一种二苯基乙氧基膦的高效液相色谱检测方法与流程

本发明属于医药
技术领域：
，本发明涉及一种药物重要起始物料的分析检测工作，特别是二苯基乙氧基膦的高效液相色谱检测方法。
背景技术：
二苯基乙氧基膦的高效液相色谱检测方法(供试品)是合成瑞舒伐他汀钙的起始原料。其分子式为c14h15op，分子量为230.24，其合成工艺过程中可能会产生杂质a(二苯基膦氧)和杂质b(氧化破坏杂质)，二苯基乙氧基膦结构式如下：本发明的目的为了使二苯基乙氧基膦的出峰时间与溶剂峰及各杂质峰完全分离，改善出峰峰型，进而准确控制二苯基乙氧基膦的含量，目前很难查询到二苯基乙氧基膦与杂质a、杂质b相关高效液相色谱检测方法。本发明的特点在于克服了合成二苯基乙氧基膦的工艺路线中杂质(杂质a、杂质b)不能很好和溶剂峰及杂质峰之间分离的困难。本发明找到了一种与杂质分离度高，出峰时间适中，分析时间短的检测二苯基乙氧基膦有关物质的方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种二苯基乙氧基膦的高效液相色谱检测方法,该方法应专属性好,且灵敏度高,可以解决现有技术中存在的上述问题。本发明涉及的一种二苯基乙氧基膦的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：,(1)制备系统适应性溶液：取二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b适量，用有机溶剂稀释制成每1ml中含供试品0.1mg～1.0mg，含杂质a、杂质b约为1ug/ml～10ug/ml.(2)制备供试品溶液：取二苯基乙氧基膦适量，用有机溶剂稀释制成每1ml中含二苯基乙氧基膦为0.1mg/ml～1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。(3)采用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱。(4)设置液相色谱仪的流动相，即a相为有机相-水，比例为10：90～90：10，b相为有机相，设置液相色谱仪的梯度洗脱，方法见下表。(5)设置液相色谱仪的流速为0.5～1.5ml/min，检测波长200nm～300nm，以及设置液相色谱仪色谱柱温度箱温度为20℃～60℃；(6)取步骤(1)、(2)的样品溶液10ul注入经步骤(3)、(4)、(5)设置的液相色谱仪，完成二苯基乙氧基膦检测。(7)按照峰面积归一化法计算二苯基乙氧基膦中杂质a、杂质b的含量。所述步骤(1)中，系统适用性溶液二苯基乙氧基膦的浓度约为0.1mg/ml～1.0mg/ml，杂质a的浓度为1ug/ml～10ug/ml，杂质b的浓度为1ug/ml～10ug/ml。优选的，步骤(1)中，系统适应性溶液二苯基乙氧基膦的浓度约为0.3mg/ml～0.7mg/ml，杂质a、杂质b为3ug/ml～7ug/ml。优选的，步骤(1)中，系统适应性溶液二苯基乙氧基膦的浓度约为0.3mg/ml～0.7mg/ml，杂质a、杂质b的浓度为3ug/ml～7ug/ml。优选的，步骤(1)中，系统适应性溶液二苯基乙氧基膦的浓度约0.4mg/ml，杂质a、杂质b的浓度为4ug/ml。所述步骤(2)中，供试品溶液的浓度约为0.1mg/ml～1.0mg/ml。优选的，步骤(2)中，供试品溶液的浓度约为0.2mg/ml～0.6mg/ml。优选的，步骤(2)中，供试品溶液的浓度约为0.4mg/ml。所述步骤(1)、(2)中的有机溶剂为乙腈。优选的，步骤(3)中，色谱柱为welchc18(4.6*250mm，5μm)柱，规格为长度250mm、内径4.6mm、粒径5um所述步骤(4)中，a相为有机相-水，比例为15：85～85：15，b相为有机相。所述步骤(4)中，a相为乙腈-水，比例为30：70。所述步骤(4)中，b相有机相为甲醇或乙腈。优选的，步骤(5)中，有机相为乙腈。所述步骤(5)中，流速为0.5～1.5ml/min。优选的，所述步骤(5)中，流速为0.8～1.2ml/min。优选的，步骤(5)中，流速为1.0ml/min。所述步骤(5)中，检测波长为200～300nm。优选的，步骤(5)中，检测波长为230～260nm。优选的，步骤(5)中，检测波长为242nm。所述步骤(5)中，柱温为10℃～60℃。优选的，步骤(5)中，柱温为20℃～50℃。优选的，步骤(5)中，柱温为40℃。所述步骤(6)中，进样量为10ul。所述步骤(7)中，按峰面积归一化法计算二苯基乙氧基膦中杂质a、杂质b的含量。(1)本发明在流动相上采取梯度洗脱，可以使二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的保留时间均在20分钟以内，分离度在2.0以上，理论塔板数高，色谱峰的峰型尖锐，同时具有分离度高，分析时间短等优点。(2)本发明采用乙腈溶解样品，其溶解度大，溶解速度较快，可以有效地避免检测过程中析出固体从而导致色谱柱以及色谱系统的堵塞，使得检测结果准确可靠，其操作简便。本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离度在2.0以上，理论塔板数高，有效地避免各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法具有检测结果准确可靠、分析时间短、成本低、操作简便等优点，且符合检测方法的方法验证要求。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本思路的前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本思路的前提下，做出的任何形式的修改、替换或变更，均在本发明范围内。以下通过实例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明下面结合附图对本发明技术方案进一步说明：图1为实施例1条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果图；图2为实施例2条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果图；图3为实施例3条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果图；图4为实施例4条件下二苯基乙氧基膦、杂质、杂质b的分离效果图；图5为实施例5条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果图；图6为实施例6条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果图；图7为实施例7条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果图；图8本发明检测方法杂质a的线性关系；图9本发明检测方法杂质b的线性关系；具体实施方式本发明中具体实施方式中使用的供试品、设备均为已知产品。二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b，可以购买或自制合成获得，所有杂质均经过检测确证其结构。