一种婴幼儿乳粉中低聚果糖和棉子糖的检测方法与流程

本发明涉及一种婴幼儿乳粉中低聚果糖和棉子糖的检测方法，属于食品检测技术领域。

背景技术

低聚果糖(fructooligosaccharide,fos)是由蔗糖和1~3个果糖通过β-(2,1)糖苷键结合而成的低聚糖，包括蔗果三糖(gf2)、蔗果四糖(gf3)、蔗果五糖(gf4)等成分。低聚果糖具有促进肠道双歧杆菌的生长，调节肠道菌群平衡的功能。棉子糖（raffinose）是由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成的一种功能性低聚糖，也具有较强增殖双歧杆菌作用。由于婴儿的肠道发育功能尚未成熟，容易出现肠道菌群失调，而受到外界病毒或细菌的感染，引起腹泻等疾病。利用低聚果糖和棉子糖引其调节肠道菌群的功能，成为婴幼儿配方食品广泛使用的原料之一，在婴幼儿配方乳粉中起到了不可替代的作用。低聚糖在婴幼儿配方食品中的应用引起了整个产业的广泛关注。

目前报道的对低聚果糖检测方法有高效液相色谱法、离子色谱法、液相色谱-质谱法等方法，其中主要以离子色谱法居多。低聚果糖的检测分为直接检测法和间接检测法。其中食品安全国家安全标准gb5009.255-2016《食品中果聚糖的测定》为间接检测法，是通过水解后利用离子色谱法测定果糖含量，后经折算得到食品中低聚果糖总量，未涉及具体低聚糖各成分的分离研究。直接检测法为直接测定低聚果糖各成分后计算加和得到总量。因所添加低聚果糖的主要成分为蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，测定这三种单一成分即代表了低聚果糖的添加含量。目前报道的直接检测法主要检测对象为食品添加剂，原料及饲料等简单基质，检测条件较为简单。婴幼儿乳粉等复杂基质中低聚果糖的方法也有所报道，主要为亲水色谱/高效液相色谱-示差/蒸发光散射检测器方法，但都存在分离不好，干扰严重的问题。主要原因为婴幼儿乳粉中存在高含量的乳糖等单糖的干扰，其与低含量的低聚果糖极性相当，导致分离困难，定量不准等问题。改善分离问题，主要方法是优化前处理方法和改善色谱分离条件，低聚果糖为极性化合物主要采用亲水色谱柱进行分离，色谱条件可调节空间较小，亲水色谱柱的选择是分离的关键。

报道的棉子糖的检测方法有高效液相色谱法和离子色谱法。食品安全国家安全标准gb5009.258-2016《食品中棉子糖的测定》为通过沉淀蛋白，固相萃取柱后经离子色谱法检测食品中棉子糖。该方法存在定性手段单一，基线漂移严重，对仪器要求高等问题。

棉子糖检测标准是采用离子色谱-安培检测器检测婴幼儿配方食品、婴幼儿谷类辅助食品、婴幼儿罐装辅助食品、饮料及豆粉食品。而食品中低聚果糖含量采用间接法测定，且该方法操作过程复杂，只能得到低聚糖总量，无法获得其具体成分信息。

目前对于婴幼儿配方乳粉中低聚果糖和棉子糖同时检测的方法尚未见报道。鉴于低聚果糖和棉子糖调节肠道菌群的功能，被广泛应用于婴幼儿配方乳粉中，其检测成为婴幼儿乳粉质量把关及监管的常规检测项目，但二者作为不同的检测方法需要分别检测。

技术实现要素：

本研究优选新型的亲水分离材料，结合高效液相色谱技术，发展了一种简便、快速、准确检测婴幼儿配方乳粉中低聚果糖和棉子糖同时检测的定性定量方法。

为了解决上述问题，本发明提供一种婴幼儿乳粉中低聚果糖和棉子糖的检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种婴幼儿乳粉中低聚果糖和棉子糖的检测方法，包括以下步骤：

