供试金银花样品进行dna提取、pcr扩增和hrm分析，确认标志性核酸位点分型，进而对金银花真伪进行鉴定。上述方法属于dna分子鉴定法、需要pcr扩增，技术复杂，成本高。

专利cn105277721b(一种鉴别口炎清制剂原料山银花和金银花的方法)公开了一种区分金银花和山银花的鉴别方法，包括以下步骤：以山银花或含山银花原料的制剂为对照；构建急性口腔炎症模型；通过比较供试品和对照标准品对急性口腔炎症模型细胞中炎症因子tnf-α、il-6、il-8和il-10表达水平的影响，鉴别区分金银花和山银花或其复方制剂。本方法需要山银花或含山银花原料的制剂为对照，构建急性口腔炎症模型；存在检验方法复杂、检验不够快速、成本高、影响因素多、误差大的缺陷。

技术实现要素：

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种利用高效液相色谱鉴别金银花和山银花的方法。本方法以断马钱子酸为指标，采用液相色谱法进行检测金银花及山银花干燥品中断马钱子酸的重量百分比，来鉴别金银花和山银花。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

利用高效液相色谱鉴别金银花和山银花的方法，当待测物为金银花或山银花中的一种或两种时，通过高效液相色谱检测金银花和山银花干燥品中断马钱子酸的重量百分比来鉴别金银花和山银花。

优选的，上述鉴别方法中，当断马钱子酸含量小于1.5％时，判定为非金银花；断马钱子酸含量大于1.0％，判定为非山银花；当断马钱子酸含量小于等于1.5％，且大于等于1.0％时，判定为金银花或山银花的混合物。

优选的，上述鉴别金银花和山银花中断马钱子酸的含量的检测方法为：取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，于200-280nm波长处测定峰面积，采用外标法或标准曲线法计算，得到金银花和山银花中断马钱子酸的含量。

上述方法中，取对照品溶液与供试品溶液视为进样量为2-25μl。

一步优选的，取对照品溶液与供试品溶液视为进样量为2-20μl。

进一步优选的，上述检测方法的波长范围为230～254nm。

进一步优选的，上述检测方法的最优波长为240nm。

优选的，上述高效液相色谱法的测定条件为：

色谱柱c18，4.6mm×250mm，5μm；波长200～280nm；以乙腈为流动相a，以ph值为1.5～4的酸水溶液为流动相b，采用梯度洗脱，其中流动相a0～20min，体积百分比5％→15％；20～25min，体积百分比15％→23％；其余为流动相b。

进一步优选的，所述酸水溶液包括磷酸、甲酸、乙酸、磷酸盐中的一种或几种。

进一步优选的，对照品溶液的制备步骤：取断马钱子酸对照品，精密称定，加溶剂制成0.05-0.5mg/ml的溶液。

供试品溶液的制备：取供试品粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入溶剂10-50ml，超声处理15-60分钟，摇匀，过滤，即得。

进一步优选的，所述超声的功率为250w，频率35khz。

进一步优选的，所述溶剂为水、0-50％乙醇溶液或0-50％甲醇溶液中的一种或几种。

本发明的有益效果：

本发明通过高效液相色谱检测金银花和山银花干燥品中断马钱子酸的重量百分比来鉴别金银花和山银花，快捷、准确，为药品的生产、流通、使用过程中提供了一种鉴别真假的依据。

附图说明

图1是断马钱子酸对照品谱图；

图2是金银花谱图；

图3是山银花谱图；

图4是不同产地山银花谱图；

图5是不同产地、不同溶剂、不同干燥方式的山银花谱图；

图6是254nm检测波长下山银花谱图；

图7是河南不同批次金银花谱图；

图8是河北不同批次金银花谱图；

图9是山东不同批次金银花谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1建立检测方法

1.仪器与材料

1.1仪器

安捷伦1260二元高效液相色谱仪，安捷伦g4212b二极管列阵检测器，安捷伦eclipsexdb-c18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，kh500b型超声清洗器(昆山grad)，明澈d24uv超纯水系统(密理博中国)。

1.2材料与试剂

乙腈(fisherscientific)为色谱级，水为一级超纯水，无水乙醇(comio)等其他试剂为分析级；断马钱子酸对照品购置于上海诗丹德标准技术服务有限公司生产，批号：60077-46-5。

2.试验方法

2.1色谱条件

色谱柱c18，4.6mm×250mm，5μm；波长240nm；以乙腈为流动相a，以ph值为2.0的磷酸水溶液为流动相b，采用梯度洗脱，其中流动相a0～20min，体积百分比5％→15％；20～25min，体积百分比15％→23％；其余为流动相b。

2.2对照品溶液的制备

取断马钱子酸对照品，精密称定，加10％乙醇制成0.27mg/ml的溶液。

2.3供试品溶液的制备

取样品粉末(过四号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％乙醇25ml，超声处理(功率250w，频率35khz)30分钟，摇匀，滤过，即得。