高效液相色谱仪：agilent1290液相色谱仪dad检测器；色谱柱：welchc18(4.6*250mm，5μm)柱实施例1一种二苯基乙氧基膦的高效液相色谱检测方法：(1)制备系统适用性溶液：精密称取二苯基乙氧基膦及杂质a和杂质b适量，用乙腈稀释二苯基乙氧基膦为0.4mg/ml，杂质a和杂质b为4ug/ml。(2)制备供试品溶液：精密称取二苯基乙氧基膦40mg置100ml量瓶中，用乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，制成二苯基乙氧基膦的浓度为0.4mg/ml，作为供试品溶液；高效液相色谱的检测条件：(3)色谱柱：welchc18(4.6*250mm，5μm)柱；(4)流动相，即a相为乙腈：水＝30：70，b相为乙腈，设置液相色谱仪的梯度洗脱，方法见下表：(5)流速：1.0ml/min，检测波长：242nm，柱温：40℃按照上述检测条件，精密量取系统适应性溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1和表1；精密量取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积规一划化法计算供试品中杂质a、杂质b的含量。杂质a的含量为0.031％，杂质b的含量为0.804％。表1、实施例1条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果表1色谱峰名称保留时间(min)理论塔板数分离度1供试品17.59947887.3817.322杂质a3.36114151.28n/a3杂质b4.40414782.347.71结果表明，本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离度均为5.0以上，理论塔板数均大于10000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的保留时间均在20分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。实施例2一种二苯基乙氧基膦的高效液相色谱检测方法：(1)制备系统适用性溶液：精密称取二苯基乙氧基膦及杂质a和杂质b适量，用乙腈稀释二苯基乙氧基膦为0.4mg/ml，杂质a和杂质b为4ug/ml。(2)制备供试品溶液：精密称取二苯基乙氧基膦40mg置100ml量瓶中，用乙腈溶解稀释至刻度，摇匀，制成二苯基乙氧基膦的浓度为0.4mg/ml，作为供试品溶液；高效液相色谱的检测条件：(3)色谱柱：welchc18(4.6*250mm，5μm)柱；(4)流动相，即a相为乙腈：水＝30：70，b相为乙腈，设置液相色谱仪的梯度洗脱，方法见下表：时间(分钟)a(％)b(％)05050153565350100400100415050585050(5)流速：0.9ml/min，检测波长：242nm，柱温：40℃按照上述检测条件，精密量取系统适应性溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2和表2；精密量取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积规一划化法计算供试品中杂质a、杂质b的含量。杂质a的含量为0.032％，杂质b的含量为0.795％。表2、实施例1条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果表2色谱峰名称保留时间(min)理论塔板数分离度1供试品17.59947887.3817.172杂质a3.72815921.81n/a3杂质b4.8815241.467.96结果表明，本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离度均为5.0以上，理论塔板数均大于10000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的保留时间均在20分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。实施例3除检测条件中改变流速为1.1ml/min外，其他步骤、条件均与实施例1相同。按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，见图3和表3；精密量取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算供试品中杂质a、杂质b的含量。杂质a的含量为0.033％，杂质b含量为0.804％。表3、实施例3条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果表3色谱峰名称保留时间(min)理论塔板数分离度1供试品14.98745140.2217.242杂质a3.05314834.79n/a3杂质b4.00113537.297.46结果标明，本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离度均为5.0以上，理论塔板数均大于10000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的保留时间均在20分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。实施例4除检测条件改变柱温为35℃外，其他步骤、条件均与实施例1相同。按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4和表4；精密量取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算供试品中杂质a、杂质b的含量，杂质a含量为0.048％，杂质b含量为0.078％。表4、实施例4条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b分离效果表4色谱峰名称保留时间(min)理论塔板数分离度1供试品16.70147100.7617.632杂质a3.36414427.22n/a3杂质b4.40616741.628.52结果标明，本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离度均为5.0以上，理论塔板数均大于10000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的保留时间均在20分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。实施例5除检测条件改变柱温为45℃外，其他步骤、条件均与实施例1相同。按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，见图5和表5；精密量取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算供试品中杂质a、杂质b的含量。杂质a的含量为0.039，杂质b含量为0.762。