（1）前处理：称取1g试样，置于15ml离心管中，加5ml温水，涡旋溶解后80℃水浴振荡提取30min，取1ml提取液于另一离心管中，加3ml乙腈+水，乙腈与水体积比2：1，加0.2gc18吸附剂，涡旋，离心，上清液过0.22μm有机滤膜，待上机；

（2）标准溶液的配置：分别准确称取蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和棉子糖各标准物质100mg于10ml容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配制成10mg/ml标准储备液，于4℃条件下保存；以1:1乙腈-水将标准储备液配制梯度标准工作溶液，于4℃条件下保存；

（3）获得液相色谱图、回归方程

梯度标准工作溶液用高效液相色谱-蒸发光散射检测仪进行检测，获得色谱图，以色谱峰面积的log值为纵坐标，以标准工作溶液中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、棉子糖的相应浓度值的log值为横坐标作图，得log-log线性回归方程；

（4）定性分析

试样用高效液相色谱-蒸发光散射检测仪进行检测，获得试样色谱图；若试样色谱图中存在与标准色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、棉子糖；

（5）定量计算

采用外标法定量：根据试样色谱图中色谱峰的面积，采用步骤（3）的回归方程，计算得到蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖或/和棉子糖的浓度；

样品中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、棉子糖的含量按下式计算：

式（1）中：

xi—试样中各待测物的含量，单位为毫克每一百克（mg/100g）；

c—测定样品溶液中各待测物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/ml）；

v—定容体积体积，单位为毫升（ml）；

f—稀释倍数；

m—试样的质量，单位为克（g）；

xi分别为x蔗果三糖、x蔗果四糖、x蔗果五糖和x棉子糖；

样品中低聚果糖的含量：x低聚果糖分别为x蔗果三糖+x蔗果四糖+x蔗果五糖。

优选地，所述高效液相色谱仪的色谱柱：clickxion，柱长150mm，柱内径3.0mm，填料粒径3μm（大连化物所研制）；所述超高效液相色谱的流动相：a：乙腈，b：水。

更优选地，所述高效液相色谱的洗脱条件为：柱温：40℃，进样体积：5μl；梯度洗脱条件如下：

“梯度变化曲线为6”是指梯度变化曲线为直线。

优选地，所述的蒸发光散射检测仪的参数：漂移管温度80℃，氮气压力30psi，喷雾器温度60℃，增益50。

本发明建立了同时测定婴幼儿乳粉中低聚果糖和棉子糖的分析方法。试样采用温水提取，乙腈沉淀蛋白，采用亲水色谱柱clickxion（100mm×2.1mmi.d.，粒径5μm）分离，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，蒸发光散射检测器进行测定。本文考察和优化了提取溶剂、净化方式、elsd条件和色谱条件等，elsd优化条件图见图4。结果表明：低聚果糖和棉子糖在各自范围内（蔗果三糖、蔗果四糖0.02-2mg/ml，蔗果五糖和棉子糖0.01-2mg/ml）具有较好的线性关系，相关系数大于0.998。在高中低三个添加水平下，实际样品的回收率在87.4%～104.5%之间，相对标准偏差（rsdn=6）在2.9%-8.5%之间，蔗果三糖和蔗果四糖的检出限为18mg/100g，定量下限为40mg/100g，蔗果五糖和棉子糖的检出限为10mg/100g，定量下限为30mg/100g。本发明前处理操作简单快捷，亲水色谱柱分离效果好，能较好低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）和棉子糖与干扰单糖成分分离开，灵敏度高，定性定量准确。本发明能极好的实现婴幼儿乳粉中低聚果糖和棉子糖的准确定量和同时检测，提高检测效率，降低检测成本。

