一种左亚叶酸中有关物质的检测方法与流程

本发明属于化学药物检测方法
技术领域：
，具体涉及一种左亚叶酸中有关物质的检测方法。
背景技术：
左亚叶酸(levofolinicacid)，化学名为(-)-n-[4[[[(6s)-2-氨基-5-甲酰基-1,4,5,6,7,8-六氢-4-氧代-6-蝶啶基]甲基]氨基]苯甲酰基]-l-谷氨酸，其分子式c20h23n7o7，分子量为473.44，cas号为68538-85-2，其结构式如下：左旋亚叶酸作为抗肿瘤的解毒剂和抗巨幼细胞贫血的辅助用药，其剂量是亚叶酸的1/2，左旋亚叶酸不需要被二氢叶酸还原酶还原即可参加利用叶酸盐作为一碳单位来源的反应，且左旋亚叶酸可以主动或被动地通过细胞膜；左旋亚叶酸基本作用和叶酸相同，但效果优于叶酸，同时左旋亚叶酸也具有刺激白细胞生长成熟的作用，能改善巨幼细胞性贫血。目前国内以其主要成分上市的产品有注射用亚叶酸钠，注射用亚叶酸钙和亚叶酸钙注射液，国外上市的产品有美国惠氏公司上市的亚叶酸钙注射液和左亚叶酸钙注射液，德国medac公司上市亚叶酸钠注射液和左亚叶酸钠注射液。为了保证药物的安全有效，需要对药物中的有关物质进行研究、检测和监控。有关物质主要为工艺副产物及降解产物，药品在放置过程中，杂质谱在发生变化，因此需要根据不同的合成路线和生产工艺、贮藏条件建立合适的检测方法，达到对左亚叶酸有关物质准确、有效的检测和监控。技术实现要素：本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种左亚叶酸中有关物质的检测方法。本发明的技术方案如下：一种左亚叶酸中有关物质的检测方法，该检测方法包括采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶；采用流动相a和流动相b为混合流动相进行梯度洗脱；所述流动相a采用包含四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液；所述流动相b采用甲醇；溶解样品的溶剂采用包含流动相a、流动相b和二甲亚砜的混合溶剂。本发明的梯度洗脱包括以下步骤：(1)在0-20分钟内，以流动相a和流动相b的体积比为86～80:14～20进行等度洗脱；(2)在20-35分钟内，流动相a和流动相b的体积比从86～80:14～20匀速渐变至70:30；(3)在35-45分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持70:30不变。本发明采用包含流动相a、流动相b和二甲亚砜的混合溶剂来溶解样品，在其他条件配合下，检测出的杂质多，能快速、有效、准确监控左亚叶酸中的有关物质。本发明优选混合溶剂中流动相a、流动相b和二甲亚砜的体积比为86～80:14～20:100，在实施例中具体流动相a、流动相b和二甲亚砜的体积比为86:14:100。本发明中提到的流动相a的制备可包括以下步骤：将浓度为5-15％四丁基氢氧化铵溶液、磷酸氢二钠和水配制成溶液，再用磷酸调节ph值至7.6-7.9，即得。在一种优选方案中，本发明中提到的流动相a的制备包括以下步骤：将浓度为10％四丁基氢氧化铵溶液8.0ml、磷酸氢二钠2.2g和水配制780ml溶液，再用磷酸调节ph值至7.8，即得。本发明提到的高效液相色谱法的条件还包括：色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm；优选的，检测器的检测波长为280nm。本发明提供的检测方法的进样量为5-50μl。本发明提供的一种左亚叶酸中有关物质的检测方法，其中有关物质包括以下物质：本发明提供的检测方法的具体步骤为：分别配制杂质及主成分定位溶液、供试品溶液并进样，计算杂质的含量。其中，杂质及左亚叶酸定位溶液为：取杂质1、2、3、4、6、7、8和左亚叶酸样品适量，用溶剂(流动相a-流动相b-二甲亚砜＝86:14:100)溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质4μg和左亚叶酸0.5mg的溶液，作为杂质及左亚叶酸定位溶液。供试品溶液为：取左亚叶酸供试品约25mg，精密称定后，置50ml量瓶中，加溶剂(流动相a-流动相b-二甲亚砜＝86:14:100)溶解并定容，摇匀，作为供试品溶液。本发明通过筛选合适流动相并优化流动相中各组分比例，以及筛选合适的其他色谱条件，对左亚叶酸以及所述7个杂质进行色谱检测，确定了本发明检测方法，通过对各杂质和左亚叶酸的峰定位试验，干扰性试验和左亚叶酸的降解试验对本发明进行专属性验证。