表5、实施例5条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果色谱峰名称保留时间(min)理论塔板数分离度1供试品15.63446395.1216.922杂质a3.34315864.68n/a3杂质b4.36914394.498.58结果表明，本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离度均为5.0以上，理论塔板数均大于10000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的保留时间均在20分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。实施例6除检测条件中改变波长为237nm外，其他步骤、条件均与实施例1相同。按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，见图6和表6；精密量取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算供试品中杂质a、杂质b的含量。杂质a的含量为0.104％，杂质b含量为0.656％。表6、实施例6条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果。表6色谱峰名称保留时间(min)理论塔板数分离度1供试品16.17847100.7617.352杂质a3.36414427.22n/a3杂质b4.40616741.629.43结果表明，本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离度均在5.0以上，理论塔板数均大于10000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的保留时间均在20分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。实施例7除检测条件中改变波长为247nm外，其他步骤、条件均与实施例1相同。按照上述检测条件，精密量取系统适用性溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，见图7和表7；精密量取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算供试品中杂质a、杂质b的含量。杂质a的含量为未检出，杂质b含量为0.627％。表7、实施例7条件下二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离效果表7色谱峰名称保留时间(min)理论塔板数分离度1供试品16.18245637.47n/a2杂质a3.3714153.74n/a3杂质b4.41416630.8817.30结果表明，本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离度均在5.0以上，理论塔板数均大于10000，远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效地避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的保留时间均在20分钟之内，具有分析时间短、成本低等优点。综上所述，本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的分离度在2.0以上，理论塔板数均大于10000,远高于现有技术的分离度和理论塔板数，有效的避免了各组分之间的干扰影响检测结果的准确性；同时，本发明检测方法具有检测结果准确可靠、分析时间短、成本低、操作简便等优点。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：试验例11、定量限和检测限试验精密称取二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b各适量制成1mg/ml的溶液，逐级稀释至s/n≈10，作为定量限溶液。稀释至s/n≈3，作为检测限溶液。精密量取定量限溶液、检测限溶液各10ul，按照实施例1的检测条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。定量限：二苯基乙氧基膦的定量限为0.564ug/ml，杂质a定量限为1.1052ug/ml，杂质b定量限为0.8400ug/ml。检测限：二苯基乙氧基膦的检测限为0.113ug/ml，杂质a的检测限为0.332ug/ml，杂质b的检测限为1.1052ug/ml。试验结果标明，本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b的定量限和检测限低。取定量限溶液，按照实施例1的检测条件，分别连续进样6次，记录色谱图，结果见表8.定量限精密度试验结果表8试验结果表明，本发明检测方法二苯基乙氧基膦、杂质a、杂质b定量限的精密度好。2、线性关系(1)分别取杂质贮备液(与实施例1相同)适量，加乙腈制成含杂质a浓度为0.3462ug/ml～6.924ug/ml、杂质b浓度为0.6988ug/ml～13.976ug/ml的线性溶液；(2)按照实施例1的检测条件对上述线性溶液进行检测，记录色谱图，以杂质a、杂质b的浓度相对应的峰面积进行线性回归，如图8所示；杂质a的线性方程为y＝4576x+0.305，r＝0.999；杂质b的线性方程为y＝4827x+0.071，r＝0.999；试验结果表明，本发明检测方法的条件下，杂质a、杂质b与峰面积线性回归关系良好。3.稳定性试验供试品溶液取浓度为取二苯基乙氧基膦约40mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液。分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h进样，记录色谱图，以各杂质量的变化情况衡量供试品溶液稳定性情况。结果见表8表9、供试品的稳定性试验结果试验结果标明，本发明检测方法在检测过程中供试品溶液的稳定性良好。4.精密度试验重复性制备供试品溶液：精密称取6份二苯基乙氧基膦，每份约40mg，精密称定，置100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，平行配制6份，作为供试品溶液。检测：精密量取上述溶液各10ul，按照实施1的检测条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一法计算供试品中各杂质的峰面积，结果见表9表10、重复性试验结果试验结果表明，本发明检测方法重复性好，符合检测方法的验证要求。5.准确度试验回收率在二苯基乙氧基膦中分别加入限度量的80％、100％、120％的杂质a、杂质b通过外标法计算所得的杂质量，用测得量与理论量的比值作为回收值。实验结果见表10～表12表11、杂质a回收率试验结果表12、杂质b回收率结果本发明检测方法的定量限低、检测限低、线性关系良好、稳定性好、精密度良好，重复性好检测结果准确可靠；同时，具有易操作、省时节能等优点。当前第1页12