有益效果

（1）实现了有效分离和准确定量

低聚糖作为一种水溶性成分，极性较强，在一般的反相色谱上没有保留。各种亲水作用色谱可以为强极性和强亲水性的化合物提供合适的保留。婴幼儿乳粉中乳糖等单糖、双糖含量较高，严重影响低含量低聚糖的分析检测。文献报道的婴幼儿乳粉中低聚果糖的检测都未达到较好的分离，定量存在严重问题。本发明分别比较xbrigeamide、nh2柱及clickxion等几种亲水色谱柱，通过比较得出clickxion色谱柱保留强，能在较短时间内很好的将低含量低聚果糖同乳糖等高含量糖有效的分开，特别适合婴幼儿配方乳粉中低聚糖的分析，比较色谱图见图2。由此可见，本发明实现了低聚果糖同干扰成分的完全分离和准确定量，实现了精准检测和质量控制。

（2）提高检测效率

gb5009.255-2016《食品中果聚糖的测定》检测低聚果糖所需检验周期约为300min，其中样品提取和净化需要250min，检测至少需要50min；gb5009.258-2016《食品中棉子糖的测定》测棉子糖所需检验周期约为100min，其中样品提取和净化需要90min，检测至少需要50min。本发明前处理时间仅需50min，仪器测定30min，整个检验周期需要80min。由此可见，本发明能极大的提高检验效率。若进行批量化检测，检验效率高的优势将更加明显。

（3）提高检测效率

本发明中蔗果三糖和蔗果四糖的检出限为18mg/100g，定量下限为40mg/100g，蔗果五糖和棉子糖的检出限为10mg/100g，定量下限为30mg/100g。完全满足国家标准对低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）和棉子糖的要求，且检出限不高于现有文献报道水平，甚至低于部分文献检出限水平。

（4）降低检测成本

本发明将低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）和棉子糖的两次检验合并为一次实验，且无需酶解和过固相萃取净化，大大降低了实验成本。本发明与gb5009.255-2016和gb5009.258-2016相比，仪器检测成本相当，只计算前处理成本。gb5009.255-2016检测低聚果糖每次试验费用大于50元；gb5009.258-2016检测棉子糖每次试验费用约为50元；因此，分次检测低聚果糖和棉子糖前处理费用共为100元。而本发明前处理费用只需10元。比较发现，本发明前处理成本降低十倍以上，还减少一次上机检测成本。

附图说明

图1为xbrigeamide色谱柱下婴幼儿乳粉样品色谱图；

图2为clickxion色谱柱下婴幼儿乳粉样品色谱图；

图3为4种低聚糖标准溶液的色谱图；

图4为4种低聚糖elsd条件优化图(a:漂移管温度优化图；b：喷雾器温度优化图；c：氮气压力优化图；d：增益优化图)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1、仪器与材料

watersh-class超高效液相色谱仪配acquityuplcels检测器(美国waters公司)；色谱柱：clickxion色谱柱（150mm×3.0mmi.d,3µm)。

蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准物质为日本wako标准物质套装，纯度均为99.9%，棉子糖购自sigma,纯度≥99.5%，4℃保存；乙腈（色谱纯，美国fisher公司）；水为超纯水；氮气（>99.999%）；c18吸附剂（美国agilent公司）。有机微孔滤膜（0.22µm,购自上海安谱科学仪器有限公司）。

2、前处理

2.1标准储备液

分别准确称取低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）和棉子糖各标准物质100mg（精确至0.1mg）于10ml容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配制成10mg/ml标准储备液，于4℃条件下保存。

2.2标准工作溶液

以1:1乙腈-水将标准储备液配制梯度标准工作溶液，于4℃条件下保存。

2.3试样

称取1g（精确至0.1mg）试样，置于15ml离心管中，加5ml温水，涡旋溶解后80℃水浴振荡提取30min，取1ml提取液于另一离心管中，加3ml乙腈+水(体积比2+1)，加0.2gc18吸附剂，涡旋，离心，上清液过0.22μm有机滤膜，待上机。