采用本发明的技术方案，优势如下:本发明提供的左亚叶酸中有关物质的检测方法，对各研究杂质均能有效分离，检测出的杂质多，能快速、有效、准确监控左亚叶酸中的有关物质。附图说明图1是杂质1、2、3、4、6、7、8及左亚叶酸定位高效液相色谱图；图2是实施例1的左亚叶酸有关物质高效液相色谱图；图3是实施例2的左亚叶酸有关物质高效液相色谱图；图4是对比例1的左亚叶酸有关物质高效液相色谱图；图5是对比例2的左亚叶酸有关物质高效液相色谱图；图6是对比例3的左亚叶酸有关物质高效液相色谱图。具体实施方式通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。实施例1高效液相色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6×250mm，5μm)，以含四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液(取10％四丁基氢氧化铵溶液8.0ml和磷酸氢二钠2.2g，加水溶解使成780ml，并用磷酸调节ph值至7.8)为流动相a，以甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为280nm。梯度洗脱过程为：0-20分钟内，流动相a和流动相b的体积比从86:14等度洗脱；20-35分钟内，流动相a和流动相b的体积比从86:14匀速渐变至70:30；35-45分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持70:30不变。样品配制：取左亚叶酸供试品适量，加溶剂(流动相a-流动相b-二甲亚砜＝86:14:100)使溶解制成每1ml中约含0.5mg左亚叶酸的溶液，作为供试品溶液。试验操作：取供试品溶液20μl进样，记录色谱图。典型色谱图见图2。取左亚叶酸配制供试品溶液，进样并记录图谱，按杂质对照品外标法计算杂质4的含量，以主成分自身对照法计算供试品中其他杂质的含量，结果见表1和图2。表1左亚叶酸中各杂质的含量测定结果由表1和图2可以看出，左亚叶酸供试品中杂质2、5均未检出，最大单杂为0.44％，总杂为0.65％。本发明通过筛选合适流动相并优化流动相中各组分比例，以及筛选合适的溶剂，对左亚叶酸以及7个杂质进行色谱检测，确定了本发明实施例1的检测方法。通过对各杂质和左亚叶酸的峰定位试验，干扰性试验和左亚叶酸的降解试验对本发明进行专属性验证。杂质及左亚叶酸定位溶液的配制：取杂质1、2、3、4、6、7、8和左亚叶酸样品适量，用溶剂(流动相a-流动相b-二甲亚砜＝86:14:100)溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质4μg和左亚叶酸0.5mg的溶液，作为杂质及左亚叶酸定位溶液。取杂质及左亚叶酸定位溶液，按本例的高效液相色谱条件和方法进行检测，结果见表1和图1。表2专属性验证结果由表2和图1可以看出，各杂质峰之间、左亚叶酸主峰及其相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，峰纯度均较好，本发明的专属性好。表3左亚叶酸和各杂质的检测限、定量限、线性试验结果由表3可以看出，本发明左亚叶酸和各杂质检测灵敏度均较高，其检测限和定量限均较小，并且各杂质在较低浓度范围内线性关系良好。本发明人配制供试品溶液，分别于配制后的0h、1h、2h和4h进样检测，杂质3、4、6、7、8均有检出，在室温下，左亚叶酸样品在1h内，杂质6峰面积显著增大，杂质8峰面积减小，说明样品溶液不稳定，需临用现配。表4各杂质的回收率验证结果试验回收率90-108％回收率rsd≤5.0％杂质194.3-102.1％3.08杂质2101.1-103.6％0.80杂质398.7-103.6％1.29杂质495.7-103.7％2.24杂质697.2-105.9％3.07杂质794.6-103.8％3.37由表4可以看出，本发明的回收率试验结果符合要求，本发明回收率高。实施例2高效液相色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6×250mm，5μm)，以含四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液(取10％四丁基氢氧化铵溶液8.0ml和磷酸氢二钠2.2g，加水溶解使成780ml，并用磷酸调节ph值至7.8)为流动相a，以甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为280nm。