共轭有机微孔材料修饰电极的制备及作为过氧亚硝基阴离子电化学传感器的应用的制作方法

本发明涉及一种过氧亚硝基阴离子电化学传感器的制备，尤其是共轭有机微孔材料（cmp）修饰电极的制备方法；本发明同时涉及共轭有机微孔材料（cmp）修饰电极的在检测溶液中过氧亚硝基阴离子（onoo^-）的应用。

背景技术：

过氧亚硝基阴离子（peroxynitriteanion，onoo^-）作为最重要且最活跃的活性氮（rns）之一，在活的有机体中是由两种自由基（一氧化氮和氧自由基）迅速结合生成的。onoo^-及其派生的中间体参与了生物体内大多数氧化和硝化反应，是导致细胞损伤、能量耗竭和细胞死亡的重要因素，也是no产生病理损伤作用的重要环节。因此，生物体内onoo^-的精确检测和量化已成为疾病初期临床诊断的关键，并引起广泛关注。与此同时，由于体内的onoo^-寿命短、活性高、浓度低，因此，建立高效、可靠的定性定量检测方法仍是一个难题。据已有的报道，紫外可见分光光度法、免疫组织化学法、高效液相色谱法等都已用于onoo^-的检测。虽然这些方法的接受度很高，但是由于它们需要复杂的预处理、缺乏必需的特异性、耗时且成本高，所以无法做到生物体内的实时监测。

电化学提供了关于重要生物物种的直接、在线和实时的测量，它是一种灵敏、简便的生化分析方法。因此，研制灵敏、便捷的onoo^-电化学传感器就显得尤为重要。自2007年首次报道以来，作为一种由共轭单元构建的三维聚合物网络骨架，共轭有机微孔材料或共轭微孔聚合物（conjugatedmicroporouspolymer,cmp）展现了优异的多孔性、稳定的骨架结构以及多样化的功能，显示了在众多领域的应用价值和广阔前景。据报道，通过调控形貌可以改进共轭有机微孔材料的性能，共轭有机微孔材料（cmp）有更好的电子传导能力，在除吸附分离等以外的光电、传感、催化等能源环境、生物医药等相关的领域中有潜在的应用价值。然而，目前有关共轭有机微孔材料用于传感器的报道很少，尤其是未见用于过氧亚硝基阴离子传感器的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种共轭有机微孔材料修饰电极的制备方法；

本发明同时还涉及该修饰电极作为过氧亚硝基阴离子电化学传感器的应用。

一、共轭有机微孔材料（cmp）的制备

本发明共轭有机微孔材料的制备方法，是在避光条件下，将三乙胺和甲苯的混合溶液（三乙胺与甲苯的体积比为1:1~1:9）作为溶剂加入反反应器中，磁力搅拌均匀后，在n2保护下依次加入反应物：1,3,5-三乙炔苯与2-氨基-3,5-二溴吡啶（两者的摩尔比为1:1~1:7）；再加入催化剂碘化亚铜和四三苯基磷钯（碘化亚铜和四三苯基磷钯的用量分别为反应物总摩尔量的0.01~0.08倍、0.01~0.06倍），搅拌均匀后置于油浴锅中，缓慢升温至60~90℃，反应50~100h；冷却至室温，所得聚合物依次用三氯甲烷、水、丙酮、甲醇洗涤，最后在甲醇中进行索式提取24~96h，最终产物经干燥，研磨，得共轭有机微孔材料cmp。

二、共轭有机微孔材料cmp的结构表征

图1a为共轭有机微孔材料cmp的sem图。从图1a可以看到，该材料呈管状，表面较为光滑，管直径约为0.4~2μm。

图1b为cmp的tem图。图b表明，该材料为中空的管套管结构，管壁的厚度在10nm~30nm的范围之间。内层管的管内径在80~120nm之间，外层管的管内径在200~400nm之间。

图1c为共轭有机微孔材料的edx图。图1c显示出c、n、o和br的强峰，表明共轭有机微孔材料成功制得（sem是在铜网上进行，故存在cu的峰）。

图2为共轭有机微孔材料（cmp）的氮气吸脱附图（bet）。从图2可以看出，它属于type型曲线，但是也具有type型曲线的一些特征，其在p/p0=0.4~0.8之间有一回滞环，说明材料中同时存在微孔和介孔。它的比表面积为319.115m²/g。插图为内部孔径分布图，表明大多数孔径在2nm左右。

三、修饰电极材料的制备和性能

1、修饰电极材料的制备

将上述制备的共轭有机微孔材料cmp分散于乙醇和水的混合溶液（乙醇的体积百分数为20~80%）中配成浓度为0.2~1.0mg/ml的分散液，并滴涂在经处理的裸玻碳电极上，室温干燥，制得修饰电极cmp/gce，共轭有机微孔材料cmp涂层的厚度为200~1200nm。

2、修饰电极材料的性能

图3为裸电极gce（a）、修饰电极cmp/gce（b）在不含（a）和含有（b）8.76×10^-6m的onoo^-的0.2mpbs（ph=7.0）中的循环伏安曲线，扫速为50mv/s。由图3可见，两种不同的修饰电极中每一条b曲线都比对应的a曲线电流响应高，这说明onoo^-在两种电极上均能产生电化学信号。相比较而言，onoo^-在cmp/gce（图3bb曲线）上的电化学响应信号明显高于裸gce（图3ab曲线），说明该共轭有机微孔材料对onoo^-的氧化具有显著的促进作用。