3、液相色谱条件

3.1色谱条件

色谱柱：clickxion，柱长150mm，柱内径3.0mm，填料粒径3μm；

流动相：a：乙腈，b：水；

梯度洗脱，梯度条件见表1，柱温：40℃，进样体积：5μl；

表1液相色谱梯度条件

“梯度变化曲线为6”是指梯度变化曲线为直线。

3.2elsd条件

漂移管温度80℃，氮气压力30psi，喷雾器温度60℃，增益50。

（2）获得液相色谱图、回归方程

梯度标准工作溶液用高效液相色谱-蒸发光散射检测仪进行检测，获得色谱图；

以色谱峰面积的log值为纵坐标，以标准工作溶液中低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）、棉子糖的相应浓度值的log值为横坐标作图，得log-log线性回归方程；

（3）定性分析

试样用高效液相色谱-蒸发光散射检测仪进行检测，获得试样色谱图；若试样色谱图中存在与标准色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）、棉子糖；

（4）定量计算

采用外标法定量：根据试样色谱图中色谱峰的面积，采用步骤（2）的回归方程，计算得到低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）或/和棉子糖的浓度；

4、标准质量色谱图及线回归方程

用高效液相色谱-蒸发光散射检测仪，按照步骤3的条件，测定标准工作溶液，获得不同浓度的标准工作溶液的色谱图（标准色谱图）。其中一个浓度水平(0.5mg/ml)的标准工作溶液的色谱图如图3所示。

将标准工作溶液按质量浓度从低到高依次测定，以各低聚糖峰面积y的log值对其质量浓度x（μg/ml）的log值作标准曲线，得到各低聚糖log-log线性方程，线性范围和相关系数，结果见表2。由表2可见，低聚果糖和棉子糖在各自范围内（蔗果三糖、蔗果四糖0.02-2mg/ml，蔗果五糖和棉子糖0.01-2mg/ml）具有较好的线性关系，相关系数大于0.998。待测试样中低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）和棉子糖响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。

表24种低聚糖线性回归方程

5、方法回收率、精密度和检出限

将同一份婴幼儿配方乳粉样品分成2份，其中一份作本底，另一份添加低中高三个浓度水平的标准溶液，按照步骤4进行检测，每份样品进行6次平行测定，考察方法的回收率和精密度，结果见表2。数据表明，该方法的回收率在87.4%～104.5%之间，相对标准偏差（rsd）为2.9%～8.5%，方法回收率高，重现性好。

低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）和棉子糖的回收率（回收率：（实测值-本底值）/加入量×100％），结果如表3所示。由表3可见回收率在87.4%～104.5%范围内。

对不同试样重复测定6次，测定结果均具有良好的重现性，低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）和棉子糖的相对标准偏差（rsd）为2.9%～8.5%。

采用在空白婴幼儿乳粉中添加目标化合物的方法，测得蔗果三糖和蔗果四糖的检出限（s/n>3)为18mg/100g，定量下限（s/n>10)为40mg/100g，蔗果五糖和棉子糖的检出限为（s/n>3)10mg/100g，定量下限（s/n>10)为30mg/100g。

表3婴幼儿配方乳粉中4种低聚糖添加回收率及精密度（n=6）

6、样品检测

（1）定性分析

试样用高效液相色谱-蒸发光散射检测仪进行检测，按照步骤3的条件，测定试样，获得试样色谱图；若试样色谱图中存在与标准色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）、棉子糖；

（2）定量计算

采用外标法定量：根据试样色谱图中色谱峰的面积，采用步骤4的回归方程，计算得到低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）或/和棉子糖的浓度；

样品中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、棉子糖的含量按下式计算：

式（1）中：

xi—试样中各待测物的含量，单位为毫克每一百克（mg/100g）；

c—测定样品溶液中各待测物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/ml）；

v—定容体积体积，单位为毫升（ml）；

f—稀释倍数；

m—试样的质量，单位为克（g）；

xi分别为x蔗果三糖、x蔗果四糖、x蔗果五糖和x棉子糖；

样品中低聚果糖的含量：x低聚果糖分别为x蔗果三糖+x蔗果四糖+x蔗果五糖；

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。