2.4方法学研究

2.4.1线性考察

精密吸取对照品溶液(0.27mg/ml)2、5、10、15、20、25μl，分别注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积(a)对进样质量(m，μg)进行线性回归，回归方程为：a＝1182*c-24.2，相关系数r＝0.9998，结果表明断马钱子酸溶液在0.54μg～6.75μg之间呈良好的线性关系。结果见表1。

表1线性关系考察

2.4.2仪器精密度

精密吸取对照品溶液(0.27mg/ml)10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算仪器精密度，结果如下：

表2仪器精密度考察

结果表明：平均峰面积3182.2，rsd＝0.43％，仪器精密度良好。

2.4.3重复性

取同一批样品(山东产金银花)，平行取6份，按上述的含量测定方法制备供试品溶液和对照品溶液，精密吸取溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算含量，结果表明，此方法测定断马钱子酸的含量，重复性良好。结果如下：

表3重复性实验考察

结果表明：rsd＝1.83％，重复性实验良好。

2.5样品测定

取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，于240nm处测定峰面积，采用外标法计算，即得金银花和山银花中断马钱子酸的含量。结果见图1-3。

实施例2验证实验

1.不同产地山银花验证。

以不同产地山银花为研究对象，采用实施例1中所述方法的检测条件测定含量，其结果见图4。

图中谱图自上而下依次为重庆解放路山银花、山东保利提供贵州山银花、山东保利提供贵州产山银花、山东保利提供湖南产山银花。

结合断马钱子酸对照图谱和图4可以看出：不同产地山银花图谱中断马钱子酸对照品对应位置无或者有微量的色谱峰，经计算含量远低于1.0％。

2.不同产地、不同溶剂、不同干燥方式等条件下的山银花验证。

以不同产地山银花为研究对象，采用不同溶剂提取，按照实施例1所述方法的检测条件测定含量，谱图见图5。

图5中所示谱图由上而下依次为：红腺毛忍冬1(溶剂为水)、对照品(溶剂为水)、黄褐毛山银花(溶剂为50％甲醇)、义乌山银花(溶剂为50％甲醇)、南宁马山山银花(溶剂为50％甲醇)、贵州第3批山银花(溶剂为50％甲醇)、贵州第2批山银花(溶剂为50％甲醇)、南宁马山山银花(溶剂为水)、贵州第3批山银花(溶剂为水)、贵州第4批山银花(溶剂为水)、贵州第5批山银花(溶剂为水)、灰毡毛山银花(溶剂为水)、黄褐毛山银花(溶剂为水)、安徽红腺毛山银花(溶剂为水)、冻干绿色山银花(溶剂为水)、晒干褐色山银花(溶剂为水)、贵州红腺毛山银花(溶剂为水)。

由图5可以看出：水、50％甲醇都可以作为断马钱子酸的提取溶剂；不同产地、不同溶剂提取的山银花图谱中断马钱子酸对照品的对应位置无或者有微量的色谱峰，经计算断马钱子酸的含量远低于1.0％。

3.不同波长的样品验证

以不同批次灰毡毛山银花为研究对象，按照实施例1所述方法的检测条件在254nm处测定含量，结果见图6所示。

图6中谱图从上到下依次为：断马钱子酸对照品、灰黄褐毛山银花、灰毡毛山银花第1批、灰毡毛山银花第2批、灰毡毛山银花第3批、灰毡毛山银花第4批、灰毡毛山银花第5批、灰毡毛山银花第6批。

由图6可以看出：254nm可以作为检测断马钱子酸的检测波长；不同批次山银花图谱中断马钱子酸对照品对应位置无或者有微量的色谱峰，经计算含量远低于1.0％。

4.不同批次、不同市场规格、不同产地金银花样品验证

以不同批次、不同市场规格、不同产地(山东、河南)金银花为研究对象，按照实施例1中所述方法的检测条件测定含量，结果见图7-9所示。

图7中谱图从上到下依次为：河南二等品第1批、河南二等品第2批、河南二等品第3批、河南二等品第4批、河南二等品第5批。

图8中谱图从上到下依次为：河北三等品第3批、河北三等品第1批、河北三等品第2批。

图9中谱图从上到下依次为：山东产第4批、山东产第1批、山东产第2批、山东产第3批。

结合断马钱子酸对照图谱和图7-9可以看出：不同批次、不同市场规格、不同产地金银花图谱中断马钱子酸对照品对应位置有明显的色谱峰，经计算含量远高于1.5％。

5.不同产地、不同批次的金银花中断马钱子酸含量

分别取河北省、河南省和山东省各批次金银花按照实施例1中所述方法的检测条件进行检测，所得检测结果如表4所示。

表4河北省、河南省和山东省各批次金银花检测结果

6.不同产地、不同批次的山银花中断马钱子酸含量

分别取广东省、贵州省和湖南省各批次山银花按照实施例1中所述方法的检测条件进行检测，所得检测结果如表5所示。

表5广东省、贵州省和湖南省各批次山银花检测结果

通过对不同产地、不同批次的金银花和山银花的检测，证明本方法可以快速、准确的鉴别金银花和山银花。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。