图4为cmp/gce在含有不同浓度onoo^-的0.2mpbs（ph7.0）中的计时电流图，插图为相应的线性关系图。由图4可以发现，电流响应会随onoo^-浓度的增加而不断增大。由插图可知，当onoo^-浓度在4.62×10^-9~9.51×10^-5m范围内时，响应电流ip与onoo^-浓度的对数呈良好的线性关系，其线性回归方程为：ip(μa)=-0.0622[onoo^-]-0.1065，r²=0.9994。由此可知，onoo^-检测的线性范围为4.62×10^-9~9.51×10^-5m，检测限为1.54×10^-9m。

图5为修饰电极cmp/gce在不同条件下的计时电流曲线图。（a）pbs缓冲溶液中加入3×10^-6mo2^•−；（b）含3mm抗坏血酸（aa）的pbs溶液中加入3×10^-6monoo^-；（c）含3mm褪黑色素（melatonin）的pbs溶液中加入3×10^-6monoo^-；（d）含3mm还原型谷胱甘肽（gsh）的pbs溶液中加入3×10^-6monoo^-，工作电位为1.0v。曲线（a）显示，将3×10^-6monoo^-加入pbs溶液中，电流响应迅速增大。然而，当在pbs溶液先加入不同的抗氧化剂（抗坏血酸，退黑色素，还原型谷胱甘肽），然后再加入3×10^-6monoo^-，发现电流响应明显降低，如曲线b，c，d所示。结果说明这三种抗氧化剂均有好的清除onoo^-的能力。相比较而言，药物抗氧化剂还原型谷胱甘肽（d曲线）清除onoo^-的能力最好。因此，该修饰电极cmp/gce可用于电化学检测药物抗氧化剂清除过氧亚硝基阴离子的能力。

综上所述，本发明相比现有技术具有以下优点：

1、本发明利用共轭有机微孔材料构建了一种基于cmp的onoo^-传感器，该传感器具有检测范围宽、检测限低、检测过程简单、灵敏度高。此外，其制备工艺简单，成本低廉，易操作，可长期使用。

2、本发明制备的修饰电极对onoo^-有灵敏的电化学响应，抗干扰性能强、稳定性和重现性好，可进行实时检测；

3、本发明制备的修饰电极用于药物抗氧化剂清除onoo^-能力的电化学检测中，得出满意结果，表明该修饰电极在生物传感器中有很好的应用前景，并有望应用于药物性能的检测。

附图说明

图1为本发明修饰电极表面材料的透射电镜图（sem）、透射电镜图（tem）和能量色散x射线图（edx）。

图2为共轭有机微孔材料的氮气吸脱附图（bet），插图为其粒径分布图。

图3为不同修饰电极在不含（a）和含有（b）8.76×10^-6monoo^-的0.2mpbs(ph=7.0)中的循环伏安曲线。

图4为cmp/gce对不同浓度的onoo^-检测的计时电流图及onoo^-的浓度与其电流响应之间的线性关系图（插图）。

图5为在不含或含有不同抗氧化剂的pbs缓冲溶液中，cmp/gce对onoo^-的计时电流曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明修饰电极cmp/gce的制备和应用作进一步说明。

1、共轭有机微孔材料cmp的制备：取三乙胺4ml、甲苯4ml，依次加入50ml的三口瓶，室温下磁力搅拌，然后在n2保护下依次加入1,3,5-三乙炔苯（0.25mol），2-氨基-3,5-二溴吡啶（0.051mol），碘化亚铜（0.0088mol），四三苯基磷钯（0.0015mol），搅拌均匀后置于油浴锅中，缓慢升温至80℃反应72h，整个反应过程在避光下进行。反应结束后冷却至室温，所得聚合物依次用三氯甲烷，水，丙酮，甲醇洗涤，然后在甲醇中进行索式提取72h，最终产物经干燥，研磨，得共轭有机微孔材料cmp；

2、修饰电极cmp/gce的制备

（1）玻碳电极的预处理：将玻碳电极依次用0.30μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95%的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后，得到处理后的玻碳电极；然后以玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系，在含有1.0mm铁氰化钾探针分子的0.1m氯化钾电解质溶液中，进行循环伏安扫描（扫速为50mv/s），最后将电极取出并用二次蒸馏水冲洗并吹干；

（2）修饰电极cmp/gce的制备：取实施例1制备的共轭有机微孔材料cmp0.002g，分散于2ml乙醇和水的混合溶液中（乙醇1ml，水1ml），配成浓度为1.0mg·ml^-1的分散液，并滴涂在上述经处理的裸玻碳电极上，室温干燥，制得修饰电极cmp/gce。

3、修饰电极cmp/gce用于检测药物抗氧化剂清除onoo^-的能力

在含有药物抗氧化剂的pbs溶液中加入3×10^-6monoo^-，以共轭有机微孔材料修饰电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极组成的三电极体系中，工作电位为1.0v用计时电流法进行检测；得到药物抗氧化剂清除过氧亚硝基阴离子后的电流响应的计时电流，电流响应的计时电流降低的越多，药物抗氧化剂清除onoo^-的能力越强。

本发明实施过程中所使用的仪器和药品：

chi660c电化学工作站（上海辰华仪器公司）用于进行循环伏安、计时电流的实验，石英管加热式自动双重纯水蒸馏器（1810b，上海亚太技术玻璃公司）用于蒸超纯水。电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司），用于称量药品。超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。三氧化二铝打磨粉（上海辰华仪器试剂公司）用于处理玻碳电极。饱和甘汞参比电极、铂对电极、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（西安化学试剂厂）；1,3,5-三乙炔苯（河北百灵威精细材料有限公司）；三乙胺（天津市化学试剂三厂），甲苯、三氯甲烷（北京化工厂）；碘化亚铜（上海中秦化学试剂有限公司）；四三苯基磷钯、2-氨基-3,5-二溴吡啶（萨恩化学技术（上海）有限公司）；丙酮、甲醇（利安隆博华（天津）医药化学有限公司）。