梯度洗脱过程为：0-20分钟内，流动相a和流动相b的体积比从84:16等度洗脱；20-35分钟内，流动相a和流动相b的体积比从84:16匀速渐变至70:30；35-45分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持70:30不变。样品配制：取左亚叶酸供试品适量，加溶剂(流动相a-流动相b-二甲亚砜＝86:14:100)使溶解制成每1ml中约含0.5mg左亚叶酸的溶液，作为供试品溶液。试验操作：取供试品溶液20μl进样，记录色谱图。典型色谱图见图3。对比例1高效液相色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6×250mm，5μm)，以含四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液(取10％四丁基氢氧化铵溶液8.0ml和磷酸氢二钠2.2g，加水溶解使成780ml，并用磷酸调节ph值至7.8)：甲醇(78:22)为流动相，图谱保留至3倍保留时间。检测波长为280nm，柱温：40℃，流速：1.0ml/min，进样量：20μl。样品配制：取左亚叶酸供试品适量，加流动相使溶解制成每1ml中约含0.5mg左亚叶酸的溶液，作为供试品溶液。试验操作：取混合溶液20μl进样，记录色谱图。典型色谱图见图4。对比例1的检测方法存在的问题：杂质7与主峰不能完全分离，且杂质3出峰时间较晚。对比例2高效液相色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6×250mm，5μm)，以含四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液(取10％四丁基氢氧化铵溶液8.0ml和磷酸氢二钠2.2g，加水溶解使成780ml，并用磷酸调节ph值至7.8)为流动相a，以甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为280nm。梯度洗脱过程为：0-25分钟内，流动相a和流动相b的体积比从80:20等度洗脱；25-35分钟内，流动相a和流动相b的体积比从80:20匀速渐变至70:30；35-45分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持70:30不变。样品配制：取左亚叶酸供试品适量，加溶剂[流动相a-流动相b(80:20)]使溶解制成每1ml中约含0.5mg左亚叶酸的溶液，作为供试品溶液。试验操作：取供试品溶液20μl进样，记录色谱图。典型色谱图见图5。对比例2的检测方法存在的问题：杂质间无法达到基线分离，基线漂移。对比例3高效液相色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6×250mm，5μm)，以含四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液(取10％四丁基氢氧化铵溶液8.0ml和磷酸氢二钠2.2g，加水溶解使成780ml，并用磷酸调节ph值至7.8)为流动相a，以甲醇为流动相b，进行梯度洗脱，检测波长为280nm。梯度洗脱过程为：0-20分钟内，流动相a和流动相b的体积比从84:16等度洗脱；20-35分钟内，流动相a和流动相b的体积比从84:16匀速渐变至70:30；35-45分钟内，流动相a和流动相b的体积比保持70:30不变。样品配制：取左亚叶酸供试品适量，加溶剂[流动相a-流动相b(84:16)]使溶解制成每1ml中约含0.5mg左亚叶酸的溶液，作为供试品溶液。试验操作：取供试品溶液20μl进样，记录色谱图。典型色谱图见图6。对比例3的检测方法存在的问题：杂质1和杂质8均可达到基线分离(r>1.5)，但杂质8峰对称度较差。本发明检测出的杂质多，能快速、有效、准确监控左亚叶酸中的有关物质；本发明具有良好的专属性、各杂质之间、左亚叶酸及其相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，杂质和主峰可以有效分离；本发明极性较小的杂质，通过采用梯度洗脱程序，提高了检测限、定量限，本发明的灵敏度高；回收率高，可以准确测量左亚叶酸中的有关物质；本发明可以准确累积数据，观察稳定性考察中各杂质的转换趋势。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明保护范围之内。